專利名稱：分枝桿菌最低抑菌濃度檢測系統(tǒng)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分枝桿菌的藥物最低抑菌濃度(MIC)檢測或抗菌藥物篩選領(lǐng)域，具體涉及一種分枝桿菌的藥物最低抑菌濃度(MIC)檢測系統(tǒng)的制備方法，所述檢測系統(tǒng)適用于分枝桿菌、放線菌、真菌、細胞等藥敏檢測檢測。
背景技術(shù)：
迄今為止，結(jié)核病仍是全球范圍內(nèi)最為常見的感染性疾病之一，盡管全球結(jié)核病總發(fā)病率已開始下降，但耐藥現(xiàn)象日益嚴重。世界衛(wèi)生組織(WHO)數(shù)據(jù)表明2010年世界結(jié)核病患者880萬，死亡110萬。不完善的治療方案和管理措施已導(dǎo)致結(jié)核病耐藥率及耐藥程度逐漸增加，2010年至少有5%的新發(fā)病例或復(fù)發(fā)病例屬于耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)。目前，中國仍是世界第二大結(jié)核病負擔(dān)國，2010年患病人數(shù)達90-120萬，2008年我國基線調(diào)查表明，涂陽肺結(jié)核患者中MDR-TB患病率為8. 32%，廣泛耐藥結(jié)核病O(DR-TB)為0. 68%。結(jié)核病的病原體是抗酸分枝桿菌，主要是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，其次為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)。由于結(jié)核分枝桿菌耐藥的增加及NTM對一些常見抗結(jié)核藥物的天然耐受，使分枝桿菌MIC的檢測顯得尤為重要。分枝桿菌MIC值反應(yīng)了細菌的耐藥程度，其準(zhǔn)確而快速的檢測對臨床事實個體化治療、藥物劑量的優(yōu)化以及抗結(jié)核新藥的篩選具有重要作用。目前可用于結(jié)核分枝桿菌MIC值測定的方法按所使用的培養(yǎng)基類型分為兩大類一是基于傳統(tǒng)固體培養(yǎng)基的表型檢測方法如瓊脂稀釋法、紙片瓊脂擴散法、Etest法等；二是基于液體培養(yǎng)基中結(jié)核分枝桿菌的生長或其代謝反應(yīng)為基礎(chǔ)的檢測方法具體有 BACTEC放射性檢測系統(tǒng)、分枝桿菌生長指示管MGIT、肉湯常量稀釋法、肉湯微量稀釋法 (BMM)、硝酸還原法(NRA)、阿瑪爾藍(Alamar blue)法、刃天青法、四唑鹽法等。由于固體培養(yǎng)基中藥敏檢測周期較長，藥物降解、吸附明顯，測定結(jié)果偏高，其運用受到一定的限制；而基于液體培養(yǎng)基檢測方法中的BACTEC放射性檢測系統(tǒng)雖然檢測周期較短，但常只檢測藥物的一個臨界濃度，且具有放射性污染。分枝桿菌生長指示管MGIT法解決了放射性污染問題，檢測速度快，敏感度和特異性較高，但也僅進行藥物一個濃度的檢測，而不是MIC檢測， 此外其成本較高難以在發(fā)展中國家廣泛運用。肉湯常量稀釋法消耗培養(yǎng)基較多，成本較高。 肉湯微量稀釋法(BMM)，雖然降低了培養(yǎng)基的使用量，但其靠肉眼觀察菌量進行判讀，容易誤讀，且靈敏度有限。液體培養(yǎng)中的幾種基于氧化還原指示劑的微量顯色法檢測周期相對較短，其測定結(jié)果與血藥濃度更有可比性，具有巨大的運用潛能。目前所使用的微量顯色法都是先將菌液培養(yǎng)一段時間后，打開培養(yǎng)板蓋子，加入顯示試劑，再進行短時間的培養(yǎng)顯色，這既操作復(fù)雜又增加了污染幾率，還容易引起生物安全問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有檢測方法的不足，提供一種適用于分枝桿菌藥物MIC 檢測系統(tǒng)的制備方法，具有操作簡便、快捷、穩(wěn)定性好、污染率低可用簡單設(shè)備或肉眼判讀結(jié)果的優(yōu)點。為分枝桿菌藥物MIC檢測、藥物篩選等提供一種簡單、快速、廉價的檢測系統(tǒng)。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)分枝桿菌最低抑菌濃度檢測系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟將配制好的50-200 微升、濃度為0. 