專利名稱：牙鲆模式識別受體TLR21的cDNA全長序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是牙鲆模式識別受體TLR21基因全長表達序列和所編碼的一種蛋白，以及該基因的克隆和檢測方法。
背景技術(shù)：
隨著世界范圍水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，國內(nèi)外水產(chǎn)品貿(mào)易及水產(chǎn)苗種跨區(qū)域交流日益頻繁，大大增加了水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病原傳播的機會。同時，由于現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖的集約化、高密度生產(chǎn)方式及漁業(yè)水域環(huán)境的惡化，又常會引發(fā)養(yǎng)殖動物的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致機體的免疫系統(tǒng)受到抑制。正是這些因素相互影響，出現(xiàn)了全球性的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物發(fā)病率趨于頻繁、流行程度日益廣泛、經(jīng)濟損失極為巨大的局面。運用現(xiàn)代生物技術(shù)作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的技術(shù)支撐， 掌握病害的免疫防御技術(shù)是水產(chǎn)科技急需解決的首要問題，因此，近年來國際上魚類免疫學(xué)的研究逐漸受到重視。
在人類免疫學(xué)研究的歷史舞臺上，細胞免疫和體液免疫一直是兩個主角。相比之下，固有免疫的研究由于缺乏對其相應(yīng)受體的系統(tǒng)認識，明顯滯后于獲得性免疫研究的進程。20世紀(jì)90年代，Janeway等有關(guān)“病原體相關(guān)分子模式”以及“模式識別受體”概念的提出，標(biāo)志著固有免疫研究進入了一個嶄新的階段。魚類雖是低等脊椎動物，但已具備免疫的基本特性，與哺乳動物一樣，其體內(nèi)也存在兩種免疫應(yīng)答類型固有免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答。而相對于哺乳動物來說，魚類的固有免疫研究才剛剛起步。
Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)家族是動物識別入侵病原體的主要 “模式識別受體”，可識別幾乎所有病原生物的一些通用結(jié)構(gòu)，是啟動固有免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。 一般認為TLR 1、2、4、5和6主要參與細菌成分的識別，而TLR3、TLR7和TLR8主要特異地針對病毒成分，TLR9對這二者均能夠識別。TLR14、21 23在某些魚類中存在，在哺乳動物中還未發(fā)現(xiàn)，有研究報道TLR21即可識別細菌成分，也可識別病毒成分。
牙鲆iParalichthys olivaceus)在我國俗稱牙片、偏口、比目魚，是我國北方海水工廠化養(yǎng)殖的主要名貴魚類品種，同時也是重要的海水增養(yǎng)殖魚類之一。牙鲆屬于鰈形目， 鲆科，牙鲆屬。牙鲆屬的魚類在南、北美洲東西岸較多，而亞洲沿岸只有牙鲆一種，主要分布于渤海、黃海、東海、南海以及朝鮮、日本、俄羅斯沿岸海區(qū)。近年來，腹水病、病毒性神經(jīng)壞死癥等各種病害的爆發(fā)和流行給生產(chǎn)企業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴重阻礙了牙鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。腹水病在牙鲆疾病中危害最為嚴重，該病從苗種到成魚均有發(fā)生，死亡率可達 50%-80%。由于目前對牙鲆免疫機理和機制的了解較少，尚無有效的免疫防治技術(shù)和治療方法。
TLRs是宿主免疫的必需分子之一，通過感知病原微生物體，識別病原相關(guān)分子模式，激活天然免疫系統(tǒng)。TLR21作為TLRs家族的成員，參與魚類免疫調(diào)節(jié)，在一定程度上反映了魚類的免疫能力，因此可以作為魚類疾病防治中免疫監(jiān)測的指標(biāo)。牙鲆模式識別受體TLR21基因結(jié)構(gòu)的闡明，有助于人們更加深入地了解TLR21的功能及其與魚類免疫應(yīng)答的關(guān)系，加深人們對魚類精細而復(fù)雜免疫應(yīng)答過程的全面認識，從而為尋找診斷、預(yù)防和治療相關(guān)魚病的新策略以及抗病育種設(shè)計、抗病性轉(zhuǎn)基因魚設(shè)計、基因疫苗的設(shè)計和疫苗的安全使用等提供重要的理論基礎(chǔ)，并在魚類疾病防治，環(huán)境監(jiān)測以及生態(tài)系統(tǒng)保護等方面發(fā)揮作用。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種牙鲆模式識別受體TLR21的cDNA序列及克隆方法。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是通過以近源物種TLR21基因的⑶S序列保守區(qū)設(shè)計兼并引物，通過RT-PCR反轉(zhuǎn)錄及擴增，結(jié)合RACE技術(shù)獲得牙鲆TLR21基因的全長表達序列。
