專利名稱：一種固相化sumo化系統(tǒng)及固相化去sumo化系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于酶學領域，具體地說，涉及一種固相化SUMO化系統(tǒng)及一種固相化去 SUMO化系統(tǒng)。
背景技術：
在1996年，Blobel發(fā)現(xiàn)SUM0(Smt3)能夠共價的結合一個小G蛋白的激活蛋白RanGAPl，并能影響此蛋白在細胞核與核質的運輸，隨后第一次將此類小蛋白命名為 SUMO (small ubiquitin-like modifier)。隨后，SUMO化修飾在多種生命過程，在多種生物體(酵母，昆蟲，線蟲甚至高等脊椎動物)中被發(fā)現(xiàn)，并得到闡釋。SUMO在細胞的多項生理過程，在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中和某些藥物的作用過程中，都發(fā)揮著重要的調控作用，成為現(xiàn)階段蛋白質翻譯后修飾領域一個重要研究內容和商業(yè)化應用的重要領域。因此，如何對目的蛋白方便、快捷地進行SUMO化和去SUMO化就成為了其研究的一個熱點。目前對于SUMO化的研究方法主要為首先通過位點的預測尋找感興趣的可能被 SUMO化的蛋白，然后通過SUMO激活酶El (包括異源二聚體SAEI和SAEII)和SUMO轉移酶 Ubc9進行SUMO化確證，然后集中于研究SUMO化后的蛋白底物的功能。但由于進行SUMO化確證時，沒有一個合適的操作平臺，導致對目標蛋白的SUMO化及SUMO化后的后續(xù)處理均不方便，因此，需要一種能夠用于快速高通量鑒定蛋白SUMO化的系統(tǒng)，以簡化SUMO化操作。同時，在后基因組時代的研究中，研究一個基因的重要方面就是對它的翻譯產物的體外功能進行分析，因此，要求能夠方便快捷經濟地獲得重組蛋白質。然而隨后的實踐證明，在最為普遍使用的大腸桿菌表達系統(tǒng)中，人類基因組中只有約25%的基因能夠以可溶蛋白的方式表達。解決上述兩個問題的常用方法就是使用促溶表達融合標簽，比如葡萄糖親和標簽 MBP (maltose-binding protein)，谷胱甘肽轉移酶標簽 GST (glutathione S-transferase) 等。當外源蛋白質融合某些特定的標簽后，能夠有效增加重組蛋白質的產量和溶解性。但是，在融合標簽切除過程中，一個非常值得注意的問題就是許多蛋白質要獲得生物活性以及結構穩(wěn)定性都需要特定的N端氨基酸殘基，尤其是很多用于結構研究以及醫(yī)療用途的蛋白質。然而所有新生蛋白質在其N端都是甲硫氨酸，然后經過轉譯后加工修飾才形成其它不同的氨基酸。而常用的GST，NusA或者MBP標簽的切除，只能通過引入蛋白酶位點，在融合蛋白完成表達和純化后，加入蛋白酶切除蛋白質標簽。這樣在融合標簽切除過程中如何避免產生非天然N端氨基酸或者產生特異的N端氨基酸，是很多蛋白酶使用過程中所面臨的挑戰(zhàn)。而SUMO不僅是較好的促溶蛋白質表達標簽之一，更重要的是，SUMO融合標簽可以在體外被源于酵母的SUMO特異的蛋白質水解酶Ulpl極為高效和特異地切除，從而獲得與天然靶蛋白完全相同的重組蛋白質，滿足結構生物學研究和醫(yī)療用途的蛋白質需要。但使用水解酶Ulpl進行去SUMO化處理時，現(xiàn)尚沒有一個簡單合適的操作平臺， Ulpl酶的獲得需要繁瑣的純化過程，同時Ulpl的加入也會給目標蛋白的純化及其后續(xù)處理帶來了不便，因此，需要一種能夠十分簡便而又能高通量的進行去SUMO化的系統(tǒng)，從而能夠很好的解決上述問題，簡化去除SUMO融合標簽的操作。ChBD作為一個特殊的結構域，對于膽堿或者膽堿類似物有很強的親和吸附能力， 能夠特異性的吸附在二乙氨乙基纖維素(DEAE cellulose)上。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于，提供一種固相化SUMO化系統(tǒng)。本發(fā)明還有一個目的在于，提供固相化SUMO化系統(tǒng)的制備方法。本發(fā)明還有一個目的在于，提供固相化SUMO化系統(tǒng)的應用。本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種固相化去SUMO化系統(tǒng)。