專利名稱：一種分離玉米青枯病原腐霉菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離方法，具體的說(shuō)是一種分離玉米青枯病原腐霉菌的方法。
背景技術(shù)：
玉米青枯病是世界玉米產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的一種土傳病害。在我國(guó)各地的玉米產(chǎn)區(qū)也相繼發(fā)生且比較嚴(yán)重，從而嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量，一般玉米青枯病的發(fā)病率為10%-20%， 多雨季節(jié)發(fā)病嚴(yán)重，最高可達(dá)80%以上。一般情況下按病情發(fā)展速度和田間癥狀可分為急性型和普通型。急性型多發(fā)生在玉米生長(zhǎng)后期乍雨乍晴的天氣，又稱青枯型，發(fā)病速度快， 通常在1-2天內(nèi)全株迅速失水枯萎，似開(kāi)水燙，呈灰綠色青枯狀，莖基部可見(jiàn)維管束已變褐色，最后導(dǎo)致水漬狀壞死，果穗下垂。普通型多在連續(xù)陰雨的天氣發(fā)生，又稱黃枯型，病情發(fā)展較慢，一般在5-10天全株才表現(xiàn)癥狀，整株葉片自下端開(kāi)始依次黃枯，有時(shí)也呈現(xiàn)水燙狀青黃枯，莖基初呈褐色水漬狀斑，表皮失水輕微皺縮，進(jìn)而變軟成條紋凹陷，嚴(yán)重者葉片全部黃枯，根壞死，果穗下垂，莖基髓部中空，極易倒伏。玉米青枯病是一種典型的土傳病害，且為多種病菌侵染所致，其病原菌又為多寄主和半腐生性，病原菌在土壤、肥料、病株殘?bào)w和種子上越冬。目前對(duì)于玉米青枯病病原菌的分離尚不完善，沒(méi)有可行的分離方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述問(wèn)題的不足，提供一種分離玉米青枯病原腐霉菌的方法，利用分離玉米青枯病原腐霉菌培養(yǎng)基將玉米青枯病原腐霉菌種進(jìn)行分離，其分離方法簡(jiǎn)單。本發(fā)明涉及的試劑DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)買于碧云天生物技術(shù)研究所，該試劑盒中自配有成品的DNA純化結(jié)合液，洗滌液，洗脫液，DNA純化柱，收集管；
本發(fā)明為解決上述問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是一種分離玉米青枯病原腐霉菌的方法， 分離玉米青枯病原腐霉菌所用的分離培養(yǎng)基的原料由瓊脂、葡萄糖、馬鈴薯、酵母浸膏和復(fù)合抗生素母液組成，各原料的加入量是15 — 30g的瓊脂、15 — 30g的葡萄糖、150—300g的馬鈴薯、0. 8—1. 5g的酵母浸膏和0. 4—0. 7mL的復(fù)合抗生素母液；
利用分離培養(yǎng)基分離玉米青枯病原腐霉菌的方法，包括以下步驟為 步驟一、抗生素培養(yǎng)基的配制
1)在濃度為80萬(wàn)U/瓶的青霉素鈉中加入無(wú)菌去離子水，混合均勻，制得濃度為20萬(wàn) U/mL的母液a，備用；
2)在濃度為100萬(wàn)U/瓶的硫酸鏈霉素中加入無(wú)菌去離子水，混合均勻，制得濃度為20 萬(wàn)U/mL的母液b，備用；
3)按重量份數(shù)比取1份的濃度為20萬(wàn)U/mL的母液a和1份的濃度為20萬(wàn)U/mL的母液b，混合均勻，制得濃度為10萬(wàn)U/mL的復(fù)合抗生素母液，備用；
步驟4)在4000mL的水中加入400_600g的馬鈴薯，煮30— 40分鐘，過(guò)濾，得到馬鈴薯濾液，備用；步驟5)在1500mL的馬鈴薯濾液中加入15 — 30g的瓊脂、15 — 30g的葡萄糖和0. 8— 1. 5g的酵母浸膏，加熱至80—90°C，使瓊脂溶解，形成含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基煮至IOOOmL時(shí)，后將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分裝于10個(gè)三角瓶中，每瓶IOOmL,后將每個(gè)三角瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi)，在壓強(qiáng)為1.05kg/cm2，溫度為121°C，滅菌40分鐘，取出，后在21°C條件下冷卻至 60°C止，在每個(gè)含有酵母浸膏馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)加入0. 4-0. 7mL步驟 3)中得到的復(fù)合抗生素母液，混合均勻，使每個(gè)三角瓶?jī)?nèi)的抗生素濃度為20U/mL，制得抗生素培養(yǎng)基，后將抗生素培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)抗生素培養(yǎng)基的含量為 30mL，放置40分鐘，得到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂抗生素分離平板，備用；
步驟6)取步驟4)中得到的IOOOmL馬鈴薯濾液，在濾液中加入15 — 30g的瓊脂、15— 30g的葡萄糖，0. 8—1. 5g的酵母浸膏，加熱至80— 90°C，使瓊脂溶解，后將溶液定容至 lOOOmL，形成含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，后將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分裝于10個(gè)三角瓶中，每瓶IOOmL,然后將每個(gè)三角瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi)，在壓強(qiáng)為1.05kg/cm2，溫度為121°C，滅菌40分鐘，取出，后在21°C條件下冷卻至60°C止，將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)含有30mL的培養(yǎng)基，得到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，備用； 步驟二、病原菌的萌發(fā)
1)將含有病原菌的玉米桿，剝離葉片，用保鮮膜將玉米桿包裝好并放于10°C條件下，放置3天。2)用75%的酒精將含有病原菌的玉米桿外側(cè)消毒，剪成IOcm的小段，剖開(kāi)玉米莖桿，將病變組織暴露，取三個(gè)直徑為Icm的病變組織塊，將病變組織塊接種到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂抗生素分離平板中，在條件下，培養(yǎng)3-5天，得到萌發(fā)后的病原菌，備用；
步驟三、在步驟一中得到的加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板內(nèi)，接種步驟二中得到的萌發(fā)后的病原菌，在條件下，培養(yǎng)3-5天，得到純化后的菌株，備用；
步驟四、依據(jù)步驟三的方法，在加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板內(nèi)接種步驟三得到的純化后的菌株，在條件下，培養(yǎng)3-5天，進(jìn)一步純化得到玉米青枯病原腐霉菌株，備用；
步驟五、將步驟四中的得到全部玉米青枯病原腐霉菌接種到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，在條件下，培養(yǎng)6天，得到玉米青枯病原腐霉菌絲，即分離得到玉米青枯病原腐霉菌。有益效果
本發(fā)明的分離玉米青枯病原腐霉菌的培養(yǎng)基，制備方便，便于操作，成本低廉，便于配制，降低生產(chǎn)成本，提高勞動(dòng)效率。本發(fā)明中所提供的培養(yǎng)基配方是在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入酵母浸膏，后加入青霉素和硫酸鏈霉素，制得終濃度在20U/mL的抗生素培養(yǎng)基，在排除細(xì)菌污染的情況下，準(zhǔn)確、快速的將玉米青枯病原腐霉菌分離。本發(fā)明利用分離玉米青枯病原腐霉菌培養(yǎng)基分離玉米青枯病原腐霉菌的方法，其制備方法簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，便于廣泛應(yīng)用。


