專利名稱：一種水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法。
背景技術(shù)：
近年來由于抗生素在養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)中的大量使用，導(dǎo)致其對環(huán)境污染的問題日趨嚴(yán)重，已成為當(dāng)前國際上的研究熱點之一。我國是世界第一水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，但近年來由于水產(chǎn)養(yǎng)殖污染加劇，造成養(yǎng)殖環(huán)境質(zhì)量不斷惡化，病原生物種類增多和傳播速度加快，養(yǎng)殖病害日趨嚴(yán)重，水產(chǎn)養(yǎng)殖中的病害問題特別是細菌性病害在密集型養(yǎng)殖系統(tǒng)中發(fā)生頻繁且影響嚴(yán)重，這極大地限制了我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。目前病害防治的主要方法是使用抗生素類藥物，抗生素作為飼料添加劑在動物養(yǎng)殖業(yè)中使用非常普遍?？股氐拈L期濫用很可能會誘導(dǎo)動物體內(nèi)產(chǎn)生抗生素抗性基因(Antibiotics resistance genes, ARGs), ARGs 經(jīng)排泄后將對養(yǎng)殖區(qū)域及其周邊環(huán)境造成潛在基因污染。隨著抗生素類藥物不斷的大量使用，許多細菌都有了耐藥性，且情況日益嚴(yán)重，抗生素抗性基因已經(jīng)成為一種新型的環(huán)境污染物。目前在不同的環(huán)境介質(zhì)如水體沉積物水生生物和細菌體內(nèi)等均已檢出AR(}S的存在， 并且有研究還發(fā)現(xiàn)AR(is能夠通過可移動的遺傳元件(Genetic mobile elements)在細菌之間傳播，進而在環(huán)境中擴散，這將會對公共健康和食品安全構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。針對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)大量使用抗生素這一現(xiàn)狀，開展?jié)O業(yè)環(huán)境抗生素抗性基因污染的研究，建立水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境抗生素抗性菌株篩選和鑒定方法，揭示抗生素抗性基因在漁業(yè)環(huán)境中的擴散和傳播規(guī)律，對于評價抗生素抗性基因的生態(tài)風(fēng)險十分必要。不僅能確保我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，而且對于我國的生態(tài)安全和經(jīng)濟發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。目前，人們普遍認為抗生素對環(huán)境微生物的耐藥性的選擇和誘導(dǎo)可能是其環(huán)境效應(yīng)最重要的部分。抗生素對耐藥菌株抗性基因ARGs的誘導(dǎo)具專一性，因此可以認為抗生素本身在環(huán)境中的遷移、轉(zhuǎn)化及歸趨等環(huán)境行為與其所誘導(dǎo)的抗生素抗性基因在環(huán)境中的廣泛傳播在理論上應(yīng)該具有很大的相似性和一致性。己有一些研究證實了抗性基因的存在與抗生素的使用之間存在很好的相關(guān)性。研究表明，攜帶ARGS的微生物菌株死亡后，攜帶 ARGS的DNA可釋放到環(huán)境中并持久存在，原因是在脫氧核糖核酸酶的保護下，防止其被降解，裸露的DNA分子最終又可以轉(zhuǎn)入到其他細胞內(nèi)?？股乜剐曰虻姆肿訖z出可以確定無疑地證明細菌的耐藥性，闡釋細菌耐藥機理，更可以檢查耐藥因子的起源及傳播擴散途徑和動態(tài)，為耐藥細菌，尤其是耐藥病原菌的追蹤監(jiān)測提供了其它方法無法取代的最佳手段。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)測定耐藥基因的核酸序列還可用來檢測耐藥基因的變異，用來追蹤某一耐藥基因的系統(tǒng)發(fā)生和進化演化，并通過計算機分子結(jié)構(gòu)建模而預(yù)測該耐藥基因表達產(chǎn)物耐藥譜的演化。目前的抗性基因檢測方法主要有兩種，傳統(tǒng)的方法是利用抗性平板法篩選出抗性細菌，對其進行總量的測定，并鑒定出抗性細菌的種屬，然后從菌體中提取DNA，再利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測環(huán)境中的抗性基因。