專利名稱：一種灰色鏈霉菌海藻糖合成酶基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程和現(xiàn)代酶工程技術領域，具體涉及一種來灰色鏈霉菌的海藻糖合成酶基因，該基因表達的海藻糖合成酶可以用于生產(chǎn)海藻糖。
背景技術：
海藻糖是由兩分子葡萄糖以α，α-1,1糖苷鍵相連而成的非還原性二糖，廣泛地存在于微生物、蝦類、釀酒酵母、蘑菇及各種真菌、昆蟲、植物等。外源性的海藻糖同樣對生物體及生物大分子、生物膜具有良好的非特異性保護作用，它可以保護細胞免受由于環(huán)境變化(如脫水、高滲)變化后造成的損害，具體表現(xiàn)為對生物膜、蛋白質和DNA等的有效保護，因此被譽為“生命之糖”。天然中海藻糖的含量很低，過去主要是從干酵母中提取，由于含量低，提取過程較復雜，成本極高。如此昂貴的海藻糖只能局限于某些特殊領域如醫(yī)學生物制品的活性保持的應用，隨著人類社會的發(fā)展和進步，希望能將海藻糖應用于日常生活所常用各類食品的鮮味保持與質地改善，更好提高人們的生活和健康水平，因此必須要盡快地找到廉價而高效的海藻糖制造方法。目前已經(jīng)在多種微生物中分離到多種不同類型的海藻糖合成酶及其相關的基因，目前發(fā)現(xiàn)的海藻糖合成相關酶和基因表明，微生物中合成海藻糖的途徑可以分為三種途徑，第一種途徑是海藻糖磷酸化酶合成途徑，主要由徑6-磷酸海藻糖合成酶 (Trehalose-6-phosphate synthase)禾口 6_ 憐酸海藻糖酉旨 (Trehalose-6-phosphate phosphatase)組成，首先由6磷酸海藻糖合成酶催化UDP-葡萄糖和6_磷酸葡萄糖合成 6-磷酸海藻糖，然后再由6磷酸海藻糖酯酶脫磷酸后得到海藻糖；第二種途徑是麥芽寡糖基海藻糖合成酶合成途徑，主要是由麥芽寡糖基海藻糖合成酶(Maltooligosyltrehlosen， MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyltrehalose trehalohydrolase, MTHase)組成，先由麥芽寡糖基海藻糖合成酶以麥芽糊精(Maltodextrin)為底物，通過分子內轉糖基作用把麥芽糊精末端的兩個葡萄糖分子間的α，α_1，4糖苷鍵轉變成α， α-1，1糖苷鍵，形成麥芽寡糖基海藻糖(Maltooligosyltrehalose)。然后麥芽寡糖基海藻糖在麥芽寡糖基海藻糖水解酶的催化下從麥芽寡糖基海藻糖分子上水解下一個海藻糖分子，而原來的麥芽糊精則轉變?yōu)闇p少了兩個葡萄糖基的新寡糖，并可作為新的底物進行下一輪反應，如此反復就可以將麥芽糊精轉化成海藻糖；第三種途徑是海藻糖合成酶途徑，與其它海藻糖合成途徑不同是這種途徑只有一種酶即海藻糖合成酶(Trehalose synthase, Tre S)組成，它作用的底物是麥芽糖(Maltose)，通過催化麥芽糖分子內轉糖基，將α， α-1，4糖苷鍵連接的麥芽糖轉化為α，α_1，1糖苷鍵，麥芽糖轉變成海藻糖。第一種途徑需要用到價格昂貴的高能磷酸化合物UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖為底物來生產(chǎn)海藻糖， 在生產(chǎn)成本很難產(chǎn)生競爭優(yōu)勢，第二種和第三種途徑是以淀粉的水解產(chǎn)物麥芽糊精或者麥芽糖為底物生產(chǎn)海藻糖，具有很強的競爭優(yōu)勢，第三種途徑和第二種途徑相比，第三種途徑只需要一種酶，因此在利用基因工程菌生產(chǎn)酶時不需構建兩種工程菌，在生產(chǎn)過程設備的占用率會更低，而且不需要考慮兩種酶的反應條件是否一致，這樣可以使生產(chǎn)工藝上會更簡單，因而具有更強的競爭優(yōu)勢。