圖1為擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜；
圖2為rDNAITS序列的玉米青枯病原腐霉菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；
圖中Marker 自上而下分別為 2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp，檢測(cè)樣品為擴(kuò)增產(chǎn)物的目的片段，其檢測(cè)片段為889bp。
具體實(shí)施例方式一種分離玉米青枯病原腐霉菌的方法，分離玉米青枯病原腐霉菌所用的分離培養(yǎng)基的原料由瓊脂、葡萄糖、馬鈴薯、酵母浸膏和復(fù)合抗生素母液組成，各原料的加入量是 15—30g的瓊脂、15—30g的葡萄糖、150—300g的馬鈴薯、0. 8—1. 5g的酵母浸膏和0. 4—
0.7mL的復(fù)合抗生素母液；
利用分離培養(yǎng)基分離玉米青枯病原腐霉菌的方法，包括以下步驟為 步驟一、抗生素培養(yǎng)基的配制
1)在濃度為80萬(wàn)U/瓶的青霉素鈉中加入無(wú)菌去離子水，混合均勻，制得濃度為20萬(wàn) U/mL的母液a，備用；
2)在濃度為100萬(wàn)U/瓶的硫酸鏈霉素中加入無(wú)菌去離子水，混合均勻，制得濃度為20 萬(wàn)U/mL的母液b，備用；
3)按重量份數(shù)比取1份的濃度為20萬(wàn)U/mL的母液a和1份的濃度為20萬(wàn)U/mL的母液b，混合均勻，制得濃度為10萬(wàn)U/mL的復(fù)合抗生素母液，備用；
步驟4)在4000mL的水中加入400_600g的馬鈴薯，煮30—40分鐘，過(guò)濾，得到馬鈴薯濾液，備用；
步驟5)在1500mL的馬鈴薯濾液中加入15 — 30g的瓊脂、15 — 30g的葡萄糖和0. 8—
1.5g的酵母浸膏，加熱至80—90°C，使瓊脂溶解，形成含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基煮至IOOOmL時(shí)，后將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分裝于10個(gè)三角瓶中，每瓶IOOmL,后將每個(gè)三角瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi)，在壓強(qiáng)為1.05kg/cm2，溫度為121°C，滅菌40分鐘，取出，后在21°C條件下冷卻至 60°C止，在每個(gè)含有酵母浸膏馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)加入0. 4-0. 7mL步驟 3)中得到的復(fù)合抗生素母液，混合均勻，使每個(gè)三角瓶?jī)?nèi)的抗生素濃度為20U/mL，制得抗生素培養(yǎng)基，后將抗生素培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)抗生素培養(yǎng)基的含量為 30mL，放置40分鐘，得到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂抗生素分離平板，備用；
步驟6)取步驟4)中得到的IOOOmL馬鈴薯濾液，在濾液中加入15 — 30g的瓊脂、15— 30g的葡萄糖，0. 8—1.5g的酵母浸膏，加熱至80— 90°C，使瓊脂溶解，后將溶液定容至 lOOOmL，形成含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，后將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分裝于10個(gè)三角瓶中，每瓶IOOmL,然后將每個(gè)三角瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi)，在壓強(qiáng)為1.05kg/cm2，溫度為121°C，滅菌40分鐘，取出，后在21°C條件下冷卻至60°C止，將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)含有30mL的培養(yǎng)基，得到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，備用； 步驟二、病原菌的萌發(fā)
1)將含有病原菌的玉米桿，剝離葉片，用保鮮膜將玉米桿包裝好并放于10°C條件下，放置3天。 2)用75%的酒精將含有病原菌的玉米桿外側(cè)消毒，剪成IOcm的小段，剖開(kāi)玉米莖桿，將病變組織暴露，取三個(gè)直徑為Icm的病變組織塊，將病變組織塊接種到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂抗生素分離平板中，在條件下，培養(yǎng)3-5天，得到萌發(fā)后的病原菌，備用；
步驟三、在步驟一中得到的加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板內(nèi)，接種步驟二中得到的萌發(fā)后的病原菌，在條件下，培養(yǎng)3-5天，得到純化后的菌株，備用；
步驟四、依據(jù)步驟三的方法，在加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板內(nèi)接種步驟三得到的純化后的菌株，在條件下，培養(yǎng)3-5天，進(jìn)一步純化得到玉米青枯病原腐霉菌株，備用；
步驟五、將步驟四中的得到全部玉米青枯病原腐霉菌接種到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，在條件下，培養(yǎng)6天，得到玉米青枯病原腐霉菌絲，即分離得到玉米青枯病原腐霉菌，備用；
后利用分子生物學(xué)分離鑒定玉米青枯病原腐霉菌
步驟一、玉米青枯病原腐霉菌DNA的提取
1)在研缽內(nèi)加入0.5mg的玉米青枯病原腐霉菌絲、ImL的SDS裂解液和ImL的石英砂， 研磨均勻，形成勻漿液，后在1. 5mL離心管a內(nèi)加入ImL的勻漿液，將含有勻漿液的1. 5mL 離心管a在65°C條件下，放置10分鐘，取出，然后在1.5mL離心管a內(nèi)加入120 μ L濃度為 7. 5mol/L的乙酸銨溶液，混合均勻，后將1. 5mL離心管a置于0°C的冰水混合物中，放置8 分鐘，取出，將1. 5mL離心管a送入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，得到上清液，備用；
2)在1.5mL離心管b中加入500 μ L的上清液、50 μ L濃度為3mol/L的NaAc和300 μ L 的異丙醇，混合均勻，形成混合液I，將含有混合液I的1. 5mL離心管b置于0°C的冰水混合物中，放置8分鐘，取出，后將1. 5mL離心管b送入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘， 離心10分鐘，棄去上清液，得到沉淀物，后在含有沉淀物的1.5!^離心管13內(nèi)加入20(^1^ 的TE溶液，使沉淀物溶解，然后加入200 μ L的氯仿和異戊醇混合液，混合均勻，形成混合液 II，備用；
3)在1.5mL離心管c中加入200 μ L的混合液II、20 μ L的濃度為3mol/L的NaAc和 700 μ L的無(wú)水乙醇，混合均勻，后將1. 5mL離心管c送入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心8分鐘，棄去上清液，得到下層沉淀，后用濃度為70%的乙醇對(duì)1. 5mL離心管c中的沉淀洗滌1一2次，待乙醇揮發(fā)完畢后，后加入1. 5mL離心管c中加入20 μ L的TE溶液，得到玉米青枯病原腐霉菌DNA，備用；
步驟二、玉米青枯病原腐霉菌DNA的轉(zhuǎn)接及純化
1)ITS引物序列
ITSl 5 ‘ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ‘
ITS4 5 ‘ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ‘
