專利名稱：一種賴氨酸的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種賴氨酸的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
賴氨酸多是通過微生物發(fā)酵來制備的，采用每罐按照一定的比例投入發(fā)酵培養(yǎng)基并接入一定的賴氨酸發(fā)酵菌種，在流加碳源和流加氮源的條件下，進行發(fā)酵培養(yǎng)。隨著發(fā)酵的進行，且隨著碳源和氮源的流加以及發(fā)酵過程中的放料，賴氨酸發(fā)酵菌種的濃度逐漸被稀釋且賴氨酸發(fā)酵菌種的量逐漸減少，發(fā)酵產(chǎn)酸速率呈下降趨勢，最終因發(fā)酵產(chǎn)酸速率緩慢而放罐，致使限制了賴氨酸的產(chǎn)能，成本較高，經(jīng)濟效益較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提高賴氨酸的產(chǎn)能，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益，提供一種新的賴氨酸的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的發(fā)明人在研究中意外發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵培養(yǎng)30小時后至發(fā)酵培養(yǎng)48小時內(nèi)， 向發(fā)酵液中補加賴氨酸發(fā)酵菌種，可極大提高賴氨酸的產(chǎn)能，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益。因此，為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種賴氨酸的生產(chǎn)方法，所述方法包括將賴氨酸發(fā)酵菌種接入賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，在流加碳源和流加氮源的條件下，進行發(fā)酵培養(yǎng)，其特征在于，在發(fā)酵培養(yǎng)30小時后至發(fā)酵培養(yǎng)48小時內(nèi)，向發(fā)酵液中補加賴氨酸發(fā)酵菌種。優(yōu)選地，在發(fā)酵培養(yǎng)35小時后至發(fā)酵培養(yǎng)45小時內(nèi)，向發(fā)酵液中補加賴氨酸發(fā)酵菌種。以接種后且流加碳源和流加氮源之前的發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，以補加的賴氨酸發(fā)酵菌種的干重計，補加的賴氨酸發(fā)酵菌種的加入量優(yōu)選為0. 5-5g/L，進一步優(yōu)選為2-4g/L。優(yōu)選地，補加的賴氨酸發(fā)酵菌種為發(fā)酵培養(yǎng)15小時后至發(fā)酵培養(yǎng)40小時內(nèi)放料的發(fā)酵液中提取的賴氨酸發(fā)酵菌種，進一步優(yōu)選地，補加的賴氨酸發(fā)酵菌種為發(fā)酵培養(yǎng)15 小時后至發(fā)酵培養(yǎng)30小時內(nèi)放料的發(fā)酵液中提取的賴氨酸發(fā)酵菌種。本發(fā)明提供的賴氨酸發(fā)酵方法，可延長發(fā)酵時間，提高終點賴氨酸含量、單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率，從而降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益，采用本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，即補加發(fā)酵培養(yǎng)15小時后至發(fā)酵培養(yǎng)40小時內(nèi)放料的發(fā)酵液中提取的賴氨酸發(fā)酵菌種，可充分利用放料的發(fā)酵液中的賴氨酸發(fā)酵菌種，進一步降低生產(chǎn)成本，進一步提高經(jīng)濟效益。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式
部分予以詳細說明。
具體實施例方式以下對本發(fā)明的具體實施方式
進行詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實施方式
僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種賴氨酸的生產(chǎn)方法，該方法包括將賴氨酸發(fā)酵菌種接入賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，在流加碳源和流加氮源的條件下，進行發(fā)酵培養(yǎng)，其特征在于，在發(fā)酵培養(yǎng)30小時后至發(fā)酵培養(yǎng)48小時內(nèi)，向發(fā)酵液中補加賴氨酸發(fā)酵菌種。
