專利名稱：一種重組人巨細(xì)胞病毒蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程、疫苗研制和診斷試劑等領(lǐng)域，具體地涉及一種人巨細(xì)胞病毒蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人巨細(xì)胞病毒(Human Cytomegalovirus，簡稱HCMV)屬皰疹病毒β亞科，是一種DNA病毒，其感染在人群中廣泛存在，我國人群中HCMV感染相當(dāng)嚴(yán)重。婦女在妊娠初期受HCMV原發(fā)感染是引起胎兒宮內(nèi)感染和發(fā)育缺損的重要原因，在孕期原發(fā)性感染HCMV的胎兒和新生兒中，80%可導(dǎo)致智力低下、畸形和死亡[Middeldorp JM. Jongsma J，Haar AT, et al.Detection of immunoglobulin M and G antibodies against cytomegalovirus early and late antigend by enzyme-linked immunosorbent assay. J Clin. Microbiol, 1984 ；20 (4) :763-771. ]。HCMV也是器官移植失敗和艾滋病病人并發(fā)感染死亡的主要原因之一。對(duì)非免疫缺陷者常導(dǎo)致長期隱性感染，甚至引起感染細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、畸變或癌變等 [Huang ES.The pathogenicity of Human Cytomegalovirus. Springer-Vellag.Berin， 1993，1-45]。因此快速準(zhǔn)確的診斷HCMV病毒感染具有十分重要的意義。目前巨細(xì)胞病毒感染診斷方法有脫落細(xì)胞及組織病理檢查、病毒分離、分子雜交試驗(yàn)和血清學(xué)檢查，但由于前三種方法技術(shù)設(shè)備要求高，檢測(cè)周期長的局限性，無法廣泛使用，而血清學(xué)檢查具有簡便快速的特性使其在臨床上得到廣泛應(yīng)用，目前大多檢測(cè)試劑采用盒用的HCMV蛋白質(zhì)抗原主要是來源于病毒培養(yǎng)物或是重組表達(dá)的單一蛋白片段，或者由于蛋白質(zhì)抗原純度低及特異性差，造成假陽性而降低檢測(cè)特異性；或者由于單一片段抗原蛋白所含抗原決定簇較少，所識(shí)別的抗體相應(yīng)較少，易造成假陰性而降低檢測(cè)敏感性，雖然多種單一片段組合制備檢測(cè)試劑也可以避免上述問題，但必然要求多次進(jìn)行提取純化過程，而且小分子蛋白質(zhì)或多肽的提純技術(shù)要求更高，工作效率太低。另外，在全球范圍內(nèi)，目前缺乏有效治療病毒感染藥物的情況下，通過接種疫苗預(yù)防病毒感染成為一種重要的醫(yī)學(xué)干預(yù)手段，HCMV疫苗的研制也是進(jìn)行HCMV研究的重要領(lǐng)域之一，而疫苗研究的一個(gè)重要前提是其所用蛋白質(zhì)抗原應(yīng)具有高特異性、強(qiáng)免疫原性和盡量完整的抗原決定簇，因此開發(fā)一種多抗原決定簇串聯(lián)的重組蛋白質(zhì)技術(shù)是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種重組人巨細(xì)胞病毒蛋白，本發(fā)明的另一目的是提供該重組人巨細(xì)胞病毒蛋白在制備檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。(二)本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種編碼人巨細(xì)胞病毒蛋白的重組DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。同時(shí)提供了由該重組DNA序列編碼的人巨細(xì)胞病毒蛋白，其氨基酸序列如SEQ