2)在0.5mL離心管a中加入2. 0 μ L的10倍緩沖液、0. 5 μ L的dNTP、0. 5 μ L的ITS4 引物、0. 5μ L的ITSl引物、0. 5μ L的Taq聚合酶和20. 0 μ L的去離子水，混合均勻，得到混合液III，備用；
3)將含有混合液III的0.5ml離心管I放入基因擴(kuò)增儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性2分鐘，94 °C變性40秒，59°C退火40秒，72°C延伸100秒，變性、退火和延伸為一次循環(huán)，共35次循環(huán)，后72°C再次延伸10分鐘，取出，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，備用；
步驟三、擴(kuò)增產(chǎn)物的分離、鑒定
1)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物中含有889bp 的目的條帶，備用；
2)用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化
取1. 5ml離心管d并稱其重量，在紫外燈下將擴(kuò)增產(chǎn)物從步驟1)中的凝膠上切下，將切下的擴(kuò)增產(chǎn)物放在已稱重的1. 5ml離心管d中，稱取1. 5ml離心管d的總重并計(jì)算出從凝膠上切下來(lái)的擴(kuò)增產(chǎn)物的重量，然后將1. 5ml離心管d中的擴(kuò)增產(chǎn)物搗碎，按擴(kuò)增產(chǎn)物的克數(shù)加入相同毫升數(shù)的DNA純化結(jié)合液，混合均勻，將1. 5ml離心管放置在50° C水浴中加熱至擴(kuò)增產(chǎn)物完全融解，得到混合液IV，將混合液IV加到DNA純化柱上，DNA純化柱位于收集管中，收集管在21°C條件下放置1分鐘，將收集管放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘， 離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內(nèi)的液體，向DNA純化柱上加入 700微升的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內(nèi)，后將收集管在21°C條件下放置1分鐘，后將收集管放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內(nèi)的液體，向DNA純化柱上加入500微升的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內(nèi)，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內(nèi)的液體，將DNA純化柱置于收集管內(nèi)，然后將收集管放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速 13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱放置于1. 5ml離心管e中，后在DNA純化柱上加入40微升洗脫液，將1. 5ml離心管e在21°C條件下放置1分鐘，然后將收集管放入離心機(jī)內(nèi)轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱得到1. 5ml離心管中e中的液體， 備用；
3)將步驟2)中回收、純化后的液體進(jìn)行測(cè)序，并在Genbank進(jìn)行比對(duì)，確定為玉米青枯病原腐霉菌；
所述的DNA純化結(jié)合液的組成成份每升DNA純化結(jié)合液中含有25mmol的葡萄糖、 IOmmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量為水；
所述的洗滌液的組成成份按重量百分比洗滌液中含有8%的十二烷基硫酸鈉，余量為
水；
所述的洗脫液的組成成份每升洗脫液中含50mmol的三羥甲基氨基甲烷、IOmmol的乙二胺四乙酸，余量為水；
所述的SDS裂解液的組成成份每升SDS裂解液中含有50mM的三羥甲基氨基甲烷和 IOg的十二烷基硫酸鈉，余量為水；
所述的氯仿和異戊醇混合液的組成成分按體積比氯仿和異戊醇混合液中含有對(duì)份的氯仿和1份的戊醇；
所述的TE溶液的組成成份每升TE溶液中含有IOmmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、 Immol的乙二胺四乙酸，余量為水。
實(shí)施例1
一種利用分離培養(yǎng)基分離玉米青枯病原腐霉菌的方法，包括以下步驟為
步驟一、抗生素培養(yǎng)基的配制1)在濃度為80萬(wàn)U/瓶的青霉素鈉中加入無(wú)菌去離子水，混合均勻，制得濃度為20萬(wàn) U/mL的母液a，備用；
2)在濃度為100萬(wàn)U/瓶的硫酸鏈霉素中加入無(wú)菌去離子水，混合均勻，制得濃度為20 萬(wàn)U/mL的母液b，備用；
3)按重量份數(shù)比取1份的濃度為20萬(wàn)U/mL的母液a和1份的濃度為20萬(wàn)U/mL的母液b，混合均勻，制得濃度為10萬(wàn)U/mL的復(fù)合抗生素母液，備用；
步驟4)在4000mL的水中加入400g的馬鈴薯，煮30分鐘，過(guò)濾，得到馬鈴薯濾液，備
用；
步驟5)在1500mL的馬鈴薯濾液中加入15g的瓊脂、15g的葡萄糖和0. Sg的酵母浸膏，加熱至80°C，使瓊脂溶解，形成含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基煮至IOOOmL時(shí)，后將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分裝于10個(gè)三角瓶中，每瓶IOOmL,后將每個(gè)三角瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi)，在壓強(qiáng)為 1. 05kg/cm2，溫度為121°C，滅菌40分鐘，取出，后在21°C條件下冷卻至60°C止，在每個(gè)含有酵母浸膏馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)加入0. 4mL步驟3)中得到的復(fù)合抗生素母液，混合均勻，使每個(gè)三角瓶?jī)?nèi)的抗生素濃度為20U/mL，制得抗生素培養(yǎng)基，后將抗生素培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)抗生素培養(yǎng)基的含量為30mL，放置40分鐘，得到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂抗生素分離平板，備用；
步驟6)取步驟4)中得到的IOOOmL馬鈴薯濾液，在濾液中加入15g的瓊脂、15g的葡萄糖，0. Sg的酵母浸膏，加熱至80°C，使瓊脂溶解，后將溶液定容至IOOOmL,形成含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，后將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分裝于10 個(gè)三角瓶中，每瓶IOOmL,然后將每個(gè)三角瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi)，在壓強(qiáng)為1. 05kg/cm2，溫度為121°C，滅菌40分鐘，取出，后在21°C條件下冷卻至60°C止，將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)含有30mL的培養(yǎng)基，得到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，備用； 步驟二、病原菌的萌發(fā)
1)將含有病原菌的玉米桿，剝離葉片，用保鮮膜將玉米桿包裝好并放于10°C條件下，放置3天。 2)用75%的酒精將含有病原菌的玉米桿外側(cè)消毒，剪成IOcm的小段，剖開(kāi)玉米莖桿，將病變組織暴露，取三個(gè)直徑為Icm的病變組織塊，將病變組織塊接種到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂抗生素分離平板中，在條件下，培養(yǎng)3天，得到萌發(fā)后的病原菌，備用；