01-400微克/毫升的含藥液體培養(yǎng)基與5-100微升1 X IO3-I X IO8個/毫升的分枝桿菌菌液、5-50微升顯色劑混合，在30-40攝氏度下恒溫共培養(yǎng)3-14天后，進行顯色檢測，并根據(jù)顯色檢測結(jié)果，判定藥物最低抑菌濃度，其中在混合后，所述顯色劑的終濃度為0. 08-10毫摩爾/升。在本發(fā)明的一實施方式中，所述方法還包括將5-50微升的中間電子受體與所述含藥液體培養(yǎng)基、分枝桿菌菌液、顯色劑混合，其中在混合后，所述中間電子受體的終濃度為10-200微摩爾/升。在本發(fā)明的一實施方式中，所述分枝桿菌主要為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，其次為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)，還可以為放線菌、真菌或細胞。在本發(fā)明的一實施方式中，所述分枝桿菌菌液的制備為采用麥?zhǔn)奖葷岱ɑ蛭舛确ǐ@得一定濃度的菌液，按一定倍數(shù)進行稀釋或不稀釋后備用。在本發(fā)明的一實施方式中，所述含藥液體培養(yǎng)基的配制是按照倍比稀釋法用液體培養(yǎng)基稀釋藥物。在本發(fā)明的一實施方式中，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)載體中配制所述含藥液體培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)載體是不低于2行5列的微孔板、不低于500微升的離心管或不低于5毫升的試管。在本發(fā)明的一實施方式中，所述液體培養(yǎng)基為含有營養(yǎng)添加劑的無菌 Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基，或其他適合細菌、細胞培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一實施方式中，所述藥物為異煙胼、利福平、鏈霉素、比嗪酰胺、乙胺丁醇、對氨基水楊酸、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素、環(huán)絲氨酸、氧氟沙星、左氧氟沙星、乙硫異煙胺、丙硫異煙胺、莫西沙星、環(huán)丙沙星、加替沙星、司帕沙星、青霉素鈉、頭孢西丁、頭孢噻肟、阿莫西林、美羅培南、亞胺培南、克拉維酸鉀、紅霉素、羅紅霉素、克拉維酸、妥布霉素、強力霉素、甲硝唑、替硝唑、噻吩-2-羧酸酰胼、對硝基-苯丙酸鈉、或動物、植物、微生物的提取物或發(fā)酵產(chǎn)物、化學(xué)合成的化學(xué)單體。在本發(fā)明的一實施方式中，所述中間電子受體為醌(BQ)類衍生物；萘醌(NQ)類衍生物；蒽醌(AnthraquinonhAQ)類衍生物；吩嗪(Wienazine)類衍生物。優(yōu)選地，所述中間電子受體為甲萘醌Q-Methyl-l，4-naphthoquinone)。優(yōu)選地，所述中間電子受體為甲硫吩嗪(Phenazine methyl sulfate, PMS)或 1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯鹽(l-Methoxy-5-methylphenazinium Methylsulfate, I-Methoxy PMS)。在本發(fā)明的一實施方式中，所述顯色試劑為刃天青、阿瑪爾藍、孔雀綠、硝酸還原試劑、或能產(chǎn)生水溶性甲臜的四唑鹽類化合物。優(yōu)選地，所述硝酸還原試劑為硝酸鹽、氨基苯磺胺、或N-(l-萘)乙烯二胺鹽酸鹽。優(yōu)選地，所述能產(chǎn)生水溶性甲臜的四唑鹽類化合物為XTT或WST系列化合物。在本發(fā)明的一實施方式中，所述顯色檢測的檢測方法為在分光光度計、熒光檢測儀中采用一定波長進行檢測，或直接通過肉眼觀察，通過所獲得的吸光度值或相對吸光度值，或肉眼觀察到顏色的明顯改變情況，判定分枝桿菌藥物的MIC值。在本發(fā)明的一實施方式中，中間電子受體可以和顯色劑混合均勻后一起加入到培養(yǎng)基中。本發(fā)明包括以下具體步驟1.按使用目的，選擇合適的分枝桿菌培養(yǎng)載體；2.按使用目的，選擇合適的液體培養(yǎng)基用于分枝桿菌的快速培養(yǎng)；3.按照使用目的及要求，配制一定濃度的分枝桿菌菌液；4.在步驟1的培養(yǎng)載體中，稀釋或添加一定濃度的含藥液體培養(yǎng)基；5.選擇合適的中間電子受體，并配制成一定濃度的中間電子受體溶液；6.按使用要求，選擇并配制一定濃度的顯色劑；7.