本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的概念，指微生物發(fā)酵所需的供微生物生長和維持用的人工配制的養(yǎng)料，一般都含有碳水化合物、含氮物質(zhì)、無機鹽(包括微量元素)以及維生素和水等。發(fā)酵液也為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的概念，指接入微生物菌株的液體培養(yǎng)基(該液體培養(yǎng)基也即本發(fā)明中所稱發(fā)酵培養(yǎng)基)，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后所得產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明，盡管在發(fā)酵培養(yǎng)30小時后至發(fā)酵培養(yǎng)48小時內(nèi)，向發(fā)酵液中補加賴氨酸發(fā)酵菌種，即可實現(xiàn)本發(fā)明的目的，即提高賴氨酸的產(chǎn)能，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益，但優(yōu)選情況下，在發(fā)酵培養(yǎng)35小時后至發(fā)酵培養(yǎng)45小時內(nèi)，向發(fā)酵液中補加賴氨酸發(fā)酵菌種，可進一步提高賴氨酸的產(chǎn)能，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益。
本發(fā)明中，只要在發(fā)酵培養(yǎng)30小時后至發(fā)酵培養(yǎng)48小時內(nèi)，優(yōu)選在發(fā)酵培養(yǎng)35 小時后至發(fā)酵培養(yǎng)45小時內(nèi)，向發(fā)酵液中補加賴氨酸發(fā)酵菌種，即可提高賴氨酸的產(chǎn)能， 降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益。為了更進一步提高賴氨酸的產(chǎn)能，以接種后且流加碳源和流加氮源之前的發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，以補加的賴氨酸發(fā)酵菌種的干重計，補加的賴氨酸發(fā)酵菌種的加入量優(yōu)選為0. 5-5g/L，進一步優(yōu)選為2-4g/L。
本發(fā)明中，以接種后且流加碳源和流加氮源之前的發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，賴氨酸發(fā)酵菌種的接種量為12-18體積％。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，賴氨酸發(fā)酵菌種在被接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中之前，采用常規(guī)方法將賴氨酸發(fā)酵菌種經(jīng)過種子罐培養(yǎng)，在種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)程度可以通過取樣顯微鏡鏡檢、( (optical density)值測定對產(chǎn)賴氨酸微生物的生長進行觀察，當(dāng)通過上述方法觀察菌體形態(tài)正常、測定OD值達到0. 75以上時停止培養(yǎng)， 將此時種子罐中的種子液稱為成熟種子液。然后再將成熟種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。因此，本發(fā)明中，賴氨酸發(fā)酵菌種的接種量為12-18體積％，指的是接入發(fā)酵培養(yǎng)基中的成熟種子液的體積占接入成熟種子液后發(fā)酵培養(yǎng)基體積的12-18%。
種子罐培養(yǎng)可以采用一級種子罐培養(yǎng)也可以采用二級種子罐培養(yǎng)，一級種子罐培養(yǎng)即將賴氨酸發(fā)酵菌種在一個種子罐中一直培養(yǎng)到所需的培養(yǎng)程度；二級種子罐培養(yǎng)即先將賴氨酸發(fā)酵菌種在一個種子罐中培養(yǎng)一段時間后再轉(zhuǎn)入另一個種子罐繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)到所需的培養(yǎng)程度。二級種子罐培養(yǎng)在各個種子罐的培養(yǎng)時間沒有具體限定，只要最終能培養(yǎng)到所需的培養(yǎng)程度即可。為了操作方便，本發(fā)明的種子罐培養(yǎng)優(yōu)選采用一級種子罐培養(yǎng)。
本發(fā)明中，對于種子罐培養(yǎng)基的成分無特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常用的種子罐培養(yǎng)基，例如，可以用淀粉質(zhì)原料糖化清液、玉米漿、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸銨、蘇氨酸和蛋氨酸等配制種子罐培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明，每升種子罐培養(yǎng)基中各原料的用量可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，每升種子罐培養(yǎng)基中，淀粉質(zhì)原料糖化清液的用量可以為30-40 克，玉米漿(干重為20-50重量％ )的用量可以為70-90克，磷酸氫二鉀的用量可以為 0. 5-1. 5克，硫酸鎂的用量可以為0. 4-1. 1克，硫酸銨的用量可以為5-15克，蘇氨酸的用量可以為0. 1-0. 6克，蛋氨酸的用量可以為0. 1-0. 3克。