步驟三、在步驟一中得到的加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板內(nèi)，接種步驟二中得到的萌發(fā)后的病原菌，在條件下，培養(yǎng)3天，得到純化后的菌株，備用；
步驟四、依據(jù)步驟三的方法，在加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板內(nèi)接種步驟三得到的純化后的菌株，在條件下，培養(yǎng)3天，進(jìn)一步純化得到玉米青枯病原腐霉菌株，備用； 步驟五、將步驟四中的得到全部玉米青枯病原腐霉菌接種到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，在條件下，培養(yǎng)6天，得到玉米青枯病原腐霉菌絲，備用； 步驟六、玉米青枯病原腐霉菌DNA的提取
1)在研缽內(nèi)加入0. 5mg的玉米青枯病原腐霉菌絲、ImL的SDS裂解液和ImL的石英砂， 研磨均勻，形成勻漿液，后在1.5mL離心管a內(nèi)加入ImL的勻漿液，將含有勻漿液的1. 5mL離心管a在65°C條件下，放置10分鐘，取出，然后在1.5mL離心管a內(nèi)加入120 μ L濃度為 7. 5mol/L的乙酸銨溶液，混合均勻，后將1. 5mL離心管a置于0°C的冰水混合物中，放置8 分鐘，取出，將1. 5mL離心管a送入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，得到上清液，備用；
2)在1.5mL離心管b中加入500 μ L的上清液、50 μ L濃度為3mol/L的NaAc和300 μ L 的異丙醇，混合均勻，形成混合液I，將含有混合液I的1. 5mL離心管b置于0°C的冰水混合物中，放置8分鐘，取出，后將1. 5mL離心管b送入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘， 離心10分鐘，棄去上清液，得到沉淀物，后在含有沉淀物的1. 5mL離心管b內(nèi)加入200 μ L 的TE溶液，使沉淀物溶解，然后加入200 μ L的氯仿和異戊醇混合液，混合均勻，形成混合液 II，備用；
3)在1.5mL離心管c中加入200 μ L的混合液II、20 μ L的濃度為3mol/L的NaAc和 700 μ L的無(wú)水乙醇，混合均勻，后將1. 5mL離心管c送入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心8分鐘，棄去上清液，得到下層沉淀，后用濃度為70%的乙醇對(duì)1. 5mL離心管c中的沉淀洗滌1次，待乙醇揮發(fā)完畢后，后加入1. 5mL離心管c中加入20 μ L的TE溶液，得到玉米青枯病原腐霉菌DNA，備用；
步驟七、玉米青枯病原腐霉菌DNA的轉(zhuǎn)接及純化
1)ITS引物序列
ITSl 5 ‘ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ‘
ITS4 5 ‘ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ‘
2)在0.5mL離心管a中加入2. 0 μ L的10倍緩沖液、0. 5 μ L的dNTP、0. 5 μ L的ITS4 引物、0. 5 μ L的ITSl引物、0. 5 μ L的Taq聚合酶和20. 0 μ L的去離子水，混合均勻，得到混合液III，備用；
3)將含有混合液III的0.5ml離心管I放入基因擴(kuò)增儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性2分鐘，94 °C變性40秒，59°C退火40秒，72°C延伸100秒，變性、退火和延伸為一次循環(huán)，共35次循環(huán)，后72°C再次延伸10分鐘，取出，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，備用；
步驟八、擴(kuò)增產(chǎn)物的分離、鑒定
1)稱取0.25克瓊脂糖粉末加到含有25毫升瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的三角瓶中，將三角瓶?jī)?nèi)瓊脂糖凝膠電泳緩沖液加熱至沸騰并使瓊脂糖粉末充分溶解，加入2微升的溴化乙錠溶液，至混合均勻止，后倒入瓊脂糖制膠板中，插入制膠梳，凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳，在凝膠上出現(xiàn)一排點(diǎn)樣孔，將凝膠放入含有瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的電泳凝膠盒中，在凝膠的點(diǎn)樣孔中分別加入5微升的擴(kuò)增產(chǎn)物和2微升DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker，打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān)，在電泳儀電壓為100伏特時(shí)開(kāi)始電泳，電泳30分鐘后關(guān)閉電泳儀，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察到889bp的條帶時(shí)，備用；
2)用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化
取1. 5ml離心管d并稱其重量，在紫外燈下將擴(kuò)增產(chǎn)物從步驟1)中的凝膠上切下，將切下的擴(kuò)增產(chǎn)物放在已稱重的1. 5ml離心管d中，稱取1. 5ml離心管d的總重并計(jì)算出從凝膠上切下來(lái)的擴(kuò)增產(chǎn)物的重量，然后將1. 5ml離心管d中的擴(kuò)增產(chǎn)物搗碎，按擴(kuò)增產(chǎn)物的克數(shù)加入相同毫升數(shù)的DNA純化結(jié)合液，混合均勻，將1. 5ml離心管放置在50° C水浴中加熱至擴(kuò)增產(chǎn)物完全融解，得到混合液IV，將混合液IV加到DNA純化柱上，DNA純化柱位于收集管中，收集管在21°C條件下放置1分鐘，將收集管放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘， 離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內(nèi)的液體，向DNA純化柱上加入 700微升的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內(nèi)，后將收集管在21°C條件下放置1分鐘，后將收集管放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內(nèi)的液體，向DNA純化柱上加入500微升的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內(nèi)，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內(nèi)的液體，將DNA純化柱置于收集管內(nèi)，然后將收集管放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速 13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱放置于1. 5ml離心管e中，后在DNA純化柱上加入40微升洗脫液，將1. 5ml離心管e在21°C條件下放置1分鐘，然后將收集管放入離心機(jī)內(nèi)轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱得到1. 5ml離心管中e中的液體，