TLR21基因CDNA全長3687 bp，含有四22 bp的開放閱讀框，編碼973個氨基酸， 其中前23個氨基酸序列為信號肽序列。TLR21基因的起始密碼子上游有五個中止密碼子 TAA,距poly (A)尾16個堿基位置存在加尾信號AATAA。結(jié)合這兩方面可以說明所得的cDNA 為TLR21基因的全長cDNA序列。TLR21基因編碼的蛋白質(zhì)，分子量為112. 7 KDa，等電點為 8. 66。
本發(fā)明進一步公開了牙鲆模式識別受體TLR21的基因序列的克隆方法，其特征是包括如下主要步驟(1)健康牙鲆經(jīng)免疫原免疫刺激后解剖分離頭腎組織由于TLR21基因為免疫相關(guān)基因，在病原感染后其表達量通常會有提高，因此在提取總RNA之前對健康牙鲆首先進行免疫刺激。選擇魚類的常見細菌感染源鰻弧菌為免疫原物，腹腔注射牙鲆體內(nèi)，免疫M h后處死解剖分離頭腎組織。
(2)總RNA的提取和純化采用Trizol法從牙鲆頭腎中提取得到牙鲆頭腎總RNA?？俁NA純化采用DNA酶消化法。
(3)中間片段的克隆測序 (3. DcDNA第一鏈的合成以純化的牙鲆頭腎總RNA作為模板，以O(shè)ligo (dT) 16為反轉(zhuǎn)錄引物，進行cDNA第一鏈合成，得到的cDNA第一鏈，作為下述PCR擴增的cDNA模板。
(3. 2) PCR 擴增由于該基因較長，所以本發(fā)明選擇將中間片段分為兩段區(qū)域分別進行擴增。以前述所得的cDNA第一鏈作為模板，利用下述兩對引物進行TLR21基因中間片段1和中間片段2的擴增正向引物 1: TLR21-F1 :5，-TATCGTTACAACMGHATYCT-3’ 反向引物 1: TLR21-R1 5'-AAGATTYCCRAAAACMTC -3' 正向引物 2 TLR21-F2 5' -AATBTGTCCTBTAACffACAT-3' 反向引物 2 : TLR21-R2 5' -GTTCCTCAAGCCTTCTCA-3'擴增得到牙鲆TLR21基因cDNA的兩個中間片段，通過克隆測序，得到兩個中間片段序本步驟中，擴增體系可優(yōu)選如下成分Sfigi模板(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)* 正向引物(20π1) ρ 反向引物βΟπΙ) — MgCl: (25 Λ) 10XPCR Buffer (with Mg Tag DNA Polymerase ( 5U/ML ) dNTPClOni)^
權(quán)利要求
1.牙鲆模式識別受體TLR21的基因序列，該TLR21基因cDNA全長3687bp，含有四22 bp的開放閱讀框，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的基因序列，其中所述的核苷酸序列對應(yīng)的氨基酸序列如SEQID NO. 2所示；該序列編碼973個氨基酸，分子量為112. 7 KDa，等電點為8. 66。
3.權(quán)利要求1所述牙鲆模式識別受體TLR21基因序列在制備作為實時熒光RT-PCR檢測牙鲆疾病防治方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種牙鲆模式識別受體TLR21的cDNA全長序列及克隆和檢測方法。該序列全長3687bp，含2922bp的開放閱讀框，編碼973個氨基酸。本發(fā)明通過以近源物種TLR21的cds序列保守區(qū)設(shè)計兼并引物，通過反轉(zhuǎn)錄及PCR擴增，結(jié)合RACE技術(shù)最終得到牙鲆TLR21的全長cDNA序列。TLRs家族是動物識別入侵病原體的主要“模式識別受體”，通過感知識別病原體的相關(guān)分子模式，激活天然免疫系統(tǒng)。本基因的獲得為研究魚類TLR21的基因表達調(diào)控機理及免疫學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，還可為魚類種群遺傳學(xué)及進化遺傳學(xué)研究提供分子水平材料。
文檔編號C12Q1/68GK102533775SQ20121000392
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者吳戀, 孫金生, 潘寶平, 耿緒云, 高虹 申請人:天津師范大學(xué)