目前已有不少文獻和專利報道了海藻糖合成相關基因的克隆和分離，以及這些海藻糖合成酶基因的相關酶用于制備海藻糖，但這些海藻糖合成相關酶的合成途徑不同，或者菌種來源不同，導致了 DNA序列和氨基酸序列相差甚遠，酶的分子量、酶學特性以及酶對底物的轉化率，而且目前都還沒有得到工業(yè)規(guī)模化的應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種灰色鏈霉菌海藻糖合成酶基因及其應用，在轉化麥芽糖生成海藻糖時能產(chǎn)生較高的海藻糖及產(chǎn)生較少的葡萄糖，并能避免生產(chǎn)過程中水和原料中金屬離子對酶活力的抑制，有利于提高生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。本發(fā)明人利用生物信息手段對GenBank中龐大的DNA序列和氨基酸序列資源進行同源性檢索分析，對已經(jīng)完成序列分析的上千種微生物的DNA序列進行大量核酸序列進行分析和對比，發(fā)現(xiàn)了在蛋白質的序列數(shù)據(jù)庫Genbank中注釋為“未知蛋白”或“推測是某功能蛋白質”的極為有用基因，推測該序列的功能，然后找到候選基因序列然后進行實驗的功能鑒定，最終確定基因的功能和性質，其中包括至今為止人們并未發(fā)現(xiàn)的海藻糖合成酶基因(treS)，并用這種合成酶基因經(jīng)過克隆和進行重組表達，再利用重組表達的海藻糖合成酶用于轉化麥芽糖生產(chǎn)海藻糖。本發(fā)明人在研究海藻糖合成酶的過程中，對灰色鏈霉菌(Sti^ptomyces griseus subsp. griseus)基因組序列進行同源檢索分析，發(fā)現(xiàn)這一段尚未有文獻報道其功能的 DNA序列，這段DNA序列在Genbank中被注釋為“假定的海藻糖合成酶基因”(putat i ve trehalose synthase)。經(jīng)過分析這段DNA與已經(jīng)有文獻報道的海藻糖合成酶、糖苷酶、淀粉酶家族蛋白的基因都有較高的同源性，同源性達到75%以上，而其編碼的假定的蛋白質的氨基酸序列與已發(fā)表的海藻糖合成酶、糖苷酶、淀粉酶家族蛋白的氨基酸也有較高同源性，氨基酸同源性達到80%以上，所以很難通過氨基酸序列的對比分析確定其為何種酶，必須要經(jīng)過具體實驗來驗證這段基因的功能是屬于何種酶。本發(fā)明所述的海藻糖合成酶基因克隆自灰色鏈霉菌(Sti^ptomyces griseus subsp. griseus)，菌株編號為4. 1419，該菌種可以從中國微生物保藏中心購買，也可以通過野外采集和其他途徑獲得?；疑溍咕?Sti^ptomyces griseus subsp. griseus)克隆得到的海藻糖合成酶具有以下特征1、分子量約為66. IkD2、等電點約為PI = 4. 803、酶的最適反應溫度為25 ;35°C4、酶的反應的pH在6. 5 7. 5，優(yōu)選pH為7. 0 7. 55、二價金屬離子的濃度在5m mol/L時，除了 Cu2+對酶活有明顯的抑制作用和Zn2+ 有輕微的抑制作用以外，而其它狗3+、K1+、Ca2+、Mn2+、Fe2+和Ba2+對酶活沒有抑制作用。6、在pH7. 5和25°C最佳的反應條件下，反應1. 5h后產(chǎn)物中海藻糖含量達到最大 87. 14%，葡萄糖3. 84%，麥芽糖8. 99%，隨著反應時間的增加海藻糖和麥芽糖的含量都會減少，而葡萄糖的含量會增加，但在5個小時變化不大。
本發(fā)明人所采用的實驗方法，包括眾所周知的聚合酶鏈式反應(PCR)技術；DNA的提取、酶切、連接等DNA分子操作技術，把這一段標記為假定的海藻糖合成酶基因的DNA序列連接到表達載體上，如pET5a、pSE380等表達質粒上，然后導入大腸桿菌進行高效表達， 經(jīng)過細胞破碎，例如利用溶菌酶、超聲波或機械碾磨法等破碎細胞后，獲得該基因表達的目的蛋白進行研究，確定其功能和酶學特性，證實了這一段“假定蛋白質”編碼的是一種特性特征與前人發(fā)現(xiàn)的完全不同的海藻糖合成酶。