3)將步驟2)中回收、純化后的液體進(jìn)行測(cè)序，后將測(cè)出的DNA序列在基因庫(kù)Genbank 進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果表明，本發(fā)明測(cè)出的液體序列與DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄編號(hào)為 AY598627. 1和AY5986^. 1的序列具有同源性，且同源性為98%，在BLAST系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上觀察到玉米青枯病原腐霉菌，登錄編號(hào)(AY598627. 1)為芒孢腐霉菌，登錄編號(hào)(AY5986^. 1) 為強(qiáng)雄腐霉菌，根據(jù)rDNA的ITS區(qū)序列的一般分析準(zhǔn)則，本發(fā)明中分離檢測(cè)的霉菌為玉米青枯病原腐霉菌。
實(shí)施例2
一種利用分離培養(yǎng)基分離玉米青枯病原腐霉菌的方法，包括以下步驟為
步驟一、抗生素培養(yǎng)基的配制
1)在濃度為80萬(wàn)U/瓶的青霉素鈉中加入無(wú)菌去離子水，混合均勻，制得濃度為20萬(wàn) U/mL的母液a，備用；
2)在濃度為100萬(wàn)U/瓶的硫酸鏈霉素中加入無(wú)菌去離子水，混合均勻，制得濃度為20 萬(wàn)U/mL的母液b，備用；
3)按重量份數(shù)比取1份的濃度為20萬(wàn)U/mL的母液a和1份的濃度為20萬(wàn)U/mL的母液b，混合均勻，制得濃度為10萬(wàn)U/mL的復(fù)合抗生素母液，備用；
步驟4)在4000mL的水中加入500g的馬鈴薯，煮35分鐘，過(guò)濾，得到馬鈴薯濾液，備
用；
步驟5)在1500mL的馬鈴薯濾液中加入22g的瓊脂、22g的葡萄糖和1. 2g的酵母浸膏，加熱至85°C，使瓊脂溶解，形成含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基煮至IOOOmL時(shí)，后將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分裝于10個(gè)三角瓶中，每瓶IOOmL,后將每個(gè)三角瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi)，在壓強(qiáng)為 1. 05kg/cm2，溫度為121°C，滅菌40分鐘，取出，后在21°C條件下冷卻至60°C止，在每個(gè)含有酵母浸膏馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)加入0. 6mL步驟3)中得到的復(fù)合抗生素母液，混合均勻，使每個(gè)三角瓶?jī)?nèi)的抗生素濃度為20U/mL，制得抗生素培養(yǎng)基，后將抗生素培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)抗生素培養(yǎng)基的含量為30mL，放置40分鐘，得到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂抗生素分離平板，備用；
步驟6)取步驟4)中得到的IOOOmL馬鈴薯濾液，在濾液中加入22g的瓊脂、22g的葡萄糖，1. 2g的酵母浸膏，加熱至85°C，使瓊脂溶解，后將溶液定容至IOOOmL,形成含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，后將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分裝于10 個(gè)三角瓶中，每瓶IOOmL,然后將每個(gè)三角瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi)，在壓強(qiáng)為1. 05kg/cm2，溫度為121°C，滅菌40分鐘，取出，后在21°C條件下冷卻至60°C止，將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)含有30mL的培養(yǎng)基，得到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，備用； 步驟二、病原菌的萌發(fā)
1)將含有病原菌的玉米桿，剝離葉片，用保鮮膜將玉米桿包裝好并放于10°C條件下，放置3天。 2)用75%的酒精將含有病原菌的玉米桿外側(cè)消毒，剪成IOcm的小段，剖開(kāi)玉米莖桿，將病變組織暴露，取三個(gè)直徑為Icm的病變組織塊，將病變組織塊接種到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂抗生素分離平板中，在條件下，培養(yǎng)4天，得到萌發(fā)后的病原菌，備用；
步驟三、在步驟一中得到的加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板內(nèi)，接種步驟二中得到的萌發(fā)后的病原菌，在條件下，培養(yǎng)4天，得到純化后的菌株，備用；
步驟四、依據(jù)步驟三的方法，在加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板內(nèi)接種步驟三得到的純化后的菌株，在條件下，培養(yǎng)4天，進(jìn)一步純化得到玉米青枯病原腐霉菌株，備用； 步驟五、將步驟四中的得到全部玉米青枯病原腐霉菌接種到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，在條件下，培養(yǎng)6天，得到玉米青枯病原腐霉菌絲，備用； 步驟六、玉米青枯病原腐霉菌DNA的提取
1)在研缽內(nèi)加入0.5mg的玉米青枯病原腐霉菌絲、ImL的SDS裂解液和ImL的石英砂， 研磨均勻，形成勻漿液，后在1.5mL離心管a內(nèi)加入ImL的勻漿液，將含有勻漿液的1. 5mL 離心管a在65°C條件下，放置10分鐘，取出，然后在1.5mL離心管a內(nèi)加入120 μ L濃度為 7. 5mol/L的乙酸銨溶液，混合均勻，后將1. 5mL離心管a置于0°C的冰水混合物中，放置8 分鐘，取出，將1. 5mL離心管a送入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，得到上清液，備用；
2)在1.5mL離心管b中加入500 μ L的上清液、50 μ L濃度為3mol/L的NaAc和300 μ L 的異丙醇，混合均勻，形成混合液I，將含有混合液I的1. 5mL離心管b置于0°C的冰水混合物中，放置8分鐘，取出，后將1. 5mL離心管b送入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘， 離心10分鐘，棄去上清液，得到沉淀物，后在含有沉淀物的1. 5mL離心管b內(nèi)加入200 μ L 的TE溶液，使沉淀物溶解，然后加入200 μ L的氯仿和異戊醇混合液，混合均勻，形成混合液 II，備用；
3)在1.5mL離心管c中加入200 μ L的混合液II、20 μ L的濃度為3mol/L的NaAc和 700 μ L的無(wú)水乙醇，混合均勻，后將1. 5mL離心管c送入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心8分鐘，棄去上清液，得到下層沉淀，后用濃度為70%的乙醇對(duì)1. 5mL離心管c中的沉淀洗滌1次，待乙醇揮發(fā)完畢后，后加入1. 5mL離心管c中加入20 μ L的TE溶液，得到玉米青枯病原腐霉菌DNA，備用；
步驟七、玉米青枯病原腐霉菌DNA的轉(zhuǎn)接及純化 1)ITS引物序列
ITSl 5 ‘ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ‘ ITS4 5 ‘ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ‘2)在0.5mL離心管a中加入2. 0 μ L的10倍緩沖液、0. 5 μ L的dNTP、0. 5 μ L的ITS4 引物、0. 5 μ L的ITSl引物、0. 5 μ L的Taq聚合酶和20. 0 μ L的去離子水，混合均勻，得到混合液III，備用；
3)將含有混合液III的0.5ml離心管I放入基因擴(kuò)增儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性2分鐘，94 °C變性40秒，59°C退火40秒，72°C延伸100秒，變性、退火和延伸為一次循環(huán)，共35次循環(huán)，后72°C再次延伸10分鐘，取出，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，備用；