本發(fā)明還有一個目的在于，提供固相化去SUMO化系統(tǒng)的制備方法。本發(fā)明還有一個目的在于，提供固相化去SUMO化系統(tǒng)的應用。本發(fā)明提供的固相化SUMO化系統(tǒng)為固相化的SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶 SAEII或SUMO轉移酶Wdc9的SUMO化系統(tǒng)；或固相化SUMO激活酶SAEI和SUMO激活酶SAEII 的SUMO化系統(tǒng)；其中，SUMO化系統(tǒng)包括SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII或SUMO轉移酶 Wdc9。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述SUMO激活酶SAEI的序列選自(a) SEQ ID NO :1 ；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有 SUMO激活酶SAEI活性的由(a)衍生的蛋白質或多肽。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述SUMO激活酶SAEII的序列選自(i)SEQ ID NO :2 ；或(ii)在(i)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有 SUMO激活酶SAEII活性的由(i)衍生的蛋白質或多肽。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述SUMO轉移酶W3C9的序列選自(I)SEQ ID NO :3 ；或(II)在(I)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有 SUMO轉移酶W3C9活性的由(I)衍生的蛋白質或多肽。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII和SUMO轉移酶W3C9的固相化為通過ChBD序列的連接將所述SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII 和SUMO轉移酶W3C9吸附在二乙氨乙基纖維素上。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述ChBD序列選自(I)SEQ ID NO :4 ；或(2)在(1)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有 SUMO水解酶活性的由(1)衍生的蛋白質或多肽。本發(fā)明提供的固相化SUMO化系統(tǒng)的制備方法包括以下步驟:A)分別制備蛋白pChBD-SAEI，pChBD-SAEII 和 pChBD-SUMO 轉移酶 Ubc9 ；B)將步驟 A 中制備好的 pChBD-SAEI， PChBD-SAEII和pChBD-SUMO轉移酶W3c9分別與二乙氨乙基纖維素充分混合，或將步驟A中制備好的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII和pChBD-SUMO轉移酶Ubc9分別兩兩混合，再與二乙氨乙基纖維素充分混合，或將步驟A中制備好的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII和pChBD-SUMO轉移酶W3C9與二乙氨乙基纖維素共同充分混合，以獲得固相化的SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII和SUMO轉移酶Ubc9。本發(fā)明提供的固相化SUMO化系統(tǒng)的應用為用于高通量鑒定可SUMO化蛋白，或用于將可SUMO化蛋白SUMO化，以研究該可SUMO化蛋白的功能。本發(fā)明提供的固相化去SUMO化系統(tǒng)包括固相化的SUMO水解酶。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，所述SUMO水解酶的序列選自(I)SEQ ID NO 5 ；或 SEQ ID NO 6 ；或(2)在(1)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有 SUMO水解酶活性的由(1)衍生的蛋白質或多肽。