這些不同的特性特征包括了氨基酸序列和 DNA序列的不同，酶的分子大小不同，酶的最適反應溫度最適pH不同，反應條件的不同以及酶對底物麥芽糖轉化為海藻糖比例的差異等特性，因此判定是一種新的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明所述的海藻糖合成酶的基因是克隆灰色鏈霉菌(Sti^ptomyces griseus subsp. griseus)，該酶在天然的灰色鏈霉菌中是一種胞內酶，需要用細胞破碎的方法才能檢查到；而且在天然菌中該酶的含量也非常低，需要將培養(yǎng)液濃縮1000倍濃縮以上才能檢驗到海藻糖合成酶的活力。應用基因工程菌來表達本發(fā)明所述的海藻糖合成酶基因，可以使酶的活力比天然菌株高數(shù)千倍，可以用于海藻糖的生產(chǎn)。編碼本發(fā)明所述的海藻糖合成酶的基因(treS)是一段未確定功能的DNA片段，長度為1698個堿基對，編碼569個氨基酸，GC含量為65. 85%。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有實質性特點和顯著的優(yōu)勢1.同樣具有轉化麥芽糖生成海藻糖的功能，但具有較小的分子量只有568個氨基酸，與日本林原研究所專利報道的來自Pimerlobacter sp. R48的海藻糖合成酶的625個氨基酸相比，本發(fā)明的海藻糖合成酶的氨基酸個數(shù)少了 57個，比同樣是林原研究所報道的來自水棲嗜熱菌iThermus aquaticus的海藻糖合酶的964少了 395個氨基酸，與中國專利 ZL204410013007. 3報道的Thermobifida fusca海藻糖合成酶的611個氨基酸相比少了 43個氨基酸，小分子的蛋白質酶更容易地通過基因重組與表達技術來進行工業(yè)化生產(chǎn)重組酶，因而更有市場競爭力。2.轉化麥芽糖生成海藻糖時能產(chǎn)生較高的海藻糖及產(chǎn)生較少的葡萄糖，目前報道的海藻合成酶基因在轉化麥芽糖，隨著反應溫度的提高，會產(chǎn)生較多葡萄糖副產(chǎn)物，大多會產(chǎn)生10-30%的葡萄糖，反應產(chǎn)物海藻糖糖的含量一般在65%左右，而本發(fā)明的海藻糖合成酶與已經(jīng)報道的海藻糖合成酶相比具有反應產(chǎn)物中海藻糖含量高和較低葡萄糖副產(chǎn)物的特點，反應速度快，在25°C的反應溫度時，反應1. 5個小時海藻糖含量可以達到87. 14% 以上，而葡萄糖含量約為3. 84 %，麥芽糖為8. 99 %，這是目前文獻公開報道海藻產(chǎn)量最高的海藻糖合成酶，這就有利于提干底物的轉化效率獲得更高的海藻糖，從而可以降低生產(chǎn)成本，更具有市場競爭力。3.本發(fā)明的海藻糖合成酶除了 Cu2+對酶活力有明顯的抑制作用外，而其它金屬離子Si2+、i^3+、K1+、Ca2+、Mn2+Je2+和Ba2+對酶活都沒有明顯的抑制作用，這可以降低酶在生產(chǎn)中對水和淀粉麥芽糖糖漿純度的要求，避免生產(chǎn)過程中水和原料中金屬離子對酶活力的抑制，有利于提高生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。


圖1是pH對酶活力的影響曲線圖。圖2是溫度對酶活力的影響曲線圖。
圖3是金屬離子對酶活力的影響曲線圖。圖4是反應1. 的HPLC分析結果圖。圖5為不同時間對產(chǎn)物中各種糖含量的影響曲線圖。
具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步說明，下述實驗和實例所述內容屬于本發(fā)明的主要內容，但并不僅僅限于這些內容，有些對本領域專業(yè)人員來說顯而易見的擴展內容雖然并未在本說明書中出現(xiàn)，但也應屬于本發(fā)明的專利請求范圍。1.灰色鏈霉菌的培養(yǎng)灰色鏈霉菌(Sti^ptomyces griseus subsp. griseus)菌株編號為 4. 1419，從中國微生物保藏中心購買，接種于以下培養(yǎng)基(克/升)葡萄糖4. 0克，酵母提取物10克，麥芽提取物10克L，用KOH調pH至7. 