步驟八、擴(kuò)增產(chǎn)物的分離、鑒定
1)稱取0.25克瓊脂糖粉末加到含有25毫升瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的三角瓶中，將三角瓶?jī)?nèi)瓊脂糖凝膠電泳緩沖液加熱至沸騰并使瓊脂糖粉末充分溶解，加入2微升的溴化乙錠溶液，至混合均勻止，后倒入瓊脂糖制膠板中，插入制膠梳，凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳，在凝膠上出現(xiàn)一排點(diǎn)樣孔，將凝膠放入含有瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的電泳凝膠盒中，在凝膠的點(diǎn)樣孔中分別加入5微升的擴(kuò)增產(chǎn)物和2微升DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker，打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān)，在電泳儀電壓為100伏特時(shí)開(kāi)始電泳，電泳30分鐘后關(guān)閉電泳儀，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察到889bp的條帶時(shí)，備用；
2)用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化
取1. 5ml離心管d并稱其重量，在紫外燈下將擴(kuò)增產(chǎn)物從步驟1)中的凝膠上切下，將切下的擴(kuò)增產(chǎn)物放在已稱重的1. 5ml離心管d中，稱取1. 5ml離心管d的總重并計(jì)算出從凝膠上切下來(lái)的擴(kuò)增產(chǎn)物的重量，然后將1. 5ml離心管d中的擴(kuò)增產(chǎn)物搗碎，按擴(kuò)增產(chǎn)物的克數(shù)加入相同毫升數(shù)的DNA純化結(jié)合液，混合均勻，將1. 5ml離心管放置在50°C水浴中加熱至擴(kuò)增產(chǎn)物完全融解，得到混合液IV，將混合液IV加到DNA純化柱上，DNA純化柱位于收集管中，收集管在21°C條件下放置1分鐘，將收集管放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘， 離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內(nèi)的液體，向DNA純化柱上加入 700微升的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內(nèi)，后將收集管在21°C條件下放置1分鐘，后將收集管放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內(nèi)的液體，向DNA純化柱上加入500微升的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內(nèi)，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內(nèi)的液體，將DNA純化柱置于收集管內(nèi)，然后將收集管放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速 13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱放置于1. 5ml離心管e中，后在DNA純化柱上加入40微升洗脫液，將1. 5ml離心管e在21°C條件下放置1分鐘，然后將收集管放入離心機(jī)內(nèi)轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱得到1. 5ml離心管中e中的液體，
3)將步驟2)中回收、純化后的液體進(jìn)行測(cè)序，后將測(cè)出的DNA序列在基因庫(kù)Genbank 進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果表明，本發(fā)明測(cè)出的液體序列與DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄編號(hào)為 AY598627. 1和AY5986^. 1的序列具有同源性，且同源性為98%，在BLAST系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上觀察到玉米青枯病原腐霉菌，登錄編號(hào)(AY598627. 1)為芒孢腐霉菌，登錄編號(hào)(AY5986^. 1) 為強(qiáng)雄腐霉菌，根據(jù)rDNA的ITS區(qū)序列的一般分析準(zhǔn)則，本發(fā)明中分離檢測(cè)的霉菌為玉米青枯病原腐霉菌。
實(shí)施例3
一種利用分離培養(yǎng)基分離玉米青枯病原腐霉菌的方法，包括以下步驟為步驟一、抗生素培養(yǎng)基的配制
1)在濃度為80萬(wàn)U/瓶的青霉素鈉中加入無(wú)菌去離子水，混合均勻，制得濃度為20萬(wàn) U/mL的母液a，備用；
2)在濃度為100萬(wàn)U/瓶的硫酸鏈霉素中加入無(wú)菌去離子水，混合均勻，制得濃度為20 萬(wàn)U/mL的母液b，備用；
3)按重量份數(shù)比取1份的濃度為20萬(wàn)U/mL的母液a和1份的濃度為20萬(wàn)U/mL的母液b，混合均勻，制得濃度為10萬(wàn)U/mL的復(fù)合抗生素母液，備用；
步驟4)在4000mL的水中加入600g的馬鈴薯，煮40分鐘，過(guò)濾，得到馬鈴薯濾液，備
用；
步驟5)在1500mL的馬鈴薯濾液中加入30g的瓊脂、30g的葡萄糖和1. 5g的酵母浸膏，加熱至90°C，使瓊脂溶解，形成含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基煮至IOOOmL時(shí)，后將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分裝于10個(gè)三角瓶中，每瓶IOOmL,后將每個(gè)三角瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi)，在壓強(qiáng)為 1. 05kg/cm2，溫度為121°C，滅菌40分鐘，取出，后在21°C條件下冷卻至60°C止，在每個(gè)含有酵母浸膏馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)加入0. 7mL步驟3)中得到的復(fù)合抗生素母液，混合均勻，使每個(gè)三角瓶?jī)?nèi)的抗生素濃度為20U/mL，制得抗生素培養(yǎng)基，后將抗生素培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)抗生素培養(yǎng)基的含量為30mL，放置40分鐘，得到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂抗生素分離平板，備用；
步驟6)取步驟4)中得到的IOOOmL馬鈴薯濾液，在濾液中加入30g的瓊脂、30g的葡萄糖，1. 5g的酵母浸膏，加熱至90°C，使瓊脂溶解，后將溶液定容至IOOOmL,形成含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，后將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分裝于10 個(gè)三角瓶中，每瓶IOOmL,然后將每個(gè)三角瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi)，在壓強(qiáng)為1. 05kg/cm2，溫度為121°C，滅菌40分鐘，取出，后在21°C條件下冷卻至60°C止，將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)含有30mL的培養(yǎng)基，得到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，備用； 步驟二、病原菌的萌發(fā)
