專利名稱：利用大腸桿菌產(chǎn)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶高效合成L-茶氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用大腸桿菌產(chǎn)Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶高效合成 L-茶氨酸的方法。
背景技術(shù)：
L-茶氨酸(N-乙基-Y-谷氨酰胺，theanine)是一種天然的氨基酸，是茶葉中的特征氨基酸，也是茶葉中有效的呈味物質(zhì)。L-茶氨酸主要用于(1)作為一種新興的食品添加劑，可用作為茶飲料的品質(zhì)改良劑、改善食品風(fēng)味的添加劑、功能食品的添加劑、“情緒食品”的添加劑等；已在歐美、日本、中國臺灣等國家、地區(qū)廣泛使用。如日本已開發(fā)出添加茶氨酸的巧克力、果凍、布丁、口香糖、保健茶和各種清涼飲料。(2)作為醫(yī)藥中間體領(lǐng)域，茶氨酸可以用作抗腫瘤、降血壓、安神鎮(zhèn)靜、抗疲勞等藥物中。此外L-茶氨酸現(xiàn)已作為鎮(zhèn)靜劑中的有效成分，對帕金森氏癥、老年性癡呆、傳導(dǎo)神經(jīng)功能紊亂等疾病起預(yù)防效果。L-茶氨酸的生產(chǎn)方法主要有茶葉提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵酶轉(zhuǎn)化法。(1) 茶葉提取法由于茶葉中茶氨酸的含量不高，從茶葉提取茶氨酸無法實(shí)際生產(chǎn)價(jià)值。所以植物提取法實(shí)際上是從提取茶多酚后的殘留液中用離子交換樹脂法提取茶氨酸。缺點(diǎn)是生產(chǎn)工序復(fù)雜、產(chǎn)品純度低、產(chǎn)量小、價(jià)格高。(2)化學(xué)合成L-茶氨酸需要高溫、高壓及化學(xué)催化劑等條件，反應(yīng)條件要求比較高，副產(chǎn)物多，且產(chǎn)生的都是DL-型消旋體，還需要進(jìn)行拆分才能得到L-型產(chǎn)品。因此，消旋體的拆分是制約茶氨酸的化學(xué)合成法的主要因素。由于化學(xué)合成方法在解決手性方面有一定難度，因此會使成本提高以及質(zhì)量難以控制，且易混雜有毒物質(zhì)，產(chǎn)品不宜用于食品行業(yè)應(yīng)用，同時(shí)生產(chǎn)工藝復(fù)雜，且易造成環(huán)境污染。(3)微生物發(fā)酵酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)的L-茶氨酸都是L型的，且生產(chǎn)成本低，可大量生產(chǎn)，由于生物酶法合成具有高度的專一性，所以在產(chǎn)品質(zhì)量方面更接近天然的L-茶氨酸，其發(fā)展前景非常廣闊。此外酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-茶氨酸還具有純度高、副產(chǎn)物少、純化步驟少、生產(chǎn)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，因此微生物發(fā)酵酶轉(zhuǎn)化法是目前國內(nèi)外研究人員公認(rèn)的最直接、最經(jīng)濟(jì)的L-茶氨酸生產(chǎn)方法。利用微生物發(fā)酵酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-茶氨酸的酶主要有谷氨酰酶和Y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，本實(shí)驗(yàn)是研究利用大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)Y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，專利號為200910035096. 4的文件中公開了“高效轉(zhuǎn)化谷氨酰胺合成L-茶氨酸的大腸桿菌菌株及其應(yīng)用”，所述的“大腸桿菌”是指大腸桿菌(Escherichia coli )南師一號CCTCC No. M209166，該大腸桿菌高產(chǎn)茶氨酸合成酶，高效轉(zhuǎn)化谷氨酰胺和乙胺為L-茶氨酸；大腸桿菌(Escherichia coli)南師一號CCTCC No. M209166的原始發(fā)酵液的制備方法參見該文件說明書第4頁中的實(shí)施例2，包括如下步驟(1)將大腸桿菌南師一號接種于LB固體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，瓊脂15g，37°C培養(yǎng)12h，(2)挑單菌落接種于IOml LB液體培養(yǎng)基， 每升培養(yǎng)基含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去離子水定容至1升，37°C震蕩培養(yǎng)12h，(3)然后接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)1 后獲得大腸桿菌(Escherichia coli)南師一號CCTCC No. M209166的原始發(fā)酵液。