本發(fā)明中，流加碳源的量使發(fā)酵液中還原性糖的濃度控制在5-10克/升，流加氮源的量使發(fā)酵液中氮的濃度控制在0. 35-0. 8克/升。此處“流加碳源的量使發(fā)酵液中還原性糖的濃度控制在5-10克/升，流加氮源的量使發(fā)酵液中氮的濃度控制在0. 35-0. 8克/ 升”是指通過控制流加碳源和流加氮源的速度來使在整個發(fā)酵培養(yǎng)過程中發(fā)酵液中還原性糖的濃度維持在5-10克/升，使發(fā)酵液中氮的濃度維持在0. 35-0. 8克/升。
本發(fā)明的發(fā)明人在實驗中發(fā)現(xiàn)，對于碳源和氮源的流加，連續(xù)流加比間歇流加的發(fā)酵效果好，因此，本發(fā)明中的流加優(yōu)選為連續(xù)流加。
本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)在發(fā)酵罐中進行，為了有效利用發(fā)酵罐的產(chǎn)能，接種后且流加碳源和流加氮源之前發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基的體積優(yōu)選為發(fā)酵罐體積的40-60%，隨著流加碳源和流加氮源，發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基的體積逐漸增大，為了保證發(fā)酵罐中的空氣量，優(yōu)選為流加碳源和流加氮源至發(fā)酵罐體積的70-80%時放料，為了不影響放料后發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)，放料體積優(yōu)選為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)基體積的5-10%。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，補加的賴氨酸發(fā)酵菌種應(yīng)該具有產(chǎn)酸代謝活力。 本發(fā)明中，對于補加的賴氨酸發(fā)酵菌種無特殊要求，例如可以是經(jīng)種子罐培養(yǎng)的成熟種子液，也可以是經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)的仍具產(chǎn)酸代謝活力的賴氨酸發(fā)酵菌種。本發(fā)明的發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵培養(yǎng)15小時后至發(fā)酵培養(yǎng)40小時內(nèi)的賴氨酸發(fā)酵菌種仍具有較強的產(chǎn)酸代謝活力，因此，為了進一步降低成本，優(yōu)選情況下，補加的賴氨酸發(fā)酵菌種為發(fā)酵培養(yǎng)15 小時后至發(fā)酵培養(yǎng)40小時內(nèi)放料的發(fā)酵液中提取的賴氨酸發(fā)酵菌種，為了進一步提高賴氨酸產(chǎn)能，更優(yōu)選情況下，補加的賴氨酸發(fā)酵菌種為發(fā)酵培養(yǎng)15小時后至發(fā)酵培養(yǎng)30小時內(nèi)放料的發(fā)酵液中提取的賴氨酸發(fā)酵菌種。
本發(fā)明中，對于從放料的發(fā)酵液中提取賴氨酸發(fā)酵菌種的方法無特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常用的各種方法，例如可以采用金屬膜過濾的方法，將發(fā)酵培養(yǎng)15小時后至發(fā)酵培養(yǎng)30小時內(nèi)放料的發(fā)酵液混合均勻(其中賴氨酸含量通常為12g/100mL左右)后采用膜孔徑0. 2 μ m、膜面積0. 25m2的金屬膜，在操作條件為進口壓力0. 35MPa、出口壓力0. 2MPa 下過濾，濾出液濁度控制在30NTU以下，得到賴氨酸膜濾液和膜濃縮液，然后濾液進入賴氨酸提取工序，制成賴氨酸鹽酸鹽成品。膜濃縮液中固形物大部分為菌體(菌體干重含量通常為10g/100mL左右)，將該膜濃縮液直接加入發(fā)酵培養(yǎng)30小時后至發(fā)酵培養(yǎng)48小時內(nèi)的發(fā)酵罐中即可，即該膜濃縮液作為從放料的發(fā)酵液中提取的賴氨酸發(fā)酵菌種。
對于過濾采用的金屬膜，可清洗后再利用，清洗程序為向膜貯罐內(nèi)加滿40-50°C 水，對膜管進行循環(huán)沖洗，重復(fù)2-3遍。采用65°C、濃度5-8% (w/v)的NaOH溶液循環(huán)清洗膜40分鐘。加水將膜系統(tǒng)沖洗至近中性，并且膜通量達到初始通量的95%，即可備用下一批次發(fā)酵液的金屬膜過濾。
現(xiàn)有技術(shù)中，將賴氨酸發(fā)酵菌種接入賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，在流加碳源和流加氮源的條件下，進行發(fā)酵培養(yǎng)，隨著發(fā)酵的進行，且隨著碳源和氮源的流加以及發(fā)酵過程中的放料，賴氨酸發(fā)酵菌種的濃度逐漸被稀釋且賴氨酸發(fā)酵菌種的量逐漸減少，發(fā)酵產(chǎn)酸速率呈下降趨勢，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸速率降低到一定程度即判斷為發(fā)酵終點，達到發(fā)酵終點即放罐，放罐是指將發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基全部從發(fā)酵罐中放出，即停止發(fā)酵?，F(xiàn)有技術(shù)中一般發(fā)酵培養(yǎng) 40-50小時后放罐。