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，SUMO水解酶的固相化通過ChBD序列吸附在二乙氨乙基纖維素上而將水解酶固相化。本發(fā)明提供的固相化去SUMO化系統(tǒng)的制備方法包括以下步驟:A)制備蛋白 pChBD-Ulpl ；B)將步驟A中制備好的pChBD-Ulpl與二乙氨乙基纖維素充分混合，以獲得固相化SUMO化系統(tǒng)。本發(fā)明提供的固相化去SUMO化系統(tǒng)的應用為在體外將SUMO化蛋白去SUMO化。使用本發(fā)明提供的固相化SUMO化系統(tǒng)可在溫和的反應條件下簡便地將可SUMO化的蛋白進行SUMO化；使用本發(fā)明提供的固相化去SUMO化系統(tǒng)可在溫和的反應條件下簡便地將SUMO化的蛋白去SUMO化，同時，上述固相化系統(tǒng)還可重復利用。


圖Ia為改造后的表達載體pET28a的改造部分的結構示意圖。圖Ib為改造后的表達載體pET28a的多克隆位點MCS序列。圖2為pChBD-Ulpl的固相化酶催化反應的檢測結果，其中，泳道1為Marker，泳道2為未加入游離Ulpl酶，只加入催化反應底物的陰性對照，泳道3為加入游離的Ulpl 酶的陽性對照，泳道4為固相化pChBD-Ulpl第1次催化反應的檢測結果，泳道5為固相化 pChBD-Ulpl第2次催化反應的檢測結果，泳道6為固相化pChBD-Ulpl第3次催化反應的檢測結果。圖3為未優(yōu)化的固相化SAEI，SAEII, Ubc9的SUMO化反應檢測結果，其中，泳道1 為三酶全游離的檢測結果，泳道2為三酶全固相化的檢測結果，泳道3-5為雙酶固相化的檢測結果，泳道6-8為單酶固相化的檢測結果。圖4為優(yōu)化的固相化雙酶及三酶的SUMO化反應檢測結果，其中，泳道1為三酶全游離的檢測結果，泳道2為三酶全固相化的檢測結果，泳道3-5為雙酶固相化的檢測結果。圖5為優(yōu)化的固相化SAEI，SAEII雙酶的SUMO化反應檢測結果，其中，泳道1_3分別為同時固相化SAEI，SAEII雙酶，催化SUMO化反應的第一次至第三次的催化反應結果。
具體實施例方式蛋白及其衍生的蛋白本發(fā)明的蛋白質或多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。本發(fā)明蛋白質或多肽的衍生形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50 個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N 末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質或多肽的功能，例如本發(fā)明的蛋白質或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基而仍然具有相應活性?？刹捎幂椛浠虮┞队谡T變劑下來產生隨機誘變，也可通過定點誘變法或其它已知的分子生物學技術來獲得上述衍生的蛋白質或多肽。根據重組生產方案所用的宿主，本發(fā)明的蛋白質或多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。該術語還包括蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與本發(fā)明蛋白編碼序列雜交的序列所編碼的蛋白、以及利用抗本發(fā)明蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還可使用其它多肽，如包含本發(fā)明蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了本發(fā)明蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有本發(fā)明蛋白序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約 100個連續(xù)氨基酸。