上述發(fā)酵液中Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶是在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，60%的Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶分泌到細(xì)胞外，40%的Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶仍在細(xì)胞內(nèi)，為了充分利用細(xì)胞內(nèi)的酶，有人在發(fā)酵末期離心收集菌體，然后破壁收集酶液，目前國際上報(bào)道的主要采用煮沸、凍融、酶解、 超聲波等破壁方式，使微生物菌體破碎釋放出酶液；這些破壁方式操作工藝復(fù)雜、耗時(shí)、耗能、還會引進(jìn)雜質(zhì)，更壞的是會降低酶的活性，使L-茶氨酸的轉(zhuǎn)化率降低；另外一種方法是在反應(yīng)過程中通過加入過量乙胺，以利于酶反應(yīng)的進(jìn)行，然后加入鹽酸回調(diào)PH，然而這種回調(diào)PH方式會消耗大量鹽酸，大量的鹽酸會對金屬反應(yīng)器造成很大的腐蝕，同時(shí)引進(jìn)雜質(zhì)氯離子，這為后期的分離帶來很到的困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種簡單高效、低耗能、不引進(jìn)雜質(zhì)的利用大腸桿菌產(chǎn)Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶高效合成L-茶氨酸的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
利用大腸桿菌產(chǎn)Y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶高效合成L-茶氨酸的方法，包括如下步驟
a)將大腸桿菌(Escherichiacoli)南師一號CCTCCNo. M209166的原始發(fā)酵液利用孔徑為0. 001-0. Olum的超濾膜進(jìn)行過濾，得到酶和菌體的截留液；
b)往酶和菌體的截留液中加入乙胺溶液調(diào)節(jié)pH至10-11，放置2-3小時(shí)使菌體解體釋放出細(xì)胞內(nèi)的Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，得到酶濃縮液；
c)取步驟b)中得到的酶濃縮液加入到含有L-谷氨酰胺的水溶液中形成酶反應(yīng)體系，然后通過往酶反應(yīng)體系中加入乙胺溶液控制酶反應(yīng)體系的PH為9-10. 5，酶轉(zhuǎn)化溫度為 30-；35 "C。作為改進(jìn)，步驟a)中超濾膜的操作壓力為0. 15-0. 45MPa，溫度為30_35°C。作為改進(jìn)，步驟b)和步驟c)中所使用的乙胺溶液的質(zhì)量濃度為50-70%。作為改進(jìn)，步驟c)中的酶反應(yīng)體系中L-谷氨酰胺的濃度為40_50g/L。作為改進(jìn)，步驟c)中的酶反應(yīng)體系中酶活力為4000-6000 U/L。作為改進(jìn)，步驟c)中的酶轉(zhuǎn)化時(shí)間為12-14小時(shí)。本發(fā)明與現(xiàn)有的方法相比具有如下優(yōu)點(diǎn)
1、利用超濾膜截留微生物菌、Y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶；操作簡單且易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，收率高， 酶含量高，耗能少，污染物少。2、通過乙胺溶液調(diào)節(jié)pH使大腸桿菌細(xì)胞解體釋放Y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，與采用煮沸、凍融、酶解、超聲波等破壁獲取酶液的方式相比，具有操作簡單、耗時(shí)少、耗能少、還避免了引進(jìn)雜質(zhì)和Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的失活。3、在酶的轉(zhuǎn)化過程中采用底物乙胺溶液控制pH，避免了先加入底物乙胺再用鹽酸回調(diào)PH后引入雜質(zhì)和腐蝕反應(yīng)器。4、利用本發(fā)明所述的合成L-茶氨酸的方法，提高了 L-谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)品的純度、降低了成本。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1CN 102533887 Aa)取大腸桿菌(Escherichiacoli)南師一號CCTCC No. M209166的原始發(fā)酵液100 升，選用0. 5m2孔徑為0. 001-0. Olum的管式超濾膜，在操作壓力為0. 3Mpa,溫度為35°C的條件下進(jìn)行過濾，當(dāng)截留液體積約15L時(shí)，加IOL純化水稀釋后再過濾一次，得到酶和菌體的截留液10升，經(jīng)Y-萘胺比色法檢測酶活力為100000U/L;