1)將含有病原菌的玉米桿，剝離葉片，用保鮮膜將玉米桿包裝好并放于10°C條件下，放置3天。 2)用75%的酒精將含有病原菌的玉米桿外側(cè)消毒，剪成IOcm的小段，剖開(kāi)玉米莖桿，將病變組織暴露，取三個(gè)直徑為Icm的病變組織塊，將病變組織塊接種到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂抗生素分離平板中，在條件下，培養(yǎng)5天，得到萌發(fā)后的病原菌，備用；
步驟三、在步驟一中得到的加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板內(nèi)，接種步驟二中得到的萌發(fā)后的病原菌，在條件下，培養(yǎng)5天，得到純化后的菌株，備用；
步驟四、依據(jù)步驟三的方法，在加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板內(nèi)接種步驟三得到的純化后的菌株，在條件下，培養(yǎng)5天，進(jìn)一步純化得到玉米青枯病原腐霉菌株，備用； 步驟五、將步驟四中的得到全部玉米青枯病原腐霉菌接種到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，在條件下，培養(yǎng)6天，得到玉米青枯病原腐霉菌絲，備用； 步驟六、玉米青枯病原腐霉菌DNA的提取
1)在研缽內(nèi)加入0. 5mg的玉米青枯病原腐霉菌絲、ImL的SDS裂解液和ImL的石英砂，研磨均勻，形成勻漿液，后在1. 5mL離心管a內(nèi)加入ImL的勻漿液，將含有勻漿液的1. 5mL 離心管a在65°C條件下，放置10分鐘，取出，然后在1.5mL離心管a內(nèi)加入120 μ L濃度為 7. 5mol/L的乙酸銨溶液，混合均勻，后將1. 5mL離心管a置于0°C的冰水混合物中，放置8 分鐘，取出，將1. 5mL離心管a送入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，得到上清液，備用；
2)在1.5mL離心管b中加入500 μ L的上清液、50 μ L濃度為3mol/L的NaAc和300 μ L 的異丙醇，混合均勻，形成混合液I，將含有混合液I的1. 5mL離心管b置于0°C的冰水混合物中，放置8分鐘，取出，后將1. 5mL離心管b送入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘， 離心10分鐘，棄去上清液，得到沉淀物，后在含有沉淀物的1. 5mL離心管b內(nèi)加入200 μ L 的TE溶液，使沉淀物溶解，然后加入200 μ L的氯仿和異戊醇混合液，混合均勻，形成混合液 II，備用；
3)在1.5mL離心管c中加入200 μ L的混合液II、20 μ L的濃度為3mol/L的NaAc和 700 μ L的無(wú)水乙醇，混合均勻，后將1. 5mL離心管c送入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心8分鐘，棄去上清液，得到下層沉淀，后用濃度為70%的乙醇對(duì)1. 5mL離心管c中的沉淀洗滌2次，待乙醇揮發(fā)完畢后，后加入1. 5mL離心管c中加入20 μ L的TE溶液，得到玉米青枯病原腐霉菌DNA，備用；
步驟七、玉米青枯病原腐霉菌DNA的轉(zhuǎn)接及純化
1)ITS引物序列
ITSl 5 ‘ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ‘
ITS4 5 ‘ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ‘
2)在0.5mL離心管a中加入2. 0 μ L的10倍緩沖液、0. 5 μ L的dNTP、0. 5 μ L的ITS4 引物、0. 5 μ L的ITSl引物、0. 5 μ L的Taq聚合酶和20. 0 μ L的去離子水，混合均勻，得到混合液III，備用；
3)將含有混合液III的0.5ml離心管I放入基因擴(kuò)增儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性2分鐘，94 °C變性40秒，59 °C退火40秒，72°C延伸100秒，變性、退火和延伸為一次循環(huán)，共35次循環(huán)，后72°C再次延伸10分鐘，取出，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，備用；
步驟八、擴(kuò)增產(chǎn)物的分離、鑒定
1)稱取0.25克瓊脂糖粉末加到含有25毫升瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的三角瓶中，將三角瓶?jī)?nèi)瓊脂糖凝膠電泳緩沖液加熱至沸騰并使瓊脂糖粉末充分溶解，加入2微升的溴化乙錠溶液，至混合均勻止，后倒入瓊脂糖制膠板中，插入制膠梳，凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳，在凝膠上出現(xiàn)一排點(diǎn)樣孔，將凝膠放入含有瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的電泳凝膠盒中，在凝膠的點(diǎn)樣孔中分別加入5微升的擴(kuò)增產(chǎn)物和2微升DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker，打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān)，在電泳儀電壓為100伏特時(shí)開(kāi)始電泳，電泳30分鐘后關(guān)閉電泳儀，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察到889bp的條帶時(shí)，備用；
2)用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化
取1. 5ml離心管d并稱其重量，在紫外燈下將擴(kuò)增產(chǎn)物從步驟1)中的凝膠上切下，將切下的擴(kuò)增產(chǎn)物放在已稱重的1. 5ml離心管d中，稱取1. 5ml離心管d的總重并計(jì)算出從凝膠上切下來(lái)的擴(kuò)增產(chǎn)物的重量，然后將1. 5ml離心管d中的擴(kuò)增產(chǎn)物搗碎，按擴(kuò)增產(chǎn)物的克數(shù)加入相同毫升數(shù)的DNA純化結(jié)合液，混合均勻，將1. 5ml離心管放置在50° C水浴中加熱至擴(kuò)增產(chǎn)物完全融解，得到混合液IV，將混合液IV加到DNA純化柱上，DNA純化柱位于收集管中，收集管在21°C條件下放置1分鐘，將收集管放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘， 離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內(nèi)的液體，向DNA純化柱上加入 700微升的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內(nèi)，后將收集管在21°C條件下放置1分鐘，后將收集管放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內(nèi)的液體，向DNA純化柱上加入500微升的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內(nèi)，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內(nèi)的液體，將DNA純化柱置于收集管內(nèi)，然后將收集管放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速 13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱放置于1. 5ml離心管e中，后在DNA純化柱上加入40微升洗脫液，將1. 5ml離心管e在21°C條件下放置1分鐘，然后將收集管放入離心機(jī)內(nèi)轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱得到1. 5ml離心管中e中的液體，