2，然后在25 30°C恒溫搖床上振蕩48小時，用于總DNA 的提取。2.灰色鏈霉菌海藻糖合成酶基因(treQ的克隆、表達及粗酶的制備根據(jù) Genbank 中公布的灰色鏈霉菌(Str印tomyces griseus subsp. griseus)基因序列中注釋為可能為海藻糖合成酶基因的序列，命名為Sgu，設計相應引物擴增該基因并連接到表達載體上然后導入大腸桿菌進行表達，設計引物如下上游引物(Senseprimer) 5' -CTCCATGGTCGTCAATGAGCCTGCAC-3‘下游引物(AntisensePrimer) 5' -TCAAGCTTTCAGGCGGGCGGCGCGTC-3‘上下游引物的5'端分別設計了的Ncol和Hind III酶切位點用于連接到表達載體PSE380上，用設計好的引物擴增可能為海藻糖合成酶基因的序列的DNA序列Sgu，擴增產(chǎn)物用試劑盒純化回收目的擴增片段，然后利用Ncol和Hind III進行雙酶切，與同樣利用 Ncol和Hind III進行雙酶切的表達載體pSE380進行連接，然后經(jīng)過篩選驗證得到Sgu基因的表達重組質粒pSE380-Sgu。把重組的表達質粒pSE380_Sgu轉化到大腸桿菌BL21菌株的感受態(tài)細胞中，挑取轉化子于LB液體培養(yǎng)基中，在37°C搖床中培養(yǎng)，當0D600達到0. 8左右時，加入IPTG使其終濃度達到0. 5mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)20h進行誘導表達。誘導表達培養(yǎng)好的發(fā)酵液離心收集菌體，利用破胞緩沖液洗滌菌體一次，再利用破胞緩沖液重懸菌體后在冰浴條件下利用超聲波進行破胞，破胞至菌液澄清，12000rpm/min離心15分鐘離心收集上清，所收集的上清液即為粗酶液，可用于轉化麥芽糖的試驗。3.灰色鏈霉菌海藻糖合成酶轉化麥芽糖產(chǎn)物的分析利用高效液相色譜儀(HPLC)來進行海藻糖合成酶轉化麥芽糖后的產(chǎn)物分析，分析條件，色譜柱Alltima Amino IOOA 5u 柱(4. 6mmX250mm)；檢測器Alltech 2000ES 型蒸發(fā)光散射檢測器；流動相70%乙腈/30% H2O ；流速lmL/min，柱溫;35°C。(1)最適反應pH值的分析分別取96 μ L用分別取96 μ L分別用pH為5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5和8. 0的磷酸
鹽緩沖液配制10%的麥芽糖底物加4μ L的酶液(32ug)，分別在25°C反應lh，然后用HPLC 分析反應的產(chǎn)物組分，結果見圖1。結果表明海藻糖酶的活力在PH6 8. 5都能維持較高的活力，其中在ρΗ7· 5時活力最高。
(2)最適反應溫度測定取96 μ L 117.0的10%麥芽糖底物+4“1^酶液(32ug)，分別在 10°C、15°C、20°C、 25°C、30°C、35°C、40°C和45°C不同的反應溫下保溫反應1小時，然后用HPLC分析反應的產(chǎn)物組分，結果見圖2。結果表明反應溫度在25 35°C反應產(chǎn)物中的海藻糖含量在70%以上，在25°C的反應溫度時反應產(chǎn)物中的海藻糖含量最高可達80%以上，但是在40°C酶活迅速失活。(3)金屬離子對酶活的影響取96 μ L 117.0的10%麥芽糖底物+酶液41^(32呢)+101^金屬離子，使金屬離子終濃度為5mmol/L，在25°C下反應lh，按底物的消耗量來反映酶活的變化，以加磷酸鹽緩沖液的酶活力為100%，結果見圖3。結果表明除了 Cu2+對酶活有明顯的抑制作用和Si2+ 有輕微的抑制作用以外，而其它狗3+、K1+、Ca2+、Mn2+、Fe2+和Ba2+對酶活沒有抑制作用。(4)不同反應時間，產(chǎn)物中各種糖含量變化取96 μ L pH7. 0的10%麥芽糖底物+4ul酶液(32ug)，在pH7. 0和25°C的條件下反應不同的時間，然后測定反應中各種糖的含量，結果表明反應1. 