在步驟4所配制好的含藥液體培養(yǎng)基中，依次加入一定體積的步驟3中的菌液，步驟6中的顯色劑，此外在另一實施方式中還可加入步驟5中的中間電子受體；8.將步驟7中的反應(yīng)體系在一定溫度下恒溫培養(yǎng)；9.培養(yǎng)后的反應(yīng)體系采用一定的檢測方法進行顯色檢測；10.根據(jù)步驟9中的檢測結(jié)果，判定分枝桿菌藥物的MIC值；所述步驟1中，培養(yǎng)載體為不低于2行5列的微孔板，不低于500微升的離心管或不低于5毫升的試管。所述步驟2中，培養(yǎng)基為含有營養(yǎng)添加劑(OADC)的無菌Middle brook 7H9液體培養(yǎng)基，或其他適合細菌、細胞培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基。所述步驟3中，采用麥?zhǔn)奖葷岱ɑ蛭舛确ǐ@得一定濃度的菌液，按一定倍數(shù)進行稀釋或不稀釋后備用。所述步驟3中，所述分枝桿菌主要為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的結(jié)核分枝桿菌，其次可以為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)，還可以為放線菌、真菌或細胞。所述步驟4中，先在各試驗孔加一定體積的液體培養(yǎng)基，然后選取細菌培養(yǎng)載體中的某一孔，加入一定濃度、體積的藥物，采用倍比稀釋法形成不同濃度的含藥培養(yǎng)基。所述步驟4中，各試驗孔可直接加入一定濃度、體積的含藥液體培養(yǎng)基。所述步驟4中，藥物為異煙胼、利福平、鏈霉素、比嗪酰胺、乙胺丁醇、對氨基水楊酸、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素、環(huán)絲氨酸、氧氟沙星、左氧氟沙星、乙硫異煙胺、丙硫異煙胺、莫西沙星、環(huán)丙沙星、加替沙星、司帕沙星、青霉素鈉、頭孢西丁、頭孢噻肟、阿莫西林、 美羅培南、亞胺培南、克拉維酸鉀、紅霉素、羅紅霉素、克拉維酸、妥布霉素、強力霉素、甲硝唑、替硝唑、噻吩-2-羧酸酰胼、對硝基-苯丙酸鈉、或動物、植物、微生物的提取物或發(fā)酵產(chǎn)物、化學(xué)合成的化學(xué)單體。所述步驟5中，中間電子受體主要為醌(BQ)類衍生物；萘醌(NQ)類衍生物， 如甲萘醌(2-Methyl-l,4-naphthoquinone)；蒽醌(Anthraquinone, AQ)類衍生物；吩嗪 (Phenazine)類衍生物，如甲硫吩嗪(Phenazine methyl sulfate,PMS)，1_ 甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯鹽(l-Methoxy-5-methylphenazinium Methylsulfate, I-Methoxy PMS)等。所述步驟6中，顯色試劑主要為刃天青、阿瑪爾藍(Alamar blue)、孔雀綠、硝酸還原試劑(硝酸鹽、氨基苯磺胺、Ν-α-萘)乙烯二胺鹽酸鹽)、及能產(chǎn)生水溶性甲臜的四唑鹽類化合物(如XTT、WST系列化合物等)。所述步驟7中，中間電子受體可以和顯色劑混合均勻后一起加入到培養(yǎng)基中。所述步驟9中，檢測方法為在分光光度計、熒光檢測儀中采用一定波長進行檢測；或直接通過肉眼觀察。所述步驟10中，通過所獲得的吸光度值或相對吸光度值，或肉眼觀察到顏色的明顯改變情況，判定分枝桿菌藥物的MIC值。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過一開始將含藥液體培養(yǎng)基、菌液、顯色劑、中間電子受體共培養(yǎng)，省略了現(xiàn)有技術(shù)中的培養(yǎng)一段時間后再開蓋加入顯色劑的步驟，使操作更為簡化，降低了操作污染及生物安全風(fēng)險。本發(fā)明這一檢測體系簡單、安全、低污染、可目視并快速判讀分枝桿菌藥物的MIC值。


圖1為采用96微孔板刃天青檢測時藥物稀釋舉例示意圖。圖2為采用96微孔板刃天青檢測時藥物和顯色劑共培養(yǎng)前舉例示意圖。圖3為采用96微孔板刃天青檢測時共培養(yǎng)后顯色舉例示意圖。圖4為采用1. 5ml離心管孔雀綠檢測時藥物和顯色劑共培養(yǎng)前舉例示意圖。圖5為采用1. 5ml離心管孔雀綠檢測時共培養(yǎng)后顯色舉例示意圖。
