專利名稱：一種從成熟紅麻葉片中提取dna的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物分子生物學領域，涉及一種紅麻DNA研究技術，更具體地涉及一種高質量、高產量的紅麻成熟葉片的DNA提取方法。
背景技術：
紅麻(Kenaf)是錦葵科(Malvaceae)木槿屬OYi^MM) —年生韌皮纖維作物， 公元前4000年的非洲蘇丹就已栽培，紅麻作為天然纖維作物，具有生長速度快、抗逆性強、 適應性廣等特點，巨大的生物產量為樹林的3-4倍，極強的二氧化碳吸收能力為森林的4-5 倍，是發(fā)展低碳經濟的優(yōu)勢作物。紅麻纖維除傳統(tǒng)上作為加工麻繩、麻袋、地毯等的原料外， 還是加工汽車內飾、板材、麻碳等的良好材料，其纖維經變性可與棉花混紡為面料，具有吸濕、透氣、抑菌等生物功能。隨著分子生物學的發(fā)展，通過提取植物DNA進行基因庫構建、基因克隆、遺傳轉化、分子標記等已在各種植物的研究中迅速展開。在這些技術的操作過程中，提取高質量 DNA樣品是必要前提，能夠有效提取高質量DNA，一直是廣大生物技術工作者關心的問題。 棉花、荔枝等植物含有大量的酚類物質及其次生代謝物質，在DNA提取過程中通常會受到這些次生代謝物質的干擾，影響DNA的質量和產量，因此對這類植物進行DNA分離時，其提取緩沖液和分離步驟應有相應的變化(王珍，方宣鈞，2003)、(郭安平，黃明等，1997)。紅麻成熟葉片中含有多糖、多酚及其他次生代謝產物，這些次生物質在DNA提取過程中常與核酸形成復合物，形成粘稠的膠狀物質，并產生不同程度的褐化，對酶切、PCR擴增等操作產生不良影響，從而不能用于分子生物學研究。而成熟紅麻葉片含有較多多糖、 多酚及其他次生代謝產物，加大了 DNA提取的難度。另外，紅麻雖是自花授粉作物，但在繁種生產中常出現(xiàn)自然雜交株，難以保持品種的特性和純度(何凡，1989)。因此，為確保所提取的紅麻DNA純度，必須根據(jù)紅麻生長期內純合的植株葉片為材料，而不是幼苗期的葉片。目前，有關紅麻基因組DNA提取方法的報道較少，且均以幼嫩、新鮮葉片為試材(徐建堂等，2007;郭安平等，1997)，對成熟、干燥葉片的DNA進行提取的研究雖也有報道(曹德菊， 1999 ；白鳳虎，2007)，但由于步驟操作復雜，嚴重影響了紅麻DNA的提取效率。

發(fā)明內容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種高效、穩(wěn)定地從成熟紅麻葉片中提取DNA 的方法。本發(fā)明的目的通過如下技術方案實現(xiàn)
稱取紅麻成熟葉片l.og，用液氮迅速研磨至粉末狀，將粉末裝入IOml離心管中，管中加入:3ml 65°C預熱的重量比為4%CTAB提取緩沖液，重量比為3%抗氧化劑β -巰基乙醇； 然后冷卻至室溫，加入等體積的氯仿與異戊醇混合液，混合液中氯仿/異戊醇按體積比為 24/1，輕柔顛倒混勻IOmin ； 1200rpm離心IOmin ；吸取上清液轉入IOml離心管中，依次加入1/3體積的3 mol/L NaAc溶液及等體積_20°C預冷的無水乙醇，混勻，冰上沉淀30min ；于1200rpm離心IOmin ；將沉淀移入1. 5ml離心管中，用75%無水乙醇漂洗;3min，重復1次； 將沉淀真空抽干或于室溫下吹干，加入100 μ 1 TE溶解沉淀，進行DNA純化或放入-20°C冰箱保存?zhèn)溆?。所提取的DNA條帶清晰，用于分子標記研究，或紅麻葉綠體DNA和線粒體DNA 的擴增研究。本發(fā)明的顯著優(yōu)點