3ID NO 2 所示。本發(fā)明還提供了一種人巨細(xì)胞病毒蛋白的表達(dá)載體pETj8a-HCMV，它是將SEQ ID NO 1所示所述的重組DNA序列插入到質(zhì)粒pET-28a上得到的重組質(zhì)粒，其質(zhì)粒圖譜如附圖 2所示。將表達(dá)載體pET18a-HCMV導(dǎo)入大腸桿菌中，得到表達(dá)人巨細(xì)胞病毒蛋白的工程菌株。本發(fā)明利用SEQ ID NO :1所示核苷酸序列通過基因工程方法制備人巨細(xì)胞病毒蛋白可以通過如下步驟實(shí)現(xiàn)1)獲得具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；2)將該核苷酸序列導(dǎo)入質(zhì)粒，優(yōu)選pET_28a質(zhì)粒；3)將該質(zhì)粒導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌宿主細(xì)胞，更優(yōu)選BL21(DE3)菌株中；4)在有利于所述核苷酸序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；5)回收、純化及復(fù)性所表達(dá)的重組蛋白。本發(fā)明提供的檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒感染的試劑盒，其組分中的抗原是本發(fā)明所述的重組人單純皰疹病毒蛋白。用于標(biāo)記人巨細(xì)胞病毒蛋白的標(biāo)記物選白自制膠體金、辣根過氧化物酶(HRP)。本發(fā)明所述的采用膠體金標(biāo)記抗原的試劑盒中，抗人IgG抗體劃線包被濃度為 2. Omg/ml,HCMV抗原膠體金復(fù)合物在濃縮原液到稀釋一倍之間包被載金墊。抗人IgG抗體劃線量為1. 0μ 1/cm，膠體金結(jié)合物噴點(diǎn)量為25. 0μ 1/cm。兔抗巨細(xì)胞病毒抗體包被量為 1. 0 μ 1/cm,包被濃度為 5. Omg/ml。以下將更詳細(xì)的描述本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明公開了一種編碼人巨細(xì)胞病毒蛋白的如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列， 利用該核苷酸序列制備人巨細(xì)胞病毒蛋白的方法，由該方法制備的包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的人巨細(xì)胞病毒蛋白，以及包含該蛋白的組合物和試劑盒，同時(shí)還公開了它們?cè)跈z測(cè)人巨細(xì)胞病毒感染的應(yīng)用。SEQ ID NO :1所示核苷酸序列可以通過本領(lǐng)域常規(guī)的方法制備，優(yōu)選根據(jù)目的片段的DNA序列，即HCMV ppl50和pp65上目的肽段的cDNA序列和質(zhì)粒上的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)兩對(duì)PCR引物(P1，P2)和(P3，P4)。pi和p2用于擴(kuò)增ppl50第1447位到第2046位核苷酸， P3和p4用于擴(kuò)增pp65第1069位到第1635核苷酸；引物pi和p4分別帶有NdeI和XhoI 的酶切位點(diǎn)，引物P2和p3順序互補(bǔ)，并共同對(duì)應(yīng)于ppl50上述片段的3’末端和pp65上述片段的5’末端序列。引物序列如下Pl:ATCGCATATGGGTGACGGGCGGTTTGGCGP2 GAAGAGGAAAAGCGTCGCGAGCGGCAGP3 :TCGCGACGCTTTTCCTCTTCGTCGTAGCAAACCAGCTCGTP4 :ATCGCTCGAGTTAGGGCACGTGCTGATAGCCGTGTTT以人巨細(xì)胞病毒培養(yǎng)物為模板，以引物Pl和P2擴(kuò)增ppl50片段，以引物P3和P4 擴(kuò)增pp65片段；再以第一輪PCR擴(kuò)增得到的ppl50片段和pp65片段為模板，加入引物Pl 和P4，擴(kuò)增pp 150pp65片段；得到串聯(lián)的目的基因重組片段pp 150pp65。
本發(fā)明對(duì)上述核苷酸序列的核酸分子采用適當(dāng)載體和宿主細(xì)胞表達(dá)時(shí)可以大大提高表達(dá)產(chǎn)率。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及應(yīng)用如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列制備人巨細(xì)胞病毒蛋白的方法。根據(jù)常規(guī)方法，可將含編碼人巨細(xì)胞病毒蛋白的如SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的核酸分子連接到一個(gè)表達(dá)載體中，然后通過常規(guī)方法轉(zhuǎn)化細(xì)胞。通常，優(yōu)選原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本發(fā)明的載體構(gòu)建。例如，大腸桿菌等腸科桿菌。