由于環(huán)境中許多微生物難以平板培養(yǎng)，主要是因為對其最適生長溫度、PH、氧、營養(yǎng)成分等不十分清楚。因此，以傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)的方法評價抗性難免低估了微生物的種類。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種直接在水產(chǎn)養(yǎng)殖生物或環(huán)境樣品中提取總DNA，再利用PCR方法分析抗性菌株的方法，即一種水產(chǎn)養(yǎng)殖生物或水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的
一種水產(chǎn)養(yǎng)殖生物或水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，步驟如下
(1)細菌總DNA的提取提取水產(chǎn)養(yǎng)殖生物或水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境樣品里細菌總DNA；
(2)以步驟(1)所得總DNA為模板，SEQID NO:廣2所示序列為引物，PCR擴增和分析 16S rDNA序列，進行測序，鑒定菌株的種屬名稱；
(3)經(jīng)過種屬鑒定的菌株進一步測序鑒定，檢測帶有抗生素抗性基因的菌株，所述抗生素抗性基因為耐氯霉素基因floR、耐磺胺類基因sull，和/或耐磺胺類基因sul2 (三種耐藥基因均為北京六合華大基因科技股份有限公司深圳分公司產(chǎn)品)。上游引物27f 有 19 個堿基=AGA GTT GAT CCT GGC TCA G(SEQ ID NO: 1)，下游引物 1492r 有 19 個堿基GGT TAC CTT GTT ACG ACT T (SEQ ID NO:2)。上述鑒定方法的步驟(2)中所述16S rDNA序列為SEQ ID NO:9^11所示任意一條序列；步驟(3)所述耐氯霉素基因floR序列如SEQ ID N0:12所示，耐磺胺類基因sull序列如SEQ ID N0:13所示。上述方法除用于鑒定外，也可以用于篩選水產(chǎn)養(yǎng)殖生物或水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的抗生素抗性菌株。其中，步驟(1)細菌總DNA的提取優(yōu)選如下操作方法
(1)將分離純化的細菌接種于2216E液體培養(yǎng)基或LB液體培養(yǎng)基中，隔夜搖床培養(yǎng)；其中分離純化優(yōu)選平板劃線法，2216E液體培養(yǎng)基(可從青島海博生物技術(shù)有限公司購買)主要適用于海水環(huán)境，LB液體培養(yǎng)基主要適用于淡水環(huán)境，LB配方包括胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L ；
(2)吸取經(jīng)過培養(yǎng)的菌液，7500rpm離心5min，棄上清液；
(3)沉淀加入無菌水，振蕩搖勻后，沸水煮IOmin；
(4)12000rpm離心lOmin，上清液即可作為DNA模板。步驟(2)鑒定細菌的PCR反應(yīng)體系為50 μ L，內(nèi)含2XPCR Reaction Mix 25μ , 10 μ M的引物27f和引物1492r各2μ 、2. 5U的Taq酶0. 5 μ L、含50 150ng的DNA模板溶液 2μ 、ddH20 18. 5 μ L0步驟(2)鑒定細菌的PCR擴增條件為94 °C預(yù)變性5min，然后94°C變性30s，55°C 退火30s，72°C延伸90s，共30個循環(huán)，最后在72°C充分延伸lOmin。步驟(2)鑒定細菌的PCR擴增16S rDNA產(chǎn)物大小為1. 5Kbp。步驟(3)中檢測抗生素抗性基因的PCR反應(yīng)體系為20 μ L，其中2XPCR Reaction Mix 10μ L,2. 5U 的 Taq 酶 0. 2μ 、10 μ M 的上下游引物各 0. 8 μ L、含 50 150ng 的 DNA 模板溶液 lyL，ddH207. 2 μ L0擴增耐氯霉素基因floR使用的引物序列上游引物floR-FW有18個堿基TGGCTC CTT TCG ACA TCC (SEQ ID NO: 3)，下游引物 floR-RV 有 19 個堿基:ATC CAC ATC GGT AGG ATG A (SEQ ID N0:4)。擴增耐氯霉素基因floR的條件為94 °C預(yù)變性5min，然后94°C變性45s，52°C退火30s，72°C延伸60s，共30個循環(huán)，最后在72°C充分延伸5min。