專利名稱：一種高活性的人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白及其活性檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種高活性的人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白及其活性檢測方法屬于蛋白質(zhì)藥物領(lǐng)域
背景技術(shù)：
骨質(zhì)疏松癥是一種常見的骨代謝疾病，表現(xiàn)為骨吸收超過了骨形成，從而導(dǎo)致骨量減少，骨脆性增加。骨質(zhì)疏松癥在絕經(jīng)婦女中占有較大比例，而隨著世界人口老齡化的日益嚴(yán)峻，尋找新的更有效的骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療藥物顯得尤其重要。目前，骨質(zhì)疏松癥的臨床治療用藥主有兩類，分別為骨吸收抑制劑和骨形成促進(jìn)劑。 人甲狀旁腺激素(PTH)目前被認(rèn)為是唯一能促骨合成代謝的藥物，其優(yōu)于其它骨質(zhì)疏松藥物的特點(diǎn)在于可以重建骨小梁系統(tǒng)。研究表明小劑量PTH即有明顯成骨作用，其作用可能是通過調(diào)節(jié)骨代謝和調(diào)節(jié)腎小管對鈣和磷酸鹽的再吸收來實(shí)現(xiàn)的。2002年FDA批準(zhǔn)特立帕肽(rhPTH(l_34))上市，主要用于治療絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松癥。另一個(gè)甲狀旁腺激素藥物rhPTH(l-84)也于2006年上市。國內(nèi)對PTH研究起步較晚，現(xiàn)進(jìn)入到臨床研究階段的PTH藥物有注射用重組人甲狀旁腺激素(1-34)，而研究熱點(diǎn)集中在PTH融合蛋白以及PTH的各種突變體上。對蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行單個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換，可能會(huì)使得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并產(chǎn)生一系列物理和生化性質(zhì)(溶解度、穩(wěn)定性、對底物和受體的親和力等)的改變。因此對天然人甲狀旁腺激素(1-34)進(jìn)行氨基酸的置換，有希望得到生理活性更強(qiáng)，副作用更小的骨質(zhì)疏松治療藥物。本發(fā)明建立起的活性測定方法可以快速穩(wěn)定地檢測人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白的體外活性，涉及到的技術(shù)包括熒光實(shí)時(shí)定量PCR，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共培養(yǎng)等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)內(nèi)容是通過不同物種同源序列比對和初步的計(jì)算機(jī)模擬分子對接，對天然的人甲狀旁腺激素(1-34)的三個(gè)氨基酸R25K26K27進(jìn)行Q25E26L27的置換，并委托吉爾生化(上海)有限公司進(jìn)行多肽的全合成，多肽純度為95%以上。本發(fā)明的另一個(gè)內(nèi)容是建立了一種能快速穩(wěn)定的檢測突變蛋白活性的方法。甲狀旁腺激素(PTH)是由甲狀旁腺主細(xì)胞分泌的含84個(gè)氨基酸殘基的單鏈多肽激素，是生物體內(nèi)調(diào)節(jié)鈣、磷代謝最為重要的肽類激素之一。甲狀旁腺激素氨基端1-34片段具有全分子PTH與受體結(jié)合的能力及生物活性，因此被廣泛用于研究PTH的結(jié)構(gòu)與功能。對PTH及其類似物的作用機(jī)理及活性研究始于上世紀(jì)80年代。目前已知PTH可以通過與基質(zhì)/成骨細(xì)胞上的G蛋白偶聯(lián)受體-甲狀旁腺激素/甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白受體I (PTHRl)結(jié)合，刺激這些細(xì)胞表達(dá)M-CSF和NF k B-Iigand(RANKL)。研究表明上述基因缺失的小鼠會(huì)喪失形成破骨細(xì)胞的能力，而體外培養(yǎng)時(shí)，即使沒有基質(zhì)/成骨細(xì)胞存在，上述兩種蛋白也能刺激破骨細(xì)胞的形成。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證明，破骨細(xì)胞的形成與RANKL基因的表達(dá)成正比，而與M-CSF沒有明顯的正比關(guān)系。RANKL可通過與造血前體破骨細(xì)胞上的RANK受體結(jié)合，刺激其分化成為成熟的破骨細(xì)胞。當(dāng)RANKL發(fā)揮作用時(shí)，一種可溶性的誘鉺受體-骨保護(hù)素(OPG)會(huì)阻礙其發(fā)揮作用。許多研究表明PTH作用于原代培養(yǎng)的基質(zhì)/成骨細(xì)胞或大鼠時(shí)，它能持續(xù)的刺激RANKL基因的表達(dá)而抑制OPG基因的表達(dá)。因此，PTH發(fā)揮作用時(shí)很有可能是通過凋節(jié)RANKL/0PG的比例來影響破骨細(xì)胞的形成。磷酸酶是一種可以水解脂肪族和芳香族磷酸酯，從而釋放出磷酸鹽的酶。