b)然后向酶和菌體的截留液中加入質(zhì)量濃度為70%的乙胺水溶液使pH維持在11，放置2小時(shí)使菌體解體釋放出細(xì)胞內(nèi)的Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，得到酶濃縮液，經(jīng)Y-萘胺比色法檢測酶濃縮液的酶活力為138000U/L ；
c)取步驟b)中得到的酶濃縮液3.62升加入到96. 38升的L-谷氨酰胺水溶液中形成酶反應(yīng)體系，酶反應(yīng)體系中含L-谷氨酰胺4kg，然后往酶反應(yīng)體系中加入質(zhì)量濃度為50% 的乙胺水溶液控制PH為10.5，酶轉(zhuǎn)化溫度為30°C，酶轉(zhuǎn)化時(shí)間為12小時(shí)，所得酶轉(zhuǎn)化液經(jīng)高效液相-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)檢測，L-茶氨酸的產(chǎn)量為25. 4g/L，產(chǎn)率提高了 41. 1%。實(shí)施例2
a)取大腸桿菌(Escherichiacoli)南師一號CCTCC No. M209166原始發(fā)酵液100升， 選用0. 5m2孔徑為0. 001-0. Olum的管式超濾膜，在操作壓力為0. 15Mpa,溫度為30°C的條件下進(jìn)行過濾，當(dāng)截留液體積約15L時(shí)，加IOL純化水稀釋后再過濾一次，得酶和菌體的截留液10升，經(jīng)Y-萘胺比色法檢測酶活力為105000U/L;
b)然后向酶和菌體的截留液中加入質(zhì)量濃度為60%的乙胺水溶液使pH維持在10.5， 放置3小時(shí)使菌體解體釋放出細(xì)胞內(nèi)的Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，得到酶濃縮液，經(jīng)Y-萘胺比色法檢測酶濃縮液的酶活力為140000U/L ；
C)取步驟b)中得到的酶濃縮液2. 86升加入到97. 14升的L-谷氨酰胺水溶液中形成酶反應(yīng)體系，酶反應(yīng)體系中含中含L-谷氨酰胺4. ^g，然后往酶反應(yīng)體系中加入質(zhì)量濃度為70%的乙胺水溶控制PH為10，酶轉(zhuǎn)化溫度為33°C，酶轉(zhuǎn)化時(shí)間為13小時(shí)，所得酶轉(zhuǎn)化液經(jīng)高效液相-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)檢測，L-茶氨酸的產(chǎn)量為25. 8g/L，產(chǎn)率提高了 43. 3%。實(shí)施例3
a)取大腸桿菌(Escherichiacoli)南師一號CCTCC No. M209166原始發(fā)酵液100升， 選用0. 5m2孔徑為0. 001-0. Olum的管式超濾膜，在操作壓力為0. 45Mpa,溫度為33°C的條件下進(jìn)行過濾，當(dāng)截留液體積約15L時(shí)，加IOL純化水稀釋后再過濾一次，得酶和菌體的截留液10升，經(jīng)Y-萘胺比色法檢測酶活力為110000U/L;
b)然后向酶和菌體的截留液中加入質(zhì)量濃度為50%的乙胺水溶液使pH維持在10，放置2小時(shí)使菌體解體釋放出細(xì)胞內(nèi)的Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，得到酶濃縮液，經(jīng)Y-萘胺比色法檢測酶濃縮液的酶活力為145000U/L ；
c)取步驟b)中得到的酶濃縮液4.14升加入到95. 86升的L-谷氨酰胺水溶液中形成酶反應(yīng)體系，酶反應(yīng)體系中含中含L-谷氨酰胺證^，然后往酶反應(yīng)體系中加入質(zhì)量濃度為 60%的乙胺水溶液控制PH為9，酶轉(zhuǎn)化溫度為35°C，酶轉(zhuǎn)化時(shí)間為14小時(shí)，所得酶轉(zhuǎn)化液經(jīng)高效液相-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)檢測，L-茶氨酸的產(chǎn)量為26. lg/L，產(chǎn)率提高了 45%。本發(fā)明的酶轉(zhuǎn)化時(shí)間為12-14個(gè)小時(shí)，改進(jìn)前的方法為取大腸桿菌(Escherichia coli)南師一號CCTCC No. M209166的原始發(fā)酵液100升，所述的原始發(fā)酵液與實(shí)施例中的原始發(fā)酵液相同，對原始發(fā)酵液采取離心收集菌體、然后用均質(zhì)儀機(jī)械破壁釋放胞內(nèi)酶、在酶反應(yīng)過程中先加過量乙胺再用鹽酸回調(diào)PH，該方法L-茶氨酸的產(chǎn)量為 18g/L ；與改進(jìn)前的方法相比，本發(fā)明L-茶氨酸的產(chǎn)量達(dá)到25g/以上，產(chǎn)率提高了 40%以上，酶轉(zhuǎn)化時(shí)間縮短了 6-8個(gè)小時(shí)。