如本文所用，衍生蛋白是指與本發(fā)明蛋白序列可高度同源或與上述分子高度同源的家族基因分子，所述蛋白具有相應活性。現(xiàn)有技術中已公開了本發(fā)明及其同源蛋白的序列，這些本領域已知的蛋白均包括在本發(fā)明中。本發(fā)明中SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII，SUMO轉移酶證⑷優(yōu)選獲自人。 本發(fā)明中SUMO水解酶優(yōu)選為酵母SUMO水解酶Ulpl。應理解，獲自其它生物(與本發(fā)明如具有50%以上，優(yōu)選55%以上、60%以上、 65%以上、70%以上、75%以上、80%以上，更優(yōu)選85%以上如85%、90%、95%、甚至98% 序列相同性)的其它蛋白也在本發(fā)明優(yōu)選考慮的等同范圍之內。比對序列相同性的方法和工具也是本領域周知的，如BLAST。親和標簽本發(fā)明所述的親和標簽選自但不僅限于以下標簽Chitin binding domain (ChBD), amino acid recognition sequence of a biotin ligase (例如 AviTag), Glutathione-S-Transferase (GST, Invitrogen), His6hexapeptide, Strep-tag 11 (Sigma GenoSys), calmodulin binding peptide (CBP, KRRWKKNFIAVSMNRFKKISSSGAL, Stratagene), hemagglutinin (HA, YPYDVPDYA, BD Biosciences), FLAG(DYKDDDD, Sigma Aldrich)，Myc(EQKLISEEDL, Stratagene)。
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以下結合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實驗室手冊》(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或產商推薦的條件進行。 在本發(fā)明的下述實施例中，按照hvitrogen公司的手冊，將Ulpl酶活定義為1 單位 Ulpl 活性為在 20μ 1 體系(50mM Tris-HCl, pH8. 0,150mM NaCl,5mM β -mercaptoethanol)中，30°C 1小時能夠切割2ug的SUM0EGFP標準蛋白質底物的酶量。以下實施例中，使用的材料來源如下QIAEX II Gel Extraction Kit 150 試劑盒購自 QIAGEN 公司。載體 pET28a 購自 Novagen 公司。Taq酶、溶菌酶購自Tiangen公司，限制性內切酶HindIII和Kpnl、NheI和Xhol、 XbaI，SalI、DNase I 均購自 NEB 公司。pEGFP-Cl 購自 Clontech 公司。大腸桿菌BL21 購自 hvitrogen。superscript III 試劑盒購自 hvitrogen。TIANamp酵母基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN。293T 細胞購自 ATCC。Ulpl 酶購自 Fulengen。TlBuffe 的配方為Tris_HCl (ρΗ7· 5) 50mM, NaCl 50mM, EDTA ImM。Ulpl 酶切反應 buffer 的配方為50mM Tris-HClpH 8. 0,150mM NaCl, 5mMβ -mercaptoethanolο實施例1、制備ChBD目標序列1.1、引物設計設計引物I^rimerl-lO，用于擴增制備ChBD目標序列，其中，Primerl-IO的序列分別如下所示Primerl 5 ‘ -GGCTGGCAGAAGAATGACACTGGCTACTGGTACGTACATTCAGACG GCTCTTATCCAAA-3‘；Primer2 5 ‘ -CAAAGTAGTACCAAGTGCCATTGATTTTCTCAAACTTGTCTTTTGGAT AAGAGCCGTCT-3‘；Primer3 5 ‘ -GCACTTGGTACTACTTTGACAGTTCAGGCTATATGCTTGCAGACCGCT