本發(fā)明由于在發(fā)酵培養(yǎng)30小時后至發(fā)酵培養(yǎng)48小時內(nèi)，優(yōu)選在發(fā)酵培養(yǎng)35小時后至發(fā)酵培養(yǎng)45小時內(nèi)，向發(fā)酵液中補加賴氨酸發(fā)酵菌種，因此，延長了發(fā)酵培養(yǎng)的時間，本發(fā)明優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)52-64小時后放罐。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，為了得到純度較高的賴氨酸產(chǎn)品，本發(fā)明方法還包括從放料或放罐的溶液中提取賴氨酸。對于提取賴氨酸的方法無特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常用的各種方法，例如，采用連續(xù)離子交換分離提取方法，向放料或放罐的溶液中加入大量的濃硫酸調(diào)PH至2. 0-3. 0進行酸化，酸化后經(jīng)過金屬膜或陶瓷膜過濾除去菌體，得到賴氨酸膜濾液即賴氨酸清液，或?qū)⑺峄蟮馁嚢彼岚l(fā)酵液經(jīng)絮凝過濾除菌體后得到賴氨酸清液，除菌體后的賴氨酸清液采用強酸型陽離子交換樹脂進行吸附交換，樹脂吸附飽和后用稀氨水進行洗脫，洗脫下來的賴氨酸經(jīng)濃縮、鹽酸調(diào)節(jié)PH值、結(jié)晶、固液分離、烘干，得到賴氨酸鹽酸鹽成品；或者在放料或放罐的溶液中加入酸，使賴氨酸發(fā)酵液酸化，經(jīng)過濾或離心等方法除去菌體。在除去菌體后的賴氨酸清液中加入氫氧化鈣調(diào)節(jié)PH值至8. 0-11. 5，使賴氨酸清液中的鹽、膠體等雜質(zhì)生成不溶物，經(jīng)固液分離后得到賴氨酸溶液，將賴氨酸溶液濃縮至每毫升賴氨酸溶液中賴氨酸的含量為0. 6-0. 8g，再經(jīng)過過濾可以得到高純度的賴氨酸溶液，然后經(jīng)濃縮、鹽酸調(diào)節(jié)PH值、結(jié)晶、固液分離、烘干，得到賴氨酸鹽酸鹽成品。本發(fā)明中，對發(fā)酵培養(yǎng)的條件無特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常用的條件，例如，溫度為35_38°C，壓力為0. 05-0. lMPa，pH值為6. 7-7. 0，通氣量為0. 5-1. 2立方米空氣/立方米的培養(yǎng)基/分鐘，通氣量優(yōu)選為0. 7-0. 9立方米空氣/立方米的培養(yǎng)基/分鐘。本發(fā)明中，對賴氨酸發(fā)酵菌種的種類無特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常用的菌種，優(yōu)選為谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌和黃色短桿菌中的至少一種。本發(fā)明中，碳源優(yōu)選為淀粉質(zhì)原料糖化清液。本發(fā)明中，淀粉質(zhì)原料糖化清液既可以采用干法制糖工藝制備，也可以采用濕法制糖工藝制備。從工藝簡單、設(shè)備投資少，生產(chǎn)成本較低的方面考慮，優(yōu)選通過干法制糖工藝制備。干法制糖工藝是指淀粉質(zhì)原料不經(jīng)浸泡直接進行破碎和酶解。干法制糖工藝可以包括將淀粉質(zhì)原料粉碎，將淀粉質(zhì)原料粉碎后的產(chǎn)物調(diào)漿，并加入淀粉酶對淀粉進行第一次水解；對第一次水解產(chǎn)物進行固液分離，并在得到的液相組分中加入糖化酶進行第二次水解，得到淀粉質(zhì)原料糖化清液。優(yōu)選地，粉碎使淀粉質(zhì)原料過 30目篩的通過率大于75%，更優(yōu)選過30目篩的通過率為100%。調(diào)漿的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，但優(yōu)選地，調(diào)漿的方法可以包括將淀粉質(zhì)原料粉碎后的產(chǎn)物加入到水中混合均勻，水的加入量使得到的漿液的波美度可以為9-17Β °。術(shù)語“波美度”是表示溶液濃度的一種方法，是通過波美比重計檢測溶液得到的度數(shù)。根據(jù)本發(fā)明，在第一次水解中，以每克粉碎后的產(chǎn)物的干重計，淀粉酶的用量可以為10-30酶活力單位，酶解的溫度可以為88-92°C，酶解的時間可以為90-120分鐘，酶解的 PH值可以為5. 5-6. 0。固液分離的條件沒有特別的限定，優(yōu)選地，固液分離的條件使得到的液相組分中的固含量為19-22重量％，更優(yōu)選為20-21重量％。根據(jù)本發(fā)明，在第二次水解中，以每克液相組分計，糖化酶的用量可以為110-130 酶活力單位，酶解的溫度可以為^_65°C，酶解的時間可以為420-600分鐘，酶解的pH值可以為 4. 0-4. 5。本發(fā)明酶活力單位的定義為在pH值為6. 0、溫度為70°C的條件下，1分鐘將1毫
克淀粉轉(zhuǎn)化為還原性糖所需的酶量為一個酶活力單位。淀粉酶是指能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，所述淀粉酶一般包括α -淀粉酶、β-淀粉酶。α-淀粉酶又稱淀粉1，4_糊精酶，它能夠任意地、不規(guī)則地切開淀粉鏈內(nèi)部的 α-1,4-糖苷鍵，將淀粉水解為麥芽糖、含有6個葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖。生產(chǎn)此酶的微生物主要有枯草桿菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。
