專(zhuān)利名稱(chēng)：基于微衛(wèi)星座位多態(tài)性的中國(guó)樹(shù)鼩分子遺傳標(biāo)識(shí)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于微衛(wèi)星座位多態(tài)性的中國(guó)樹(shù)駒分子遺傳標(biāo)識(shí)方法，屬生物高技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
中國(guó)樹(shù)駒(Tupaia belangeri chinensis)，隸屬于樹(shù)鼠句目Gcandentia)，樹(shù)鼠句科 (Tupaiidae)，樹(shù)駒屬(Tupaia)動(dòng)物。形似松鼠，同時(shí)具有食蟲(chóng)目Gnsectivora)和靈長(zhǎng)類(lèi) (Primates)動(dòng)物的一些特征。樹(shù)駒吻部較長(zhǎng)，指(趾)端具爪，齒式和食性等特征與食蟲(chóng)目動(dòng)物相似，而其發(fā)達(dá)的大腦、頭骨結(jié)構(gòu)、中耳部結(jié)構(gòu)、肌群組成和腸胃道結(jié)構(gòu)等與靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物相似，因此其系統(tǒng)分類(lèi)地位一直是分類(lèi)學(xué)上爭(zhēng)論的話(huà)題。上世紀(jì)80年代，根據(jù)樹(shù)駒眾多形態(tài)系統(tǒng)發(fā)生和分子系統(tǒng)發(fā)生的研究，一些學(xué)者提出建立樹(shù)駒目，將其置于食蟲(chóng)目與靈長(zhǎng)目之間?，F(xiàn)有遺傳學(xué)證據(jù)表明樹(shù)駒和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物關(guān)系密切，是其近親。由于樹(shù)駒個(gè)體小，飼養(yǎng)繁殖周期短，成本低，且具有多種自發(fā)性疾病，在疾病和正常情況下都表現(xiàn)出諸多與靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物相似的特征，已被大量運(yùn)用于生物醫(yī)學(xué)研究，并有望在某些方面替代數(shù)量日趨減少的瀕危的非人靈長(zhǎng)類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。目前，樹(shù)駒被廣泛運(yùn)用于近視、肝炎、肝癌、抑郁癥、糖尿病和微生物感染等疾病的研究，實(shí)驗(yàn)用樹(shù)駒呈現(xiàn)了供不應(yīng)求的狀態(tài)。雖然樹(shù)駒的人工飼養(yǎng)繁殖工作早在19世紀(jì)80年初就已開(kāi)展，但到目前為止，依然沒(méi)有建立一個(gè)純的實(shí)驗(yàn)品系，且缺少一種能用于個(gè)體識(shí)別和純系評(píng)估的分子遺傳標(biāo)識(shí)系統(tǒng)。 現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中所用的樹(shù)駒大多是野外捕獲的，或者是捕獲后只經(jīng)過(guò)短期的室內(nèi)馴養(yǎng)。然而，野外生存的樹(shù)駒種群存在豐富的遺傳多樣性，這導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)所采用的樹(shù)駒的遺傳背景存在較大差異，往往研究結(jié)果出現(xiàn)巨大差異。為了更好地推進(jìn)新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樹(shù)駒的模式化和遺傳背景清晰的品系的創(chuàng)制，合理開(kāi)發(fā)利用樹(shù)駒資源，建立一套樹(shù)駒個(gè)體識(shí)別和純系評(píng)定的遺傳標(biāo)識(shí)系統(tǒng)尤為迫切。用于遺傳分析的分子標(biāo)記有多種，如限制性長(zhǎng)度片段多態(tài)(Restriction FragmentLength Polymorphism, RFLP),隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA(RandomAmplified PolymorphicDNA，RAPD)，數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)多態(tài)(Variable Number Tandem Repeat, VNTR) 和微衛(wèi)星(microsatellite)。微衛(wèi)星又稱(chēng)為簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat, SSR) 或短片段重復(fù)序列(Short Tandem R印eat，STR)，是由l_6bp的堿基作為核心重復(fù)單元，串聯(lián)重復(fù)形成的一類(lèi)DNA序列。由于微衛(wèi)星廣泛且較均勻地分布在基因組中(約30-501Λ就存在一個(gè)微衛(wèi)星DNA)，具有豐富的多態(tài)性、信息含量大、呈共顯性、符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律等特點(diǎn)，被廣泛運(yùn)用于連鎖圖譜構(gòu)建、種群遺傳多樣性分析、品種品系的選擇和建立、以及不同品系間親緣關(guān)系界定、個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定等。要評(píng)估建立的樹(shù)駒品種或品系是否遺傳背景清晰，首先需要檢測(cè)一套分子遺傳標(biāo)記。