編碼本發(fā)明蛋白的核酸與pET_28a形成的雜合質(zhì)粒具有高度的穩(wěn)定性，有利于本發(fā)明的蛋白的表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，如圖2所示，制備含有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的核酸分子和pETj8a質(zhì)粒的表達(dá)構(gòu)建體，并將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，收集菌體?？刹捎贸Ｒ?guī)的純化方法純化所得到的蛋白。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及用上述方法制備、純化的人巨細(xì)胞病毒蛋白，該蛋白具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及包含本發(fā)明人巨細(xì)胞病毒蛋白的組合物和試劑盒。所述組合物或試劑盒可制備成檢測(cè)人單純皰疹病毒感染的試劑或試劑盒形式，在臨床上用于方便、快速和準(zhǔn)確的巨細(xì)胞病毒感染。任何生物學(xué)樣品，只要它們含有人巨細(xì)胞病毒抗體， 就可用本發(fā)明蛋白，包含該蛋白的組合物或試劑盒來檢測(cè)。本文所述“試劑盒”是指利用本發(fā)明蛋白完成人巨細(xì)胞病毒感染檢測(cè)而組配制成的成套試劑。該試劑盒用于診斷人巨細(xì)胞病毒感染。本發(fā)明試劑盒可包括其它多個(gè)容器， 其中可分別含有檢測(cè)所用的標(biāo)準(zhǔn)品，抗體或經(jīng)過標(biāo)記的抗體、酶，底物或緩沖液等。在該試劑盒中，還包括標(biāo)簽和包裝插頁用以提供試劑盒的使用說明。還可包括符合用戶需要的其它材料，如微量滴定板等。在用于人巨細(xì)胞病毒感染檢測(cè)的試劑盒中，本發(fā)明的人巨細(xì)胞病毒蛋白也可以是經(jīng)過標(biāo)記的。具體可使用酶、金屬螯合物等標(biāo)記。優(yōu)選的標(biāo)記性酶例如，辣根過氧化物酶， 過氧化物酶，堿性磷酸酶等。優(yōu)選的金屬物質(zhì)有膠體金等。與上述標(biāo)記物結(jié)合的方法是已知的。當(dāng)標(biāo)記物為酶時(shí)，其底物和顯色劑可用于測(cè)定其活性。當(dāng)使用過辣根過氧化物酶時(shí)，以3' ,3' ,5' ,5'，-四甲基聯(lián)苯胺作為底物溶液，并使用TMB顯色系統(tǒng)。當(dāng)使用過氧化物酶時(shí)，以H2O2作為底物溶液，并以鄰苯二胺、4-氨基氨替比林等作為顯色劑。當(dāng)使用堿性磷酸酶時(shí)，可用鄰硝基苯磷酸、對(duì)硝基苯磷酸等作為底物。(三)有益效果采用本發(fā)明提供的重組人巨細(xì)胞病毒蛋白制備的診斷試劑盒，與市場上的同類試劑盒相比，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，很好的滿足了人巨細(xì)胞病毒感染臨床診斷的需要。本發(fā)明提供的HCMV蛋白抗原具有高特異性、強(qiáng)免疫原性和盡量完整的抗原決定簇，在 HCMV疫苗研制領(lǐng)域具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。


圖IPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖；圖2是表達(dá)質(zhì)粒pETj8a-HCMV的構(gòu)建流程圖3是誘導(dǎo)后菌體12% SDS-PAGE電泳圖，其中M表示Marker，1表示目的蛋白。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1巨細(xì)胞病毒蛋白的制備1. 1巨細(xì)胞病毒蛋白抗原表位篩選及目的基因克隆通過計(jì)算機(jī)分析巨細(xì)胞病毒的全部氨基酸序列篩選出巨細(xì)胞病毒蛋白的強(qiáng)抗原表位，所述的重組蛋白質(zhì)從N-末端到C-末端依次含有HCMV ppl50從N-末端第483位到第682位的200個(gè)氨基酸和pp65從N-末端第357位到545位的189個(gè)氨基酸。其中上述重組蛋白質(zhì)的DNA序列如SEQ ID No. 2所示，所述的ppl50目的肽段DNA序列是第1447位到第2046位核苷酸，pp65目的肽段DNA序列是第1069位到第1635位核苷酸。根據(jù)目的片段的DNA序列，即HCMV ppl50和pp65上目的肽段的cDNA序列和質(zhì)粒上的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)兩對(duì)PCR引物(PI, P2)和(P3，P4)。