具體實施例方式將通過以下實施例并結(jié)合附圖，對本發(fā)明進行詳細的說明，但不限制本發(fā)明的范圍。結(jié)核分枝桿菌臨床分離株A來自武漢市醫(yī)療救治中心。異煙胼、利福平、鏈霉素、 乙胺丁醇、左氧氟沙星、卡那霉素等藥物購自美國Sigma公司。實施例1 1、選擇一塊無菌的96微孔板備用。2,Middle brook 7H9液體培養(yǎng)基配制取4. 9克Middle brook 7H9培養(yǎng)基干粉， 加入到含900ml蒸餾水的試劑瓶中，充分溶解，121°C高溫滅菌30分鐘。待培養(yǎng)基冷卻至室溫，按照10 1的比例加入營養(yǎng)添加劑0ADC(0. 酪蛋白胨，0.5%甘油，10%油酸、牛血清
白蛋白、葡萄糖和過氧化氫酶)。_4°C保存?zhèn)溆谩?、菌液的配制將結(jié)核分枝桿菌臨床分離株A于羅氏培養(yǎng)基(市售)培養(yǎng)兩周后， 取部分菌落用液體培養(yǎng)基重懸，加入6-7個3-4mm玻璃珠在漩渦震蕩器上磨菌5 10分鐘，靜置10分鐘后取上層均勻的懸濁液用液體培養(yǎng)基比濁至0. 5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度，將此菌液用7H9液體培養(yǎng)基按1 20稀釋后備用。4、抗結(jié)核藥物的配制用Middle brook 7H9液體培養(yǎng)基配制200微升如下濃度的藥物異煙胼(I，16yg/ml)，利福平(R，32 μ g/ml)，乙胺丁醇(E，128 μ g/ml)，鏈霉素(S， 32 μ /ml)，左氧氟沙星(0FL0,128 μ /ml)，卡那霉素(KAM，160 μ /ml)。5、按照圖1，各實驗孔加入100微升7H9液體培養(yǎng)基。6、按照圖1，各行第一孔加入100微升相應(yīng)的藥物。按照對倍稀釋法稀釋藥物，最終為如圖1所示藥物濃度。7、各實驗孔加入100微升菌液，陰性對照孔(_)加入100微升7H9液體培養(yǎng)基。8、各實驗孔加入20微升0. 02%的刃天青顯色劑，剩下各孔加入200微升無菌水補齊，見圖2。然后37°C恒溫培養(yǎng)7天。9、肉眼觀察顯色情況，陽性對照孔⑴顏色由藍色變?yōu)榉奂t色，陰性對照孔㈠未發(fā)生顏色改變，則開始判讀MIC。將阻止顏色發(fā)生變化的孔所對應(yīng)的藥物濃度定為該藥物的MIC值。如圖3，結(jié)核分枝桿菌臨床分離株A的異煙胼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素、左氧氟沙星、卡那霉素的 MIC 值分別為 0. 25μ g/ml、0. 125 μ g/ml、4 μ g/ml、0. 25 μ g/ml、1 μ g/ml、 2. 5 μ g/ml ο實施例2 1、選擇8個1.5ml無菌離心管備用。2,Middle brook 7H9液體培養(yǎng)基配制取4. 9克Middle brook 7H9培養(yǎng)基干粉， 加入到含900ml蒸餾水的試劑瓶中，充分溶解，121°C高溫滅菌30分鐘。待培養(yǎng)基冷卻至室溫，按照10 1的比例加入營養(yǎng)添加劑0ADC(0. 酪蛋白胨，0.5%甘油，10%油酸、牛血清
白蛋白、葡萄糖和過氧化氫酶)。_4°C保存?zhèn)溆谩?、菌液的配制將結(jié)核分枝桿菌臨床分離株A于羅氏培養(yǎng)基(市售)培養(yǎng)兩周后， 取部分菌落用液體培養(yǎng)基重懸，加入6-7個3-4mm玻璃珠在漩渦震蕩器上磨菌5 10分鐘，靜置10分鐘后取上層均勻的懸濁液用液體培養(yǎng)基比濁至0. 5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度，將此菌液用7H9液體培養(yǎng)基按1 20稀釋后備用。4、抗結(jié)核藥物的配制用7H9液體培養(yǎng)基配制16 μ g/ml的異煙胼200 μ 1。5、如圖4，各管加入100微升7Η9液體培養(yǎng)基。6、如圖4，1號管加入100微升所配制的異煙胼。按照對倍稀釋法從1號管到6號管稀釋藥物，最終各管藥物濃度分別為4μ g/ml、2y g/ml、ly g/ml、0. 5μ g/ml、0. 25 μ g/ ml、0.125 μ g/ml。7、1-6號管加入100微升菌液，7號管加100微升7H9液體培養(yǎng)基作陰性對照，8號管加100微升菌液作陽性對照。8、各管加入20微升0. 02%的孔雀綠顯色劑，如圖5。然后37°C恒溫共培養(yǎng)7天。9、肉眼觀察顯色情況，陽性對照管(8號管)顏色由綠色變?yōu)闊o色，陰性對照管(7 號管)未發(fā)生顏色改變，則開始判讀MIC。將阻止顏色發(fā)生變化的管所對應(yīng)的藥物濃度定為該藥物的MIC值。如圖5，異煙胼的MIC值為1 μ g/ml。實施例3 1、選擇一塊無菌的96微孔板備用。2,Middle brook 7H9液體培養(yǎng)基配制取4. 9克Middle brook 7H9培養(yǎng)基干粉， 加入到含900ml蒸餾水的試劑瓶中，充分溶解，121°C高溫滅菌30分鐘。待培養(yǎng)基冷卻至室溫，按照10 1的比例加入營養(yǎng)添加劑0ADC(0. 酪蛋白胨，0.5%甘油，10%油酸、牛血清