β -淀粉酶又稱淀粉1，4-麥芽糖苷酶，能夠從淀粉分子非還原性末端切開1，4_糖苷鍵，生成麥芽糖。此酶作用于淀粉的產(chǎn)物是麥芽糖與極限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和內(nèi)孢霉產(chǎn)生。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用α -淀粉酶。
根據(jù)本發(fā)明，糖化酶優(yōu)選為α -1,4-葡萄糖水解酶。
按照本發(fā)明，淀粉質(zhì)原料可以為本領(lǐng)域公知的各種可以用于酶解、發(fā)酵制備賴氨酸的含有淀粉的原料，例如，可以選自玉米、薯類(如木薯)和小麥中的一種或幾種。
本發(fā)明中，氮源的種類為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，可以為銨鹽。當(dāng)?shù)礊殇@鹽時，培養(yǎng)基中氮的濃度以銨根離子的濃度表示，氮的濃度控制在0. 35-0. 8克/升，則銨根離子的濃度控制在0. 5-1. 0克/升。
本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)基的成分無特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常用的賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基，例如，可以用淀粉質(zhì)原料糖化清液、糖蜜、玉米漿、硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、蘇氨酸、蛋氨酸和谷氨酸等配制發(fā)酵培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明，每升發(fā)酵培養(yǎng)基中各原料的用量可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，每升發(fā)酵培養(yǎng)基中，淀粉質(zhì)原料糖化清液的用量可以為 40-60克，糖蜜的用量可以為30-50克，玉米漿(干重為20-50重量％ )的用量可以為20-40 克，硫酸銨的用量可以為20-40克，磷酸氫二鉀的用量可以為0. 5-1. 5克，硫酸鎂的用量可以為0. 4-0. 6克，蘇氨酸的用量可以為0. 1-0. 3克，蛋氨酸的用量可以為0. 1-0. 3克，谷氨酸的用量可以為0. 2-0. 4克。
另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，接入種子罐進行培養(yǎng)的菌種為經(jīng)過活化后進行增殖培養(yǎng)后的菌種?；罨驮鲋撑囵B(yǎng)為本領(lǐng)域的公知常識，在此不再贅述。
以上詳細描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護范圍。
另外需要說明的是，在上述具體實施方式
中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。
此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。
實施例
以下的實施例將對本發(fā)明作進一步的說明，但并不因此限制本發(fā)明。
在下述實施例和對比例中
OD值測定將取樣的發(fā)酵液進行沈倍稀釋，采用722Ν可見光分光光度計，在波長 562納米可見光下測定吸光值，即為OD值，將得到的OD值X稀釋倍數(shù)+發(fā)酵液的總體積， 計算得到的數(shù)值反映單位體積發(fā)酵液中產(chǎn)賴氨酸微生物的數(shù)量。
按照GB/T5009. 7-2008的方法測定發(fā)酵液中還原性糖的濃度。
按照GB3595-83的方法測定發(fā)酵液中銨根離子的濃度。
按照GB10794-89標(biāo)準(zhǔn)檢測發(fā)酵液中的賴氨酸濃度(以賴氨酸鹽酸鹽計)。
單罐供酸量=(放罐的賴氨酸濃度X放罐體積+中間放料賴氨酸濃度X中間放料體積)。
轉(zhuǎn)化率(％ )=單罐供酸量/總糖的重量X100%，其中總糖的重量包括種子罐用糖重量和發(fā)酵罐用糖重量。發(fā)酵液中賴氨酸發(fā)酵菌種的提取方法將發(fā)酵培養(yǎng)15小時后至發(fā)酵培養(yǎng)30小時內(nèi)放料的發(fā)酵液混合均勻，其中賴氨酸含量為12g/100mL左右，然后采用膜孔徑0. 2 μ m、膜面積0. 25m2的金屬膜，在操作條件為進口壓力0. 35MPa、出口壓力0. 2MPa下過濾，濾出液濁度控制在30NTU以下，得到賴氨酸膜濾液和膜濃縮液，然后濾液進入賴氨酸提取工序，制成賴氨酸鹽酸鹽成品。膜濃縮液中固形物大部分為菌體，菌體干重含量為10g/100mL左右，將該膜濃縮液直接加入發(fā)酵培養(yǎng)30小時后至發(fā)酵培養(yǎng)48小時內(nèi)的發(fā)酵罐中即可，即該膜濃縮液作為從放料的發(fā)酵液中提取的賴氨酸發(fā)酵菌種。實施例1本實施例用于說明本發(fā)明提供的賴氨酸的生產(chǎn)方法。(1)將收獲的100重量份玉米通過機械加工將玉米顆粒粉碎，使玉米粉過30目篩的通過率為80%。(2)將粉碎后的產(chǎn)物加水調(diào)漿至12Β °，相對于每克粉碎產(chǎn)物的干重，加入20個酶活力單位的淀粉酶(諾維信公司，α -淀粉酶)，在90°C、ρΗ為5. 