擴增耐磺胺類基因sull使用的引物序列為上游引物sull-FW有22個堿基CGC ACC GGA AAC ATC GCT GCA C(SEQ ID NO: 5)，下游引物 sull-RV有 22 個堿基TGA AGT TCC GCC GCA AGG CTC G (SEQ ID NO:6)。擴增耐磺胺類基因sul2使用的引物序列上游引物SU12-FW有22個堿基TCC GGT GGA GGC CGG TAT CTG G (SEQ ID N0:7)，下游引物sul2_RV有22個堿基CGG GAA TGC CAT CTG CCT TGA G (SEQ ID NO:8)。擴增耐磺胺類基因sull或sul2的條件最佳為95 °C預(yù)變性5min，然后95 °〇變性15s, 63. 7°C退火30s，72°C延伸30s，共40個循環(huán)，最后在72°C充分延伸7min。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明的方法針對水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境中的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有效，DNA提取無需使用特殊試劑，也無需用酚和氯仿等有毒試劑，安全環(huán)保，價格低廉，步驟簡單，耗時短，結(jié)果穩(wěn)定可靠，PCR產(chǎn)物的擴增陽性率高。以耐氯霉素基因(floR)、耐磺胺類基因(sull、su12)設(shè)計引物，進行PCR擴增，具有與目的條帶吻合的菌株即為攜帶抗性基因的抗性菌株。運用16S rDNA鑒定菌種和檢測抗性基因，DNA圖譜信息度高、實用性強、簡便快速，結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好、靈敏度高，具有十分廣闊的應(yīng)用前景，可運用于水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境抗生素抗性菌株篩選和鑒定及相關(guān)分析，具有很高的理論研究意義和實用價值。


圖1.細菌菌株16S rDNA鑒定結(jié)果，其中1為陰性對照，2-10為鑒定菌種，M為DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)DL-2000。圖2.抗性基因檢測結(jié)果，其中1，2為floR基因檢測，3為sul2基因檢測，4為sull 基因檢測，5為陰性對照，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL-2000。
具體實施例方式實施例1抗生素抗性菌株篩選和鑒定
取養(yǎng)殖池塘的水樣，加Iml吐溫溶液，用滅菌的海水將水樣10_\10_2倍比稀釋，用移液槍吸取0. ImL的水樣涂布2216E液體培養(yǎng)基(海水)或LB液體培養(yǎng)基(淡水)平板，28°C隔夜搖床培養(yǎng)。用吸管吸取ImL的細菌培養(yǎng)液，7500rpm離心5min，棄掉上清，加入0. 4mL的無菌水，振蕩搖勻后，沸水浴煮lOmin，然后再12000rpm離心lOmin，上清液即可作為DNA模板，-20°C保存。取制備的環(huán)境樣品DNA模板液，選取上游引物27f:AGA GTT GAT CCT GGC TCA G (SEQ ID N0:1)，下游引物 1492r :GGT TAC CTT GTT ACG ACT T (SEQ ID N0:2)，進行 16S rDNA的PCR擴增(引物由華大基因合成)。PCR反應(yīng)體系為50 μ L，內(nèi)含2XPCR Reaction Mix、10 μ M的引物27f和引物1492r、Taq酶、含50 150ng的DNA模板溶液、ddH20。具體成分見表1(其中2XPCR Reaction Mix,2. 5U的Taq酶來源于北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司的PCR Kit)
表1 16S rDNA的PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種水產(chǎn)養(yǎng)殖生物或水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，其特征在于步驟如下(1)細菌總DNA的提取提取水產(chǎn)養(yǎng)殖生物或水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境樣品里細菌總DNA；(2)以步驟(1)所得總DNA為模板，SEQID NO:廣2所示序列為引物，PCR擴增和分析 16S