3)將步驟2)中回收、純化后的液體進(jìn)行測(cè)序，后將測(cè)出的DNA序列在基因庫(kù)Genbank 進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果表明，本發(fā)明測(cè)出的液體序列與DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄編號(hào)為 AY598627. 1和AY5986^. 1的序列具有同源性，且同源性為98%，在BLAST系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上觀察到玉米青枯病原腐霉菌，登錄編號(hào)(AY598627. 1)為芒孢腐霉菌，登錄編號(hào)(AY5986^. 1) 為強(qiáng)雄腐霉菌，根據(jù)rDNA的ITS區(qū)序列的一般分析準(zhǔn)則，本發(fā)明中分離檢測(cè)的霉菌為玉米青枯病原腐霉菌；
所述的DNA純化結(jié)合液的組成成份每升DNA純化結(jié)合液中含有25mmol的葡萄糖、 IOmmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量為水；
所述的洗滌液的組成成份按重量百分比洗滌液中含有8%的十二烷基硫酸鈉，余量為
水；
所述的洗脫液的組成成份每升洗脫液中含50mmol的三羥甲基氨基甲烷、IOmmol的乙二胺四乙酸，余量為水；
所述的SDS裂解液的組成成份每升SDS裂解液中含有50mM的三羥甲基氨基甲烷和 IOg的十二烷基硫酸鈉，余量為水；
所述的氯仿和異戊醇混合液的組成成分按體積比氯仿和異戊醇混合液中含有對(duì)份的氯仿和1份的戊醇；
所述的TE溶液的組成成份每升TE溶液中含有IOmmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、 Immol的乙二胺四乙酸，余量為水。
權(quán)利要求
1. 一種分離玉米青枯病原腐霉菌的方法，其特征在于分離玉米青枯病原腐霉菌所用的分離培養(yǎng)基的原料由瓊脂、葡萄糖、馬鈴薯、酵母浸膏和復(fù)合抗生素母液組成，各原料的加入量是15— 30g的瓊脂、15—30g的葡萄糖、150— 300g的馬鈴薯、0. 8—1. 5g的酵母浸膏和0. 4—0. 7mL的復(fù)合抗生素母液；利用分離培養(yǎng)基分離玉米青枯病原腐霉菌的方法，包括以下步驟為步驟一、抗生素培養(yǎng)基的配制1)在濃度為80萬(wàn)U/瓶的青霉素鈉中加入無(wú)菌去離子水，混合均勻，制得濃度為20萬(wàn) U/mL的母液a，備用；2)在濃度為100萬(wàn)U/瓶的硫酸鏈霉素中加入無(wú)菌去離子水，混合均勻，制得濃度為20 萬(wàn)U/mL的母液b，備用；3)按重量份數(shù)比取1份的濃度為20萬(wàn)U/mL的母液a和1份的濃度為20萬(wàn)U/mL的母液b，混合均勻，制得濃度為10萬(wàn)U/mL的復(fù)合抗生素母液，備用；步驟4)在4000mL的水中加入400_600g的馬鈴薯，煮30—40分鐘，過(guò)濾，得到馬鈴薯濾液，備用；步驟5)在1500mL的馬鈴薯濾液中加入15 — 30g的瓊脂、15 — 30g的葡萄糖和0. 8— 1. 5g的酵母浸膏，加熱至80—90°C，使瓊脂溶解，形成含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基煮至IOOOmL時(shí)，后將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分裝于10個(gè)三角瓶中，每瓶IOOmL,后將每個(gè)三角瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi)，在壓強(qiáng)為1.05kg/cm2，溫度為121°C，滅菌40分鐘，取出，后在21°C條件下冷卻至 60°C止，在每個(gè)含有酵母浸膏馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)加入0. 4-0. 7mL步驟 3)中得到的復(fù)合抗生素母液，混合均勻，使每個(gè)三角瓶?jī)?nèi)的抗生素濃度為20U/mL，制得抗生素培養(yǎng)基，后將抗生素培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)抗生素培養(yǎng)基的含量為 30mL，放置40分鐘，得到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂抗生素分離平板，備用；步驟6)取步驟4)中得到的IOOOmL馬鈴薯濾液，在濾液中加入15 — 30g的瓊脂、15— 30g的葡萄糖，0. 8—1.5g的酵母浸膏，加熱至80— 90°C，使瓊脂溶解，后將溶液定容至 lOOOmL，形成含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，后將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分裝于10個(gè)三角瓶中，每瓶IOOmL,然后將每個(gè)三角瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi)，在壓強(qiáng)為1.05kg/cm2，溫度為121°C，滅菌40分鐘，取出，后在21°C條件下冷卻至60°C止，將含有酵母浸膏的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)含有30mL的培養(yǎng)基，得到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，備用；步驟二、病原菌的萌發(fā)1)將含有病原菌的玉米桿，剝離葉片，用保鮮膜將玉米桿包裝好并放于10°C條件下，放置3天；2)用75%的酒精將含有病原菌的玉米桿外側(cè)消毒，剪成IOcm的小段，剖開(kāi)玉米莖桿，將病變組織暴露，取三個(gè)直徑為Icm的病變組織塊，將病變組織塊接種到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂抗生素分離平板中，在條件下，培養(yǎng)3-5天，得到萌發(fā)后的病原菌，備用；步驟三、在步驟一中得到的加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板內(nèi)，接種步驟二中得到的萌發(fā)后的病原菌，在條件下，培養(yǎng)3-5天，得到純化后的菌株，備用；步驟四、依據(jù)步驟三的方法，在加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板內(nèi)接種步驟三得到的純化后的菌株，在條件下，培養(yǎng)3-5天，進(jìn)一步純化得到玉米青枯病原腐霉菌株，備用；步驟五、將步驟四中的得到全部玉米青枯病原腐霉菌接種到加富馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，在條件下，培養(yǎng)6天，得到玉米青枯病原腐霉菌絲，即分離得到玉米青枯病原腐霉菌。
全文摘要
一種分離玉米青枯病原腐霉菌的方法，利用分離培養(yǎng)基分離玉米青枯病腐霉菌，包括引物設(shè)計(jì)及合成、玉米青枯病腐霉菌DNA的提取、目的基因的擴(kuò)增及分離和擴(kuò)增終產(chǎn)物的分離、進(jìn)行測(cè)序鑒定，并在基因庫(kù)Genbank進(jìn)行比對(duì)，確定為玉米青枯病腐霉菌，本發(fā)明利用分離培養(yǎng)基分離玉米青枯病腐霉菌的方法，其鑒定方法操作簡(jiǎn)單，鑒定結(jié)果迅速準(zhǔn)確，可以應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。
文檔編號(hào)C12N1/02GK102533568SQ201210009628
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者侯軍, 孫亞莉, 林曉民, 胡梅, 陳跟強(qiáng) 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)