白蛋白、葡萄糖和過氧化氫酶)。_4°C保存?zhèn)溆谩?、菌液的配制將結(jié)核分枝桿菌臨床分離株A于羅氏培養(yǎng)基(市售)培養(yǎng)兩周后， 取部分菌落用液體培養(yǎng)基重懸，加入6-7個3-4mm玻璃珠在漩渦震蕩器上磨菌5 10分鐘，靜置10分鐘后取上層均勻的懸濁液用液體培養(yǎng)基比濁至0. 5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度，將此菌液用7H9液體培養(yǎng)基按1 20稀釋后備用。4、抗結(jié)核藥物的配制用Middle brook 7H9液體培養(yǎng)基配制200微升如下濃度的藥物異煙胼(I，16 μ g/ml)，利福平(R，32 μ g/ml)，乙胺丁醇(E，128 μ g/ml)，鏈霉素(S， 32 μ /ml)，左氧氟沙星(0FL0,128 μ /ml)，卡那霉素(KAM，160 μ /ml)。5、中間電子受體的配制稱取0.014g甲萘醌，溶于IOml 二甲基基亞砜(DMSO)，0. 22 μ m濾膜除菌，4°C保存?zhèn)溆谩?、水溶性四唑鹽WST-8的配制稱取0. 034g WST-8粉末，溶于5ml無菌水蒸餾水， 0. 22 μ m濾膜除菌，4°C保存?zhèn)溆谩?、中間電子受體、四唑鹽混合液的配制第5、6步中配制的WST-8與甲萘醌溶液按照9 1的比例混合，終濃度為IOmM的WST-8和0. 8mM的中間電子受體混合液。5、按照圖1，各實驗孔加入100微升7H9液體培養(yǎng)基。6、按照圖1，各行第一孔加入100微升相應(yīng)的藥物。按照對倍稀釋法稀釋藥物，最終為如圖1所示藥物濃度。7、各實驗孔加入100微升菌液，陰性對照孔㈠加入100微升7H9液體培養(yǎng)基。8、各實驗孔加入20微升WST-8和甲萘醌中間電子受體混合液(反應(yīng)體系中 WST-8、甲萘醌終濃度為ImM和80 μ M)。剩下各孔加入200微升無菌水補齊。然后37°C恒溫培養(yǎng)7天。9、肉眼觀察顯色情況，陽性對照孔⑴顏色由淡黃色(或無色)變成棕色，陰性對照孔(_)未發(fā)生顏色改變，則開始判讀MIC。將阻止顏色發(fā)生變化的孔所對應(yīng)的藥物濃度定為該藥物的MIC值。結(jié)核分枝桿菌臨床分離株A的異煙胼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素、左氧氟沙星、卡那霉素的 MIC 值分別為 0. 25μ g/ml、0. 125 μ g/ml、4 μ g/ml、0. 25μ g/mlUu g/ ml、2.5 μ g/ml。
權(quán)利要求
1.一種分枝桿菌最低抑菌濃度檢測系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 將配制好的50-200微升、濃度為0. 01-400微克/毫升的含藥液體培養(yǎng)基與5-100微升 1 X IO3-I X IO8個/毫升的分枝桿菌菌液、5-50微升顯色劑混合，在30-40攝氏度下恒溫共培養(yǎng)3-14天后，進行顯色檢測，并根據(jù)顯色檢測結(jié)果，判定藥物最低抑菌濃度，其中在混合后，所述顯色劑的終濃度為0. 08-10毫摩爾/升。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將5-50微升的中間電子受體與所述含藥液體培養(yǎng)基、分枝桿菌菌液、顯色劑混合，其中在混合后，所述中間電子受體的終濃度為 10-200微摩爾/升。