5的條件下酶解100分鐘，得到酶解產(chǎn)物。其中，將酶解產(chǎn)物通過用液壓式板框壓濾機進行壓濾，分離出酶解清液 (固含量為20重量％ )；之后加入115個酶活力單位的糖化酶(α -1，4-葡萄糖水解酶，諾維信公司)，在60°C、pH為4. 5的條件下酶解420分鐘，得到淀粉質(zhì)原料糖化清液。(3)使用步驟( 得到的淀粉質(zhì)原料糖化清液配制種子罐培養(yǎng)基，具體組成為相對于每升種子罐培養(yǎng)基，淀粉質(zhì)原料糖化清液的用量為35克，玉米漿(干重為35重量％ ) 的用量為80克，磷酸氫二鉀的用量為1. 0克，硫酸鎂的用量為0. 5克，硫酸銨的用量為10 克，蘇氨酸的用量為0. 2克，蛋氨酸的用量為0. 2克。將培養(yǎng)基加熱到121°C消毒，維持20分鐘后降溫至37°C并保持恒定。開啟攪拌，調(diào)節(jié)罐壓為0. IMPa，按照通風(fēng)量與培養(yǎng)基1 0.5 體積比通入無菌空氣，用氨水調(diào)節(jié)PH至6.8并保持恒定。然后將黃色短桿菌菌種(菌株原種FB42購自江南大學(xué))活化和增殖后接入種子罐中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每隔120分鐘取樣鏡檢并測定OD值，當(dāng)鏡檢菌體形態(tài)正常且OD值達到0. 8時停止培養(yǎng)，得到成熟種子液。(4)使用步驟( 得到的淀粉質(zhì)原料糖化清液配制發(fā)酵培養(yǎng)基，具體組成為相對于每升發(fā)酵培養(yǎng)基，淀粉質(zhì)原料糖化清液的用量為50克，糖蜜(產(chǎn)地新疆)的用量為40克， 玉米漿(干重為35重量％ )的用量為30克，硫酸銨的用量為30克，磷酸氫二鉀的用量為 1. O克，硫酸鎂的用量為0. 5克，蘇氨酸的用量為0. 2克，蛋氨酸的用量為0. 2克，谷氨酸的用量為0. 3克。培養(yǎng)基加熱到121°C消毒30分鐘后降溫至37°C并保持恒定，用氨水調(diào)節(jié)pH 至 6. 9。(5)在發(fā)酵罐中裝入步驟(4)配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基體積為發(fā)酵罐體積的50%。使用步驟C3)所得的成熟種子液，接入發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，以接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，步驟C3)所得的成熟種子液的接種量為15體積％。接種后連續(xù)流加步驟( 得到的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨，流加步驟( 得到的淀粉質(zhì)原料糖化清液的量使發(fā)酵液中還原性糖的濃度控制在6-8克/升，流加硫酸銨的量使發(fā)酵液中銨根離子的濃度控制在0. 6-0. 8克/升，將罐壓控制為0. IMPa,發(fā)酵溫度控制為37°C，通氣量為 0. 7立方米空氣/立方米的培養(yǎng)基/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)PH維持在6. 9進行發(fā)酵培養(yǎng)，流加
8步驟( 得到的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨至發(fā)酵罐體積的75%時放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中發(fā)酵液體積的8%。
將發(fā)酵培養(yǎng)15小時后至發(fā)酵培養(yǎng)30小時內(nèi)放料的發(fā)酵液混合，從混合后的發(fā)酵液中提取賴氨酸發(fā)酵菌種，在發(fā)酵培養(yǎng)40小時時，向發(fā)酵罐中補加提取的賴氨酸發(fā)酵菌種，以接種后且流加碳源和流加氮源之前的發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，以補加的賴氨酸發(fā)酵菌種的干重計，補加的賴氨酸發(fā)酵菌種的加入量為3g/L。發(fā)酵培養(yǎng)58小時后放罐，測定放罐的賴氨酸濃度(即終點賴氨酸含量，下同)和中間放料的賴氨酸濃度，計算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。
實施例2
本實施例用于說明本發(fā)明提供的賴氨酸的生產(chǎn)方法。
淀粉質(zhì)原料糖化清液的制備方法、種子罐培養(yǎng)基配方、種子罐成熟種子液培養(yǎng)方法、發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方均與實施例1相同。
發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基體積為發(fā)酵罐體積的40%。將成熟種子液接入發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，以接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，種子液的接種量為12體積％。接種后連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液的量使發(fā)酵液中還原性糖的濃度控制在5-7克/升，流加硫酸銨的量使發(fā)酵液中銨根離子的濃度控制在0. 5-0. 7克/升，將罐壓控制為0. 08MPa,發(fā)酵溫度控制為35°C，通氣量為0. 8立方米空氣/立方米的培養(yǎng)基/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)PH維持在6. 7進行發(fā)酵培養(yǎng)，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨至發(fā)酵罐體積的70%時放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)基體積的5%。