rDNA序列，進行測序，鑒定菌株的種屬名稱；(3)經(jīng)過種屬鑒定的菌株進一步測序鑒定，檢測帶有抗生素抗性基因的菌株，所述抗生素抗性基因為耐氯霉素基因floR、耐磺胺類基因sull，和/或耐磺胺類基因sul2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，其特征在于步驟(1)細菌總DNA的提取具體操作如下(1)將分離純化的細菌接種于2216E液體培養(yǎng)基或LB液體培養(yǎng)基中，28°C隔夜搖床培養(yǎng)；(2)吸取經(jīng)過培養(yǎng)的菌液，7500rpm離心5min，棄上清液；(3)沉淀加入無菌水，振蕩搖勻后，沸水煮IOmin；(4)12000rpm離心lOmin，上清液即可作為DNA模板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，其特征在于步驟(2)鑒定細菌的PCR反應(yīng)體系為50μ L，內(nèi)含2XPCR Reaction Mix 25μ 、2. 5U的Taq酶 0. 5 μ L、10yM 的引物 SEQ ID NO: 1 和引物 SEQ ID NO: 2 各 2μ 、含 50 150ng 的 DNA 模板溶液 2μ , ddH20 18. 5 μ L0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，其特征在于步驟 (2)鑒定細菌的PCR擴增條件為94 °C預(yù)變性5min，然后94°C變性30s，55°C退火30s，72°C 延伸90s，共35個循環(huán)，最后在72°C充分延伸lOmin。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，其特征在于步驟(2)鑒定細菌的PCR擴增16SrDNA產(chǎn)物大小為1. 5Kbp。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，其特征在于步驟(3)中檢測抗生素抗性基因的PCR反應(yīng)體系為20μ L，其中2XPCR Reaction Mix 10 μ L、 2. 5U的Taq酶0. 2μ , 10 μ M的上下游引物各0. 8 μ L、含50 150ng的DNA模板溶液1 μ L， ddH207. 2 μ L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，其特征在于擴增耐氯霉素基因fIoR使用的引物序列為SEQ ID N0:3、。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，其特征在于擴增耐氯霉素基因f IoR的條件為95 °C預(yù)變性5min，然后98°C變性15s，52°C退火30s，72°C延伸60s，共30個循環(huán)，最后在72°C充分延伸5min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，其特征在于擴增耐磺胺類基因sull使用的引物序列為SEQ ID N0:5 6 ；擴增耐磺胺類基因sul2使用的引物序列為SEQ ID N0:7 8。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，其特征在于擴增耐磺胺類基因sull或sul2的條件為95 °C預(yù)變性5min，然后98 °C變性1 ，63. 7°C退火30s，72°C延伸30s，共40個循環(huán)，最后在72°C充分延伸7min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，該方法是提取細菌的總DNA作為模板，SEQIDNO:1~2所示序列為引物，PCR擴增和16SrDNA序列分析鑒定菌株，同時以SEQIDNO:3~8所示序列為引物，進行測序鑒定，檢測帶有抗性基因的抗性菌株。本發(fā)明的方法針對水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境中的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有效，DNA提取無需使用特殊試劑，也無需用酚和氯仿等有毒試劑，安全環(huán)保，價格低廉，步驟簡單，耗時短，結(jié)果穩(wěn)定可靠，PCR產(chǎn)物的擴增陽性率高。運用16SrDNA鑒定菌種和檢測抗性基因，DNA圖譜信息度高、實用性強、簡便快速，結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好、靈敏度高，具有十分廣闊的應(yīng)用前景、有很高的理論研究意義和實用價值。
文檔編號C12Q1/68GK102534002SQ20121000454
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者何建國, 陳旭凌, 黃志堅 申請人:中山大學(xué)