權(quán)利要求
1.利用大腸桿菌產(chǎn)Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶高效合成L-茶氨酸的方法，其特征在于包括如下步驟a)將大腸桿菌(Escherichiacoli)南師一號CCTCCNo. M209166的原始發(fā)酵液利用孔徑為0. 001-0. Olum的超濾膜進(jìn)行過濾，得到酶和菌體的截留液；b)往酶和菌體的截留液中加入乙胺溶液調(diào)節(jié)pH至10-11，放置2-3小時(shí)使菌體解體釋放出細(xì)胞內(nèi)的Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，得到酶濃縮液；c)取步驟b)中得到的酶濃縮液加入到含有L-谷氨酰胺的水溶液中形成酶反應(yīng)體系，然后通過往酶反應(yīng)體系中加入乙胺溶液控制酶反應(yīng)體系的PH為9-10. 5，酶轉(zhuǎn)化溫度為 30-；35 "C。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用大腸桿菌產(chǎn)Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶高效合成L-茶氨酸的方法，其特征在于所述步驟a)中超濾膜的操作壓力為0. 15-0. 45MPa，溫度為30_35°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用大腸桿菌產(chǎn)Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶高效合成L-茶氨酸的方法，其特征在于所述步驟b)和步驟c)中所使用的乙胺溶液的質(zhì)量濃度為50-70%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用大腸桿菌產(chǎn)Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶高效合成L-茶氨酸的方法，其特征在于步驟c)中的酶反應(yīng)體系中L-谷氨酰胺的濃度為40-50g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用大腸桿菌產(chǎn)Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶高效合成L-茶氨酸的方法，其特征在于步驟c)中的酶反應(yīng)體系中酶活力為4000-6000 U/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用大腸桿菌產(chǎn)Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶高效合成L-茶氨酸的方法，其特征在于步驟c)中的酶轉(zhuǎn)化時(shí)間為12-14小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用大腸桿菌產(chǎn)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶高效合成L-茶氨酸的方法，包括如下步驟a)將大腸桿菌原始發(fā)酵液利用孔徑為0.001-0.01um的超濾膜進(jìn)行過濾；b)往酶和菌體的截留液中加入乙胺溶液調(diào)節(jié)pH至10-11，放置2-3小時(shí)得到酶濃縮液；c)取步驟b)中得到的酶濃縮液加入到含有L-谷氨酰胺的水溶液中形成酶反應(yīng)體系，然后通過往酶反應(yīng)體系中加入乙胺溶液控制酶反應(yīng)體系的pH為9-10.5，酶轉(zhuǎn)化溫度為30-35℃。該方法具有操作簡單、耗時(shí)耗能少、避免了引進(jìn)雜質(zhì)和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的失活，避免了鹽酸的引入而腐蝕反應(yīng)器，提高了L-茶氨酸的產(chǎn)率和純度、降低了成本。
文檔編號C12P13/04GK102533887SQ20121000717
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者萬紅貴, 呂志祥, 徐大春, 殷志敏, 沈青紅, 王漢領(lǐng) 申請人:江蘇阿格羅生物科技有限公司