磷酸酶根據(jù)其發(fā)揮作用時(shí)所需pH又可以分為酸性磷酸酶和堿性磷酸酶。酸性磷酸酶存在于各種細(xì)胞和組織中，如前列腺、肝、腎、脾、紅細(xì)胞、血小板和破骨細(xì)胞。1959年，Burstone報(bào)道，破骨細(xì)胞能顯示出強(qiáng)烈的酸性磷酸酶活性，而成骨細(xì)胞則顯示出堿性磷酸酶活性。之后的很多報(bào)告顯示破骨細(xì)胞在酒石酸存在的情況下仍能表現(xiàn)出酸性磷酸酶的活性。因此抗酒石酸酸性磷酸酶(TARCP)現(xiàn)在作為一個(gè)破骨細(xì)胞的標(biāo)志物被廣泛運(yùn)用于破骨細(xì)胞的鑒定和分析。PTH可以通過與基質(zhì)/成骨細(xì)胞上的G蛋白偶聯(lián)受體-甲狀旁腺激素/甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白受體I (PTHRl)結(jié)合，刺激這些細(xì)胞表達(dá)NF K B-Iigand (RANKL)，RANKL可通過與造血前體破骨細(xì)胞上的RANK受體結(jié)合，刺激其分化成為成熟的破骨細(xì)胞。而破骨細(xì)胞能表 現(xiàn)出抗酒石酸酸性磷酸酶(TARCP)活性而被染色，因此通過染色結(jié)果能間接說明PTH刺激破骨細(xì)胞的分化和成熟的能力。本發(fā)明建立的人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白的體外活性檢測方法，可以在3-10天內(nèi)對一種或多種蛋白質(zhì)或多肽類藥物進(jìn)行活性檢測，并與人甲狀旁腺激素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，是一種快速穩(wěn)定的檢測活性檢測方法。


圖I :熒光定量PCR儀檢測實(shí)時(shí)熒光情況圖2 PTH (1-34)-(RKK-QEL)對 UAMS-32P 細(xì)胞 RANKL/0PG 基因轉(zhuǎn)錄的影響X 軸代表組別 vehicle 組、PTH (1-34)陽性對照組、PTH (1-34)-(RKK-QEL)組、小肽(LQDVHNF)組人血清白蛋白(HSA)組。Y軸表示mRNA相對表達(dá)量(相對于Rps27基因)圖3 :破骨細(xì)胞形成實(shí)驗(yàn)(TRACP染色)I vehicle組(每組3個(gè)復(fù)孔)、2 :PTH(1_34)陽性對照組、3 :PTH(1-34)-(RKK-QEL)組、4 :小肽(LQDVHNF)組、5 :HSA 組圖4 :破骨細(xì)胞形成實(shí)驗(yàn)(鏡下紅色細(xì)胞數(shù))X 軸代表組別vehicle 組、PTH(1_34)陽性對照組、HSA 組、PTH(1-34)-(RKK-QEL)組、小肽(LQDVHNF)組。Y軸表示每組平均每孔紅色細(xì)胞數(shù)(每組3個(gè)復(fù)孔)圖5 =PTH (1-34)-(RKK-QEL)對原代培養(yǎng)的小鼠股骨骨髓貼壁細(xì)胞RANKL/0PG基因轉(zhuǎn)錄的影響X 軸代表組別vehicle 組、PTH(1_34)陽性對照組、HSA 組、PTH(1-34)-(RKK-QEL)組、小肽(LQDVHNF)組。Y軸表示mRNA相對表達(dá)量(相對于Rps27基因)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :PTH(1-34)-(RKK-QEL)和小肽(氨基酸序列LQDVHNF)委托吉爾生化(上海)有限公司合成，純度>95% ;實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)對照人甲狀旁腺激素(1-34)購自sigma公司；人血清白蛋白(HSA)由實(shí)驗(yàn)室自行制備并純化，宿主菌為畢赤酵母GS115，純度> 90%。實(shí)施例2 =PTH (1-34)-(RKK-QEL)對 UAMS-32P 細(xì)胞 RANKL/0PG 基因轉(zhuǎn)錄的影響(I)細(xì)胞系與培養(yǎng)條件
細(xì)胞系UAMS_32P細(xì)胞(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PTHR1)培養(yǎng)基a -MEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清培養(yǎng)條件組織培養(yǎng)箱37 °C，5 % CO2細(xì)胞長至80%左右匯合時(shí)分瓶傳代，再長至80%左右匯合時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(2)UAMS_32P細(xì)胞的鋪板培養(yǎng)與加藥6孔板按IO5/孔細(xì)胞鋪板，生長至80%左右匯合時(shí)換液，換液后6h加藥藥物劑量給藥組均按l(T7mol/L加藥組別vehicle組PTH(1-34)陽性對照組PTH (1-34)-(RKK-QEL)組小肽(LQDVHNF)組HSA 組(3) UAMS-32P 細(xì)胞總 mRNA 的提取細(xì)胞加藥培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)基，按試劑盒說明提取總RNA (Takara)。取部分RNA樣品用紫外分光光度計(jì)于260和280nm處測定OD值，評價(jià)RNA純度并進(jìn)行定量。(4)反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈控制每組等量RNA (1-1. 5 ii g)，反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈。反轉(zhuǎn)錄采用20 ii L體系，體