后海藻糖含量最大 87. 14%，葡萄糖含量很低僅為3. 87%，麥芽糖8. 99%，HPLC分析見圖4。隨著反應時間的增加海藻糖和麥芽糖的含量都會減少，而葡萄糖的含量會增加，但在5個小時變化不大，反應產(chǎn)物各種糖含量隨著時間的變化結果見圖5。4.從麥芽糖漿制備海藻糖取市售以淀粉制備麥芽糖含量為70%的麥芽糖漿，用5mol/L，pH為7. 0磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配成的緩沖液配制成含30%麥芽糖的反應底物，取100升配制好的反應底物放置于不銹鋼反應罐中，取上述第2步方法制得的海藻糖合成酶粗酶液10升，加入到100 升含30%麥芽糖的反應底物中，然后在25°C條件下反應M小時，然后用HPLC測定反應產(chǎn)物海藻糖的含量。反應M小時后HPLC分析反應產(chǎn)物的海藻糖含量為21. 3%，這表明在110升的總反應體積中共形成了約110升X21. 3%= 23. 43千克的海藻糖，麥芽糖的轉化率為23. 43 千克/30千克=78. 10%，也就是說100升含30千克麥芽糖的麥芽糖漿經(jīng)過酶的轉化可以制備23. 43千克的海藻糖，海藻糖得率為78. 1 %。5.從淀粉制備海藻糖將市場銷售干物質含量為80%的商品淀粉40千克用5mmol/L的pH為7. 0磷酸鹽緩沖液調成100升的淀粉乳，加入耐高溫α -淀粉保持溫度90°C，液化至達到碘色后，再保溫0. 5 1小時至DE值為10 12%，在110°C保溫15分鐘滅活淀粉酶活力，然后立即冷卻至50°C后加入適量的β -淀粉酶和普魯蘭酶，在50°C保溫M個小時后測定糖化產(chǎn)物的麥芽糖含量不再增加時，立即冷卻至25°C加入制得的海藻糖合成酶粗酶液10升，在25°C保溫M個小時后測定用HPLC分析反應產(chǎn)物的海藻糖的含量。反應M小時后HPLC分析反應產(chǎn)物的海藻糖含量為20. 70 %，結果表明海藻糖的產(chǎn)量110升X 20. 70%= 22. 77千克，從淀粉制備海藻糖的得率為27. 77千克/40千克= 56. 9%，也就是40千克干物質含量為80%的商品淀粉經(jīng)過酶解可以制備22. 7千克的海藻糖，淀粉制備海藻糖得率為56.9%，按干物質計算得率為71. 16%。
權利要求
1.一種灰色鏈霉菌海藻糖合成酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示。
2.根據(jù)權利要求1所述的基因所編碼的海藻糖合成酶，其氨基酸序列如序列表SEQID NO. 2所示。
3.權利要求2所述的海藻糖合成酶在從麥芽糖制備海藻糖中的應用，其特征在于，1) 將海藻糖合成酶基因構建基因工程菌進行藻糖合成酶的高效表達；幻收集制備重組海藻糖合成酶；3)以麥芽糖或者淀粉制備的麥芽糖漿為原料用海藻糖合成酶制造海藻糖。
全文摘要
一種灰色鏈霉菌海藻糖合成酶基因及其應用，該基因克隆自灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus subsp.griseus)，它表達的海藻糖合成酶能將麥芽糖轉化為海藻糖，該基因的最大特點是轉化效率高，反應速度快，在本發(fā)明所述的反應條件下轉化麥芽糖生成海藻糖的反應產(chǎn)物中海藻糖含量可以達到87％，并且只產(chǎn)生僅為3.8％的葡萄糖，有利于提高底物的轉化率，降低生產(chǎn)成本，應用該基因生產(chǎn)的重組海藻糖合成酶能夠用市場銷售的麥芽糖漿或者淀粉制備的麥芽糖漿為原料來制備海藻糖，這種海藻糖可應用于食品工業(yè)、美容化妝品、醫(yī)藥生物制品等領域。
文檔編號C12N15/52GK102533801SQ20121000869
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月12日 優(yōu)先權日2012年1月12日
發(fā)明者杜麗琴, 梁甲元, 韋宇拓, 黃英 申請人:廣西大學