將發(fā)酵培養(yǎng)15小時后至發(fā)酵培養(yǎng)30小時內(nèi)放料的發(fā)酵液混合，從混合后的發(fā)酵液中提取賴氨酸發(fā)酵菌種，在發(fā)酵培養(yǎng)35小時時，向發(fā)酵罐中補加提取的賴氨酸發(fā)酵菌種，以接種后且流加碳源和流加氮源之前的發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，以補加的賴氨酸發(fā)酵菌種的干重計，補加的賴氨酸發(fā)酵菌種的加入量為2g/L。發(fā)酵培養(yǎng)52小時后放罐，測定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。
實施例3
本實施例用于說明本發(fā)明提供的賴氨酸的生產(chǎn)方法。
淀粉質(zhì)原料糖化清液的制備方法、種子罐培養(yǎng)基配方、種子罐成熟種子液培養(yǎng)方法、發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方均與實施例1相同。
發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基體積為發(fā)酵罐體積的60%。將成熟種子液接入發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，以接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，種子液的接種量為18體積％。接種后連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液的量使發(fā)酵液中還原性糖的濃度控制在8-10克/升，流加硫酸銨的量使發(fā)酵液中銨根離子的濃度控制在0. 8-1.0克/升，將罐壓控制為0. 05MPa，發(fā)酵溫度控制為38°C，通氣量為0. 9立方米空氣/立方米的培養(yǎng)基/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)PH維持在7. 0進行發(fā)酵培養(yǎng)，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨至發(fā)酵罐體積的80%時放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)基體積的10%。
將發(fā)酵培養(yǎng)15小時后至發(fā)酵培養(yǎng)30小時內(nèi)放料的發(fā)酵液混合，從混合后的發(fā)酵液中提取賴氨酸發(fā)酵菌種，在發(fā)酵培養(yǎng)45小時時，向發(fā)酵罐中補加提取的賴氨酸發(fā)酵菌種，以接種后且流加碳源和流加氮源之前的發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，以補加的賴氨酸發(fā)酵菌種的干重計，補加的賴氨酸發(fā)酵菌種的加入量為4g/L。發(fā)酵培養(yǎng)64小時后放罐，測定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。對比例1按照實施例1的方法生產(chǎn)賴氨酸，不同的是，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中不向發(fā)酵液中補加賴氨酸發(fā)酵菌種，發(fā)酵培養(yǎng)48小時后放罐，測定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。表 權(quán)利要求
1.一種賴氨酸的生產(chǎn)方法，所述方法包括將賴氨酸發(fā)酵菌種接入賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，在流加碳源和流加氮源的條件下，進行發(fā)酵培養(yǎng)，其特征在于，在發(fā)酵培養(yǎng)30小時后至發(fā)酵培養(yǎng)48小時內(nèi)，向發(fā)酵液中補加賴氨酸發(fā)酵菌種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在發(fā)酵培養(yǎng)35小時后至發(fā)酵培養(yǎng)45小時內(nèi)，向發(fā)酵液中補加賴氨酸發(fā)酵菌種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，以接種后且流加碳源和流加氮源之前的發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，以補加的賴氨酸發(fā)酵菌種的干重計，補加的賴氨酸發(fā)酵菌種的加入量為 0. 5-5g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，以接種后且流加碳源和流加氮源之前的發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，以補加的賴氨酸發(fā)酵菌種的干重計，補加的賴氨酸發(fā)酵菌種的加入量為2-4g/ L0