pi和p2用于擴(kuò)增ppl50第1447 位到第2046位核苷酸，p3和p4用于擴(kuò)增pp65第1069位到第1635核苷酸；引物pi和p4 分別帶有NdeI和B10I的酶切位點(diǎn)，引物p2和p3順序互補(bǔ)，并共同對(duì)應(yīng)于ppl50上述片段的3’末端和pp65上述片段的5’末端序列。引物序列如下Pl:ATCGCATATGGGTGACGGGCGGTTTGGCGP2 GAAGAGGAAAAGCGTCGCGAGCGGCAGP3 :TCGCGACGCTTTTCCTCTTCGTCGTAGCAAACCAGCTCGTP4 :ATCGCTCGAGTTAGGGCACGTGCTGATAGCCGTGTTT上述引物由(華美生物技術(shù)有限公司)合成。以人巨細(xì)胞病毒培養(yǎng)物(中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所贈(zèng))為模板，以引物Pl 和P2擴(kuò)增ppl50片段，以引物P3和P4擴(kuò)增pp65片段；再以第一輪PCR擴(kuò)增得到的ppl50 片段和pp65片段為模板，加入引物Pl和P4，擴(kuò)增ppl50pp65片段；得到串聯(lián)的目的基因重組片段ppl50pp65 ；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如附圖1所示。切割含目的DNA 條帶的膠塊，用DNA快速純化試劑盒(購自六合通-北京TAKARA公司，產(chǎn)品名稱=TAKARA MiniBEST Plasmid purification)回收目的DNA，操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。1. 2表達(dá)載體pET18a-HCMV的構(gòu)建及鑒定pET_28a載體(購自華美生物技術(shù)有限公司)與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物目的DNA片段經(jīng) NdeI 和 XhoI 雙酶切，產(chǎn)物純化(采用 TAKARA MiniBEST Plasmid purification 試劑盒， 購自六合通-北京TAKARA公司)后經(jīng)T4DNA連接酶與載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 BL2KDE3)感受態(tài)(購自華美生物技術(shù)有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37°C倒置培養(yǎng)過夜，次日挑選平板上生長的菌落，堿裂解法抽提質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳選擇可疑重組質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)有擴(kuò)增產(chǎn)物的重組子質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶NdeI和B10I雙酶切、 鑒定，其中有3個(gè)重組子為陽性重組子。從3個(gè)陽性重組子中選一個(gè)陽性重組子送賽百勝公司測(cè)序鑒定，結(jié)果表明該質(zhì)粒上確實(shí)插入了目的基因，且插入方向正確，將此重組質(zhì)粒命名為表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-HCMV。1. 3表達(dá)人巨細(xì)胞病毒蛋白的工程菌的構(gòu)建
將表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-HCMV用化學(xué)轉(zhuǎn)化法((美)J.薩姆布魯克 (JosephSambrook),(美)D.W.拉塞爾(DavidW. Russell)著，黃培堂等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.科學(xué)出版社，2002.)轉(zhuǎn)入大腸埃希氏菌BL21(DE3)菌株(購自華美生物技術(shù)有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37°C倒置培養(yǎng)過夜，次日挑選平板上生長的菌落用含卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5小時(shí)，誘導(dǎo)后的菌體用12% SDS-PAGE分析 (同上文獻(xiàn))，結(jié)果如附圖3所示，確定表達(dá)人巨細(xì)胞病毒蛋白的菌株即為所需的工程菌株， 用甘油冷凍保存。