GGAGGAAGCAC-3‘；Primer4 5 ‘ -ATTTCGCCTGAGTTGTCGAACCAGTACCAGTTGCCGTCTGTGTGCTT CCTCCAGCGGTC-3‘；Primer5 5 ‘ -CGACAACTCAGGCGAAATGGCTACAGGCTGGAAGAAAATCGCTGAT AAGTGGTACTATT-3‘；Primer6 5 ‘ -GTACTTGACCCAGCCTGTCTTCATGGCACCTTCTTCGTTGAAATAGTA CCACTTATCAG-3‘；Primer7 5 ‘ -ACAGGCTGGGTCAAGTACAAGGACACTTGGTACTACTTAGACGCTAAAGAAGGCGCCAT-3‘；Primer8 :5 ‘ -AGCCTGTTCCGTCCGCTGACTGGATAAAGGCATTTGATACCATGGCG CCTTCTTTAGCG-3‘；Primer9 5 ‘ -CAGCGGACGGAACAGGCTGGTACTACCTCAAACCAGACGGAACACT GGCAGACAGGCCA-3‘；PrimerlO 5' -TGGCCTGTCTGCCAGTGTTCCGTCTGGTTT-3‘。1.2、PCR 擴增分別以Primer2和3為模板，Primerl和4為引物對；Primer6和7為模板，Primer5 和8為引物對；Primer8和9為模板，Primer7和10為引物對，進行PCR擴增。然后，使用QIAEX II Gel Extraction Kit 150試劑盒分別純化回收擴增產物，并將得到的3個PCR擴增片段作為模板，以ft~imerl和10為引物進行二次PCR擴增。在擴增完成后，加入Taq酶lul，于72°C反應30min，以在目的片段兩端加上A，然后，使用QIAEX II Gel Extraction Kit 150試劑盒純化回收，獲得在序列兩端加A的ChBD 序列。1.3、連接與轉化將步驟1. 2中獲得的在序列兩端加A的ChBD序列通過TA克隆插入T載體，然后將連接產物轉化到RbCl感受態(tài)細胞中。使用堿法抽提質粒，并進行酶切鑒定和序列測定，測序結果如SEQ ID NO. :4所示， 根據酶切鑒定和序列測定的結果，ChBD目標序列轉化成功。實施例2、ChBD序列轉化感受態(tài)細胞2. 1、引物設計及PCR擴增設計引物I^rimerll和I^rimerl〗，其序列分別如下所示Primerll 5' -CCCMGCTTATGGTACATTCAGACGGCTCTTATCC-3‘；Primer12:5' ~CGGGGTACCTGGCCTGTCTGCCAGTGTTCCGT~3‘。其中，Primerll中下劃線標識的序列為HindIII識別位點；Primerl2中下劃線標識的序列為KpnI識別位點。以實施例1. 3中獲得的質粒為模版，以I^rimerll和ft~imerl2為引物對，進行PCR 擴增，然后進行凝膠電泳檢測，獲得ChBD擴增序列。然后，使用QIAEX II Gel Extraction Kit 150試劑盒純化回收擴增產物。2. 2、連接與轉化使用酶HindIII和KpnI分別對經改造的表達載體pET28a(改造部分的結構如圖1 所示)和步驟2. 1中獲得的擴增產物進行酶切，然后使用T4DNA連接酶連接后，轉化E. coli 感受態(tài)細胞DH5 α。然后使用堿法小量抽提質粒，并對抽提獲得的質粒進行酶切鑒定，結果顯示，ChBD 序列轉化感受態(tài)細胞DH5 α成功，獲得pChBD載體。實施例3、pChBD-SAEI, pChBD-SAEII，pChBD~Ubc9, pChBD-Ulpl 載體及 SUM01-pET28a 和 I^opI-pETZSa 質粒構建參考產品使用手冊，使用Superkript III試劑盒，用人源的細胞構建cDNA 文庫。