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的方法，其中，以接種后且流加碳源和流加氮源之前的發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，所述賴氨酸發(fā)酵菌種的接種量為12-18體積％。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述流加碳源的量使發(fā)酵液中還原性糖的濃度控制在5-10克/升，所述流加氮源的量使發(fā)酵液中氮的濃度控制在0. 35-0. 8克/升。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項所述的方法，其中，所述流加為連續(xù)流加。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項所述的方法，其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)在發(fā)酵罐中進行， 接種后且流加碳源和流加氮源之前發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基的體積為發(fā)酵罐體積的40-60%，流加碳源和氮源至發(fā)酵罐體積的70-80%時放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)基體積的 5-10%。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，補加的賴氨酸發(fā)酵菌種為發(fā)酵培養(yǎng)15小時后至發(fā)酵培養(yǎng)40小時內(nèi)放料的發(fā)酵液中提取的賴氨酸發(fā)酵菌種。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，補加的賴氨酸發(fā)酵菌種為發(fā)酵培養(yǎng)15小時后至發(fā)酵培養(yǎng)30小時內(nèi)放料的發(fā)酵液中提取的賴氨酸發(fā)酵菌種。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10中任意一項所述的方法，其中，發(fā)酵培養(yǎng)52-64小時后放罐。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項所述的方法，其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為溫度為 35_38°C，壓力為0. 05-0. lMPa，pH值為6. 7-7. 0，通氣量為0. 5-1. 2立方米空氣/立方米的培養(yǎng)基/分鐘。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任意一項所述的方法，其中，所述賴氨酸發(fā)酵菌種為谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌和黃色短桿菌中的至少一種。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任意一項所述的方法，其中，所述碳源為淀粉質(zhì)原料糖化清液。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任意一項所述的方法，其中，所述氮源為銨鹽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種賴氨酸的生產(chǎn)方法，所述方法包括將賴氨酸發(fā)酵菌種接入賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，在流加碳源和流加氮源的條件下，進行發(fā)酵培養(yǎng)，其特征在于，在發(fā)酵培養(yǎng)30小時后至發(fā)酵培養(yǎng)48小時內(nèi)，向發(fā)酵液中補加賴氨酸發(fā)酵菌種。本發(fā)明提供的賴氨酸發(fā)酵方法，可延長發(fā)酵時間，提高終點賴氨酸含量、單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率，從而降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益，采用本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，即補加發(fā)酵培養(yǎng)15小時后至發(fā)酵培養(yǎng)40小時內(nèi)放料的發(fā)酵液中提取的賴氨酸發(fā)酵菌種，可充分利用放料的發(fā)酵液中的賴氨酸發(fā)酵菌種，進一步降低生產(chǎn)成本，進一步提高經(jīng)濟效益。
文檔編號C12P13/08GK102533890SQ20121000944
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者盧宗梅, 張繼學(xué), 朱繼成, 熊結(jié)青, 章輝平 申請人:中糧生物化學(xué)(安徽)股份有限公司