1. 4重組人巨細(xì)胞病毒蛋白的表達(dá)制備及純化誘導(dǎo)培養(yǎng)已構(gòu)建的表達(dá)人巨細(xì)胞病毒蛋白的大腸埃希氏菌，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5小時(shí)，離心收集菌體，以1 10 (W/V)加入菌體裂解液(50mm pH 8. OTris-Cl, 50mm NaCl,50% 甘油)，加入磁力攪拌轉(zhuǎn)子攪拌30分鐘，經(jīng)超聲破菌(冰浴，功率200W，超聲3秒，間隔5秒， 超聲80次)、組氨酸親和柱(300ml 200mm的NiC12過柱，流速5ml/min ；500ml平衡緩沖液洗注，流速lOml/min ；超聲離心后的沉淀用200ml平衡緩沖液稀釋后上樣，流速3ml/min， 500ml平衡緩沖液洗注，流速5ml/min ；用分別含咪唑20mm、50mm、100mm、200mm各IOOml的洗脫緩沖液洗脫，紫外檢測(cè)R^Onm檢測(cè)吸收值，收集洗脫峰；SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化組分)得到純化的重組蛋白。1. 5 重組蛋白 1Western-Wot 驗(yàn)證為驗(yàn)證重組HCMV型蛋白質(zhì)與抗HCMV抗血清反應(yīng)性及重組目的基因獲得表達(dá)并具有抗原性，用Western-blot法進(jìn)行了測(cè)試。陽性血清為10份兔抗HCMV抗體陽性血清(購自北京百安天地醫(yī)藥科技有限公司)和30份人抗HCMV抗體陽性血清(經(jīng)ELISA法檢測(cè)證實(shí))。陰性血清為10份對(duì)照正常兔血清和30份人抗HCMV抗體陰性血清(經(jīng)ELISA法檢測(cè)證實(shí))。結(jié)果如表1。表1重組蛋白Western-blot驗(yàn)證結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種編碼人巨細(xì)胞病毒蛋白核酸，如SEQ ID N0:1所示。
2.包含權(quán)利要求1所述核酸的人巨細(xì)胞病毒蛋白的表達(dá)載體，其特征在于它是將權(quán)利要求1所述的核酸插入到質(zhì)粒pET-28a上得到的重組pETj8a-HCMV質(zhì)粒。
3.—種人巨細(xì)胞病毒蛋白，其特征在于它由權(quán)利要求1所述的核酸編碼，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
4.一種重組人巨細(xì)胞病毒蛋白的制備方法，其特征在于應(yīng)用權(quán)利要求1的重組DNA構(gòu)建表達(dá)載體，并在該載體所適合的原核宿主細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求1所述重組DNA編碼的重組人巨細(xì)胞病毒蛋白。
5.一種表達(dá)人巨細(xì)胞病毒蛋白的工程菌株，其特征在于它含有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體pETj8a-HCMV，宿主菌為大腸桿菌。
6.一種檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒感染的試劑盒，其特征在于其組分中的抗原是根據(jù)權(quán)利要求 2所述的人巨細(xì)胞病毒蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人巨細(xì)胞病毒蛋白在制備檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人巨細(xì)胞病毒蛋白，還提供了該重組蛋白在制備檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。采用本發(fā)明提供的編碼人巨細(xì)胞病毒蛋白制備的診斷試劑盒，與市場上的同類試劑盒相比，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，很好的滿足了人巨細(xì)胞病毒蛋白感染臨床診斷的需要。
文檔編號(hào)C12N15/38GK102533795SQ20121000491
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者張曉剛, 王健, 王志新, 陳廷友 申請(qǐng)人:英諾特(唐山)生物技術(shù)有限責(zé)任公司