系如下
5 X PT-Master Mix 4u L RNA1.5 u g
DEPC水補(bǔ)至20 u L
37°C 反應(yīng) 30-60min以上述反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，將模板進(jìn)行適當(dāng)稀釋，用于實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR。(5)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測RANKL和OPG的mRNA轉(zhuǎn)錄水平實(shí)驗(yàn)設(shè)vehicle 組，PTH(1-34)陽性對照組，HSA 組，PTH(1-34) (RKK-QEL)組和小肽(LQDVNFH)組。每組分別檢測Rps27，RANKL, OPG基因的轉(zhuǎn)錄情況，每組每個(gè)基因設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。3 步法 PCR :50°C，2min ；95°C, IOmin ;95°C，15s，60°C，Imin ;40 個(gè)循環(huán)。熒光定量
PCR儀檢測實(shí)時(shí)熒光情況。
實(shí)施例3 PTH(1-34)-(RKK-QEL)在體外成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系中的活性檢測/破骨細(xì)胞形成實(shí)驗(yàn)(TRACP染色法)Dayl (I)小鼠股骨骨髓細(xì)胞的獲得和培養(yǎng)在無菌條件下，取出3-6周小鼠股骨，并沖洗骨髓腔，離心收集洗下的骨髓細(xì)胞。培養(yǎng)基重懸骨髓細(xì)胞，用直徑為IOcm的培養(yǎng)皿在在37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)2d。(2)UAMS-32P細(xì)胞(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PTHR1)長至80%左右匯合時(shí)，對細(xì)胞進(jìn)行消化。細(xì)胞按2000/孔鋪24孔板，37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)2d。
Day3 小鼠股骨骨髓懸浮細(xì)胞與UAMS-32P細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立(I)收集培養(yǎng)皿中的骨髓細(xì)胞培養(yǎng)液上清，合并上清液并離心收集細(xì)胞。用一定體積的培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行重懸，血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。(2)吸去Dayl鋪板的UAMS-32P細(xì)胞的培養(yǎng)液上清，將上述小鼠股骨骨髓懸浮細(xì)胞按16X IO4/孔鋪板，用培養(yǎng)基補(bǔ)至培養(yǎng)體積為lmL。加藥后37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)vehicle 組，PTH(1-34)陽性組，HSA 組，PTH(1-34) (RKK-QEL)組和小肽(LQDVNFH)組。每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。給藥濃度為10-7mol/L。Day5 對24孔板中的細(xì)胞進(jìn)行半換液，吸去0. 5mL培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基補(bǔ)足ImL并補(bǔ)足藥物以維持藥物濃度為10_7mol/L。Day7 重復(fù)第五天的操作，對細(xì)胞進(jìn)行半換液。Day9 吸去24孔板的細(xì)胞培養(yǎng)液，并用PBS輕柔的洗一次。對貼壁細(xì)胞進(jìn)行TRACP (耐酒石酸酸性磷酸酶)染色(TRACP/ALP染色試劑盒購自Takara),具體步驟如下24孔板每孔添加250 ii L Fixation solution固定細(xì)胞，室溫放置5min。每孔加2mL無菌水稀釋固定液后移去，再每孔添加2mL無菌水清洗一次，移去液體。配制好含10%酒石酸的ACP (酸性磷酸酶)底物溶液，24孔板每孔添加250 ii L，蓋上板蓋于37°C孵育15-45min。移去上清液，用無菌水洗3次以終止顯色。顯微鏡下計(jì)算每孔中被染成紫紅色的細(xì)胞數(shù)(見附圖4)，并拍照(見附圖3)。
實(shí)施例4 =PTH (1-34) - (RKK-QEL)對原代培養(yǎng)的小鼠股骨骨髓貼壁細(xì)胞RANKL/0PG基因轉(zhuǎn)錄的影響將實(shí)施例3中Day3中培養(yǎng)皿內(nèi)的貼壁細(xì)胞消化，用培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后進(jìn)行計(jì)數(shù)。按實(shí)施例2中⑵、(3)、(4)、(5)步中的操作，檢測PTH(1-34)-(RKK-QEL)對原代培養(yǎng)的小鼠股骨骨髓貼壁細(xì)胞RANKL/0PG基因轉(zhuǎn)錄的影響。