參考產品使用手冊，使用TIANamp酵母基因組DNA提取試劑盒提取釀酒酵母基因組。設計引物SAEI-pF、SAEI-pR、SAEII-pF、SAEII-pR、Ubc9_pF、Ubc9_pR、Ulpl-pF、 Ulpl-pR、SUM01-pF、SUM01-pR、Topol-pF 和 Topol-pR，序列如下SAEI-pF :AATCCGGCTAGCATGGTGGAGAAGGAGGAGGC ；SAEI-pR :AAGAAGAATTCCTCGAGTCACTTGGGGCCAAGGCA ；SAEII-pF CCGGAATTCGCTAGCATGGCACTGTCGCGGGGGCT ；SAEII-pR :AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCGAGTCAATCTAATGCTATGACATCATCA ；Ubc9-pF :GGGAATICCAIAIGICGGGGAICGCCCI ；Ubc9-pR :AACCCAAGCTTATGAGGGCGCAAACTTCTT ；Ulpl-pF :GGGAATTCCATATGGCTAGCCTTGTTCCTGAATTAAATG ；Ulpl-pR:CCGGAATTCACTCGAGCTATTTTAAAGCGTCGGTTA ；SUMOl-pF :ATGGGAATTCGGTACCCATATGTCTGACCAGGAGGCAAAA ；SUMOl-pR :AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCGAGCTAACCCCCCGTTTGTTCCTGA ；Topo1-pF :AATAGGGCTAGCGATCGCCATGAGTGGGGACCACCTCC ；Topol-pR :AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCTT CCTCTTCTTTCTTCGGCTT。以構建好的人cDNA文庫為模板，分別以引物SAEI-pF和SAEI-pR、SAEII-pF和 SAEII-pR、Ubc9-pF 和 Ubc9_pR、SUM01-pF 和 SUM01-pR、以及 Topo 1-pF 和 Topol-pR 為引物對，進行PCR擴增，PCR擴增產物經QIAEX II Gel Extraction Kit 150膠回收，獲得相應的基因片段，其中，SAEI基因片段序列如SEQ ID NO 1所示，SAEII基因片段序列如SEQ ID NO 2所示，Ubc9基因片段序列如SEQ ID NO 3所示。以提取的酵母基因組為模板，以Ulpl-pF，Ulpl-pR為引物，進行PCR擴增，PCR擴增產物經QIAEX II Gel Extraction Kit 150膠回收，獲得Ulpl基因片段，獲得Ulpl基因片段如SEQ ID NO 5所示，Ulpl基因片段的全長序列如如SEQ ID NO 6所示。將SAEI基因片段和SAEII基因片段通過NheI和BioI雙酶切，并將酶切產物連接入同樣經過NheI和BioI雙酶切的pChBD載體中，經測序確定，得到了 N端為ChBD，C端為 SAEI 和 SAEII 的融合克隆 pChBD-SAEI 和 pChBD-SAEII。采用同樣的方法，分別得到了 N端為ChBD，C端為W3C9的融合克隆、N端為ChBD， C 端為 Ulpl 的融合克隆 pChBD-Ubc9 和 pChBD-Ulpl，以及 pET28a_SUM01 和 pET28a_Topol。將上述重組表達質粒轉化大腸桿菌BL21后，誘導培養(yǎng)，表達其相應的蛋白并進行檢測，具體操作如下接種單克隆菌落于LB培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)12 14小時；取上述培養(yǎng)菌液按1 100 比例接種于新鮮的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D_為0. 6 0. 8，加入異丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)，22°C培養(yǎng)16-20h。6000rpm離心1分鐘收集菌體。然后將菌體溶于含有0. 5mg/ml溶菌酶的破菌緩沖液中，液氮凍融，反復三次，力口入DNase I至終濃度為25mg/ml以及MgSO4至終濃度20mM，冰上消化至不粘，18000rpm/min 離心15分鐘后分別取上清S，沉淀P和全菌W，進行SDS-PAGE電泳，并以未誘導全菌Neg作為對照。