紅麻成熟葉片中富含多糖、色素、酚類等次生代謝物質，這些物質極易引起紅麻DNA褐化、降解，嚴重影響了后續(xù)的PCR擴增及條帶亮度。本發(fā)明操作步驟簡單，節(jié)省了 DNA提取時間，在磨樣后于提取液中加入了 3% β-巰基乙醇，可有效防止紅麻樣品的色素、酚類和醌類等次生代謝物質的氧化干擾，同時在第一次離心后得到的上清液加入1/3體積的3 mol/L NaAc (pH4. 8)，有利于變性的紅麻DNA凝聚而沉淀，提高了紅麻基因組DNA的產量。本發(fā)明優(yōu)化的紅麻成熟葉片DNA提取方法重復性好、實驗結果較穩(wěn)定、瓊脂糖電泳條帶清晰。本發(fā)明操作步驟簡單，節(jié)省了 DNA提取時間，從而有效防止DNA氧化而造成的損失，提高DNA的提取產量，本發(fā)明為進一步開展紅麻及其麻類的基因組學的研究奠定工作基礎。


圖1兩種方法獲得的紅麻DNA的1.0%瓊脂糖凝膠電泳圖；1-8泳道SDS法獲得的紅麻福紅952 DNA ；9-18泳道CTAB法獲得紅麻福紅952 DNA。圖2本發(fā)明改良的CTAB方法的紅麻DNA RAPD擴增結果，泳道1_12分別表示來自福建農林大學麻類遺傳育種與綜合利用研究室保存的12個紅麻品種。12個品種分別是 福紅 952、8 個福紅航 952 突變體后代 P4-4，P4-18，P441, P442, P443, P410, P411, P412，福紅 951，08CCV-76，塔什干。圖3引物cp3擴增結果。圖4引物mt4擴增結果。
具體實施例方式本發(fā)明具體實施步驟如下
1. 1紅麻成熟葉片DNA提取方法步驟改良SDS法
(1)分別稱取紅麻品種福紅952成熟葉片各1. 0g，用液氮迅速研磨1-2遍至粉末狀， 將粉末裝入IOml離心管中，每管中加入:3ml 65°C預熱的SDS抽提緩沖液(100 mmoL/L Tris-HCl (pH8. 0),0.5 mol / L NaC 1,20 mmol/L EDTA (pH 8. 0))，每管分別加入不同 CTAB 濃度和抗氧化劑組合，8個不同CTAB濃度和抗氧化劑組合如下。
權利要求
1.一種從成熟紅麻葉片中提取DNA的方法，其特征在于所述方法的具體步驟如下稱取紅麻成熟葉片1. 0g，用液氮迅速研磨至粉末狀，將粉末裝入IOml離心管中，管中加入:3ml 65°C預熱的重量比為4%CTAB提取緩沖液，重量比為3%抗氧化劑β-巰基乙醇；然后冷卻至室溫，加入等體積的氯仿與異戊醇混合液，混合液中氯仿/異戊醇按體積比為對/1，輕柔顛倒混勻IOmin ； 1200rpm離心IOmin ；吸取上清液轉入IOml離心管中，依次加入1/3體積的3 mol/L NaAc溶液及等體積_20°C預冷的無水乙醇，混勻，冰上沉淀30min ；于1200rpm 離心IOmin ；將沉淀移入1. 5ml離心管中，用75%無水乙醇漂洗3min，重復1次；將沉淀真空抽干或于室溫下吹干，加入100 μ 1 TE溶解沉淀，進行DNA純化或放入-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 2.如權利要求1所述的從成熟紅麻葉片中提取DNA的方法，其特征在于，所提取的DNA 條帶清晰，用于分子標記研究，或紅麻葉綠體DNA和線粒體DNA的擴增研究。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物分子生物學領域，具體涉及一種高效、穩(wěn)定地從成熟紅麻葉片中提取DNA的方法。本發(fā)明結合紅麻成熟葉片中含多糖、多酚的特性，在已有的紅麻基因組DNA提取方法上，對紅麻葉片CTAB法提取基因組DNA提取方法進行改進和優(yōu)化。運用本發(fā)明的方法能獲得紅麻基因組DNA條帶清晰，無拖帶，OD260/OD280為1.7-1.9，酶切完全，其質量、產量都高于改良SDS法，可用于擴增葉綠體DNA和線粒體DNA。此發(fā)明為進一步開展紅麻及其麻類的基因組學及亞細胞基因組組學的研究奠定工作基礎。
文檔編號C12N15/10GK102533729SQ20121000599
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月11日 優(yōu)先權日2012年1月11日
發(fā)明者徐建堂, 方平平, 林培清, 林荔輝, 池仁漫, 祁建民, 陳濤, 陶愛芬 申請人:福建農林大學