權(quán)利要求
1.天然人甲狀旁腺激素(1-34)的氨基酸序列為SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF。
2.權(quán)利要求人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白為對天然人甲狀旁腺激素(1-34)的R25K26K27進(jìn)行了突變的蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白為天然人甲狀旁腺激素(1-34)的R25突變?yōu)镼，K26突變?yōu)镼或E，K27突變?yōu)镋或L的蛋白，其中較為優(yōu)選的是R25突變?yōu)镼，K26突變?yōu)镋，K27突變?yōu)長。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白為人工化學(xué)合成的或者重組表達(dá)的蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)為以大腸桿菌為代表的原核表達(dá)系統(tǒng)或以酵母為代表的真核表達(dá)系統(tǒng)以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白的體外活性檢測方法采用的細(xì)胞為原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞或骨髓細(xì)胞、成骨細(xì)胞系或成骨細(xì)胞株。
7.權(quán)利要求6中原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞或骨髓細(xì)胞來源為小鼠，較為優(yōu)選的是小鼠股骨骨髓細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求6中的成骨細(xì)胞系或成骨細(xì)胞株，其特征是轉(zhuǎn)染了PTH I型受體的細(xì)胞，較為優(yōu)選的為UAMS-32P細(xì)胞系。
9.權(quán)利要求3所述的人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白活性檢測的指標(biāo)為UAMS-32P細(xì)胞特定基因mRNA的相對表達(dá)量以及刺激小鼠股骨骨髓細(xì)胞分化形成破骨細(xì)胞的能力。
10.根據(jù)權(quán)利要求8中的特定的基因，其特征是耦聯(lián)成骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化、活化與生物活性的主要細(xì)胞因子。
11.權(quán)利要求9中特定的基因,較為優(yōu)選的是護(hù)骨素(osteoprotegerin,OPG)、NF-K B受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor κ B ligand, RANKL) 2 個(gè)基因。
12.權(quán)利要求8中mRNA的相對表達(dá)量，其檢測方法為反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。其中較為優(yōu)選的是實(shí)時(shí)熒光定量PCR。
13.權(quán)利要求9中刺激小鼠股骨骨髓細(xì)胞分化形成破骨細(xì)胞的能力是通過對破骨細(xì)胞的染色來評價(jià)的，較為優(yōu)選的是耐酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)染色。
14.權(quán)利要求2和3所述的人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白在治療骨質(zhì)疏松癥藥物中運(yùn)用。
全文摘要
本發(fā)明“一種高活性人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白及其活性檢測方法”屬于蛋白質(zhì)藥物領(lǐng)域。本發(fā)明通過對天然人甲狀旁腺激素(1-34)的第25、26、27位氨基酸進(jìn)行置換，發(fā)現(xiàn)了一種高活性的人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白。本發(fā)明還建立了一種快速的穩(wěn)定的活性檢測方法，可以在3-10天內(nèi)對一種或多種蛋白質(zhì)或多肽類藥物進(jìn)行活性檢測，并與人甲狀旁腺激素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較?；钚詸z測結(jié)果顯示上述人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白的活性優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)品，因此有望成為療效更強(qiáng)，副作用更小的骨質(zhì)疏松治療藥物。
文檔編號C12Q1/68GK102775492SQ201210001319
公開日2012年11月14日 申請日期2012年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月5日
發(fā)明者付強(qiáng), 儲(chǔ)敏, 姜曰水, 朱瑞宇, 李英, 邱爽, 金堅(jiān), 陳蘊(yùn), 雷楗勇, 高明珠 申請人:江南大學(xué)