結果顯示，分別獲得了表達pChBD-SAEI，pChBD-SAEII，pChBD_Ubc9，pChBD-Ulpl， SUMOl和TopoI的菌株。實施例4、SUM0-EGFP融合蛋白制備4.1、引物設計設計引物P1、P2、P3和P4，序列如下所示Pl :5，-GCGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’ ；P2 :5， -CGAATTCTCGAGTCACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’ ；P3 5' -CACCTACCATGGGTCATCACCATCA-3’ ；P4 5，-GGAATTCTTTCATACCTCCAATCTGTTCGCGG-3，。其中，引物Pl和P4的下劃線為EcoRI識別位點，引物P2的下劃線為BiolI識別位點，引物P3的下劃線為NcoI識別位點。4. 2、pET28a-6His-EGFP 質粒構建以質粒pEGFP-Cl為模板，以引物Pl和P2為引物對，進行PCR擴增，然后將PCR擴增產物使用QIAEX II Gel Extraction Kit 150回收，獲得EGFP序列的擴增產物。將EGFP序列的擴增產物和表達載體pET28a分別使用EcoRI和BioI酶切，并連接后，轉化E. coli感受態(tài)細胞DH5 α，經檢測獲得pET28a-6His_EGFP質粒。4. 3、SUM0-EGFP融合表達載體構建以釀酒酵母基因組為模板，以引物P3和P4為引物對，PCR擴增獲得SUMO基因，然后以NcoI和EcoRI酶切后插入到經過同樣酶切的pET28a-6His-EGFP中，獲得SUM0-EGFP 融合表達載體。4. 4、SUM0-EGFP 融合蛋白獲得將步驟4. 3中獲得的SUM0-EGFP融合表達載體經IPTG誘導表達后，經Ni柱純化， 獲得SUM0-EGFP融合蛋白。實施例5、pChBD_Ulpl固相化取步驟3. 3中獲得的表達pChBD-Ulpl的菌株進行誘導培養(yǎng)，然后，進行如下操作， 以實現(xiàn)PChBD-Ulpl固相化(1) 5ml誘導表達的菌液離心后去除培養(yǎng)液加入600ul TlBuffer混勻。(2)加入溶菌酶至終濃度0. 5mg/ml，冰上1小時。(3)超聲破菌(400w,40次，每次2s，間隔8s)。(4)超聲后的菌液4度離心13000rpm離心30分鐘。(5)與此同時對DEAE Beads進行處理，每份樣品取Beads lOOul，離心以去除保存液，并用TlBuffer洗滌3次。(6)超聲后的菌液離心后，取其上清蛋白粗提物加入到洗滌后的Beads中。(7)4度混旋儀上旋轉混勻1小時以充分結合。(8)6000rpm離心1分鐘，收集結合后的上清。(9) TlBuffer 500ul 洗滌 Beads。6000rpm 離心 1 分鐘。(10)再用高鹽洗脫Buffer 500ul洗滌2次，去除雜蛋白。經檢測，流出液中的Ulp 1含量明顯少于上清蛋白粗提物中的Ulp 1含量，從而可確 SpChBD-Ulpl固相化成功。
實施例6、DChBD-UlDl的固相化酶催化反應使用實施例5中獲得的pChBD-Ulpl進行固相化酶催化反應，其中，向底物中加入 Ulpl酶作為陽性對照；底物中不加入Ulpl酶，作為陰性對照；具體步驟和條件如下(1)結合 pChBD-Ulpl 后的 DEAE Beads 再用 Ulpl 酶切反應 buffer 500ul 洗滌一次。離心，洗盡上清。(2)加入Ulpl酶切反應Buffer IOOul，SUM0-EGFP融合蛋白2ug，4度混旋儀反應過夜。(3)設置陽性對照和陰性對照，陽性對照為SUM0-EGFP融合蛋白2ug，Ulpl酶1U， Buffer補足至20ul ；陰性對照為加入SUM0-EGFP融合蛋白2ug，不加Ulpl酶，同樣補足 Buffer至20ul，4度混旋儀反應過夜。(4)過夜反應后，6000rpm離心1分鐘，取上清樣品，加入Loading Buffer于100°C 煮樣品10分鐘，留待SDS-PAGE膠電泳分析。(5)固相化的Ulpl酶在取盡上清后，再用酶切反應buffer 500ul洗滌1次，再加入酶切反應bufferlOOul，SUM0-EGFP融合蛋白2ug，繼續(xù)4度混旋儀反應8小時。(6)重復步驟⑷、(5)以進行第三次反應。樣品進行SDS-PAGE膠電泳分析，結果如圖2所示。根據圖2結果，固相化之后的Ulpl仍然具有很好的酶活性，通過簡單的高鹽洗脫過程可以將雜蛋白洗脫，只在beads上留下所需的Ulpl酶。同時，由于酶的催化反應本身的特性，在反應的過程中并不會被消耗，利用溫和的反應條件可以使固相化酶的重復利用成為可能。