因此，本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種基于微衛(wèi)星座位多態(tài)性的中國(guó)樹(shù)駒分子遺傳標(biāo)識(shí)方法。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見(jiàn)與本發(fā)明樹(shù)駒微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記相同的公開(kāi)文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于微衛(wèi)星座位多態(tài)性的中國(guó)樹(shù)駒分子遺傳標(biāo)識(shí)方法，用于檢測(cè)樹(shù)駒種群雜合度、群體結(jié)構(gòu)、個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定。本發(fā)明以Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)下載的樹(shù)駒基因組序列為模板，搜尋微衛(wèi)星序列，用 Primerpremier 5軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增微衛(wèi)星序列的引物對(duì)。經(jīng)PCR擴(kuò)增、聚丙烯酰胺凝膠電泳，不斷優(yōu)化擴(kuò)增條件，最后得到12對(duì)具有等位基因多態(tài)性和特異性擴(kuò)增的樹(shù)駒微衛(wèi)星序列的引物。這12個(gè)樹(shù)駒微衛(wèi)星座位的擴(kuò)增引物信息、微衛(wèi)星序列的重復(fù)元件、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度范圍以及擴(kuò)增條件列于表1中?；谌詣?dòng)測(cè)序儀的DNA片段分析(GENESCAN)原理， 將每對(duì)引物的正向引物用5' -FAM標(biāo)記后，利用優(yōu)化好的擴(kuò)增條件，再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將PCR產(chǎn)物與一定量的分子內(nèi)標(biāo)混合，分別在ABI PRISM3730型或其他型號(hào)全自動(dòng)測(cè)序儀 (Applied Biosystems)上掃描檢測(cè)。具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物依據(jù)長(zhǎng)度的不同，在電泳中顯示出不同的遷移率，其帶有的FAM標(biāo)記熒光信號(hào)在電泳過(guò)程中被測(cè)序儀檢測(cè)。依據(jù)分子內(nèi)標(biāo)的條帶數(shù)與片段大小，我們利用相關(guān)軟件即能判讀出目的片段的大表1.中國(guó)樹(shù)駒12個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星座位的引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度、擴(kuò)增條件及重復(fù)元件
權(quán)利要求
1. 一種基于微衛(wèi)星座位多態(tài)性的中國(guó)樹(shù)駒分子遺傳標(biāo)識(shí)方法，其特征在于該方法的具體步驟如下A、使用酚/氯仿法或試劑盒提取法從樹(shù)駒組織或血液中提取基因組DNA；B、以步驟A提取的基因組DNA為模板，擴(kuò)增各微衛(wèi)星位點(diǎn)的各個(gè)上游引物標(biāo)記 5' -FAM，進(jìn)行PCR反應(yīng)；PCR反應(yīng)引物和擴(kuò)增條件如下
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于微衛(wèi)星座位多態(tài)性的中國(guó)樹(shù)鼩分子遺傳標(biāo)識(shí)方法，屬生物高技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將微衛(wèi)星引物標(biāo)記熒光(5′-FAM)，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使PCR產(chǎn)物帶有5′-FAM熒光標(biāo)記。將PCR產(chǎn)物與分子內(nèi)標(biāo)混合，經(jīng)DNA全自動(dòng)測(cè)序儀的掃描檢測(cè)后，通過(guò)不同等位基因擴(kuò)增片段與分子內(nèi)標(biāo)的相對(duì)位置而識(shí)別出目的片段的長(zhǎng)度大小，達(dá)到基因分型的目的。通過(guò)計(jì)算雜合度及各項(xiàng)法醫(yī)學(xué)鑒定指數(shù)，能對(duì)個(gè)體識(shí)別和群體多樣性、品系純度評(píng)估。本發(fā)明也能夠通過(guò)10％的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，依據(jù)不同大小的等位基因片段判別不同基因型。本發(fā)明具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏和適用的特點(diǎn)，對(duì)于樹(shù)鼩資源遺傳多樣性評(píng)估、品種品系的分子標(biāo)記輔助選育和個(gè)體識(shí)別具有重要意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102424864SQ20121000422
公開(kāi)日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者劉小紅, 姚永剛 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所