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述分枝桿菌為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群或非結(jié)核分枝桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其特征在于，所述分枝桿菌菌的制備為采用麥?zhǔn)奖葷岱ɑ蛭舛确ǐ@得一定濃度的菌液，按一定倍數(shù)進行稀釋或不稀釋后備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其特征在于，所述含藥液體培養(yǎng)基的配制是按照倍比稀釋法用液體培養(yǎng)基稀釋藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)載體中配制所述含藥液體培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)載體是不低于2行5列的微孔板、不低于500微升的離心管或不低于5毫升的試管。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基為含有營養(yǎng)添加劑的無菌Middle brook 7H9液體培養(yǎng)基，或其他適合細菌、細胞培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其特征在于，所述藥物為異煙胼、利福平、 鏈霉素、比嗪酰胺、乙胺丁醇、對氨基水楊酸、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素、環(huán)絲氨酸、氧氟沙星、左氧氟沙星、乙硫異煙胺、丙硫異煙胺、莫西沙星、環(huán)丙沙星、加替沙星、司帕沙星、 青霉素鈉、頭孢西丁、頭孢噻肟、阿莫西林、美羅培南、亞胺培南、克拉維酸鉀、紅霉素、羅紅霉素、克拉維酸、妥布霉素、強力霉素、甲硝唑、替硝唑、噻吩-2-羧酸酰胼、對硝基-苯丙酸鈉、或動物、植物、微生物的提取物或發(fā)酵產(chǎn)物、化學(xué)合成的化學(xué)單體。
9.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述中間電子受體為醌類衍生物； 萘醌類衍生物；蒽醌類衍生物；吩嗪類衍生物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述中間電子受體為甲萘醌。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述中間電子受體為甲硫吩嗪或1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯鹽。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其特征在于，所述顯色試劑為刃天青、阿瑪爾藍、孔雀綠、硝酸還原試劑、或能產(chǎn)生水溶性甲臜的四唑鹽類化合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述硝酸還原試劑為硝酸鹽、氨基苯磺胺、或Ν-α-萘)乙烯二胺鹽酸鹽。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述能產(chǎn)生水溶性甲臜的四唑鹽類化合物為XTT或WST系列化合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其特征在于，所述所述顯色檢測的檢測方法為在分光光度計、熒光檢測儀中采用一定波長進行檢測，或直接通過肉眼觀察，通過所獲得的吸光度值或相對吸光度值，或肉眼觀察到顏色的明顯改變情況，判定分枝桿菌的藥物最低抑菌濃度值。
全文摘要
本發(fā)明提供一種分枝桿菌MIC檢測系統(tǒng)的制備方法，其包括以下步驟將配制好的含藥液體培養(yǎng)基與一定體積的分枝桿菌菌液、顯色劑的反應(yīng)體系在一定溫度下恒溫共培養(yǎng)一段時間后，采用一定的檢測方法進行顯色檢測，并根據(jù)顯色檢測結(jié)果，判定藥物最低抑菌濃度。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過一開始將含藥液體培養(yǎng)基、菌液、顯色劑、中間電子受體共培養(yǎng)，省略了現(xiàn)有技術(shù)中的培養(yǎng)一段時間后再開蓋加入顯色劑的步驟，使操作更為簡化，降低了操作污染及生物安全風(fēng)險。本發(fā)明這一檢測體系簡單、安全、低污染、可目視并快速判讀分枝桿菌藥物最低抑菌濃度值。
文檔編號C12Q1/18GK102559844SQ20121000511
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者余曉麗, 孫戰(zhàn)強, 張朝寶, 張舒林, 王洪海 申請人:上海交通大學(xué)