在4度的反應條件下，進行到第三次酶催化反應，被固相化的Ulpl仍然具有很好的活性。同時，由于Ulpl酶本身不會隨著反應液的洗脫而存在與反應之后的底物中，更利于后面相應的檢測和反應。因此，固相化Ulpl酶催化反應體系存在的潛在商業(yè)價值。實施例7、pChBD-SAEI, pChBD-SAEII，pChBD_Ubc9 的固相化及催化7. 1、單酶固相化采用實施例5中的方法，將pChBD-SAEI，pChBD-SAEII，PChBD_Ubc9分別進行固相化，獲得單獨固相化的 pChBD-SAEI，pChBD-SAEII, pChBD_Ubc9。7. 2、固相化單一酶的催化反應將單獨固相化的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII或pChBD-Ubc9與純化好的非固相化的另2種相應的酶混合，進行催化反應，同時，加入均為非固相化的上述3種酶進行催化作為陽性對照，其中，進行催化反應時，各酶濃度分別如下SAEI為500ng，SAEII為lugjbd為 1. 5ug，底物為TopoI Iug和SUMO lug，其中，TopoI和SUMO由表達TopoI和SUMOl的菌株 pET28a-Topol和pET28a_SUM01分別經誘導表達、純化獲得。反應結束后，取反應溶液進行Western Blot檢測分析，結果如圖3所示。7. 3、固相化雙酶和固相化三酶的催化反應將固定化的pChBD-SAEI，pChBD-SAEII，PChBD_Ubc9全部混合或兩兩混合，分別獲得固定化雙酶和固定化三酶，然后參考步驟7. 2中的方法，檢測其催化反應，結果如圖3所
7J\ ο圖3結果顯示，在僅僅只固相化一個酶的情況下，SUMO化反應能夠較為正常的進
11行，但當固相化三者當中的兩者或者三者全部固相化的時候，SUMO化的反應已經十分微弱， 甚至根本不能被檢測。根據上述結果，實際的酶催化反應遠比想象的復雜，可能存在更多的空間結構位點變化，固相化之后的酶難以在空間結構上相互接近來完成反應。因此，需要對其固相化過程進行優(yōu)化改進，以便于獲得能催化SUMO化反應較為正常的進行的固相化系統(tǒng)。7. 4、優(yōu)化的固相化雙酶和固相化三酶體系制備將酶pChBD-SAEI和pChBD_SAEII同時進行固相化，具體方法與實施例4中的方法基本相同，但進行雙酶固相化時，將步驟(6)改為，在Beads內同時加入pChBD_SAEI和 PChBD-SAEII的蛋白粗提物，從而獲得優(yōu)化的pChBD-SAEI和pChBD-SAEII雙酶固相化催化體系。采用上述同樣的方法，分別獲得其他的優(yōu)化的固相化雙酶和固相化三酶催化體系。7. 5、優(yōu)化的固相化雙酶和固相化三酶的催化反應將步驟7. 4中獲得的pChBD-SAEI和pChBD-SAEII的固相化雙酶與純化好的非固相化的pChBD-Ubc9混合，進行催化反應，其中，加入的SAEI為500ng，SAEII為lug，W3c9為 1. 5ug，底物為帶有 Flag tag 的 Topl-Ilug，SUMO lug。同時，采用同樣的條件，將步驟7. 4中獲得的其他固定化雙酶與對應的純化好的非固相化的酶混合，并進行催化反應。采用同樣的條件，使用步驟7. 4中獲得的固相化三酶催化體系進行催化。上述催化反應結束后，采用步驟7. 2中的方法，檢測其催化反應，結果如圖4所示。上述結果顯示，在同時固相化SAEI和SAEII，并加入流動相的證⑷的情況下能夠完成SUMO化的催化反應，并且在第二次和第三次的反應中仍然能夠完成SUMO化的催化反應，結果如圖5所示，但是采用其他的固定化雙酶或固定化三酶反應體系，則無法完成SUMO 化的催化反應。根據上述結果，同時固相化SAEI和SAEII，并加入流動性的W3c9，可用于SUMO化固相化酶催化反應，在一定程度上擴展了 SUMO化固相化酶催化反應體系的應用。綜上所述，本發(fā)明提供了一種SUMO化固相化酶催化反應體系，用于高通量鑒定可 SUMO化蛋白，或用于將可SUMO化蛋白SUMO化，以用于研究可SUMO化蛋白的功能；同時，本發(fā)明還提供了一種去SUMO化固相化酶催化反應體系，以獲得與天然靶蛋白完全相同的重組蛋白質，從而滿足結構生物學研究和醫(yī)療用途的蛋白質需要。通過一步化的結合和簡單的洗脫過程，能夠快速的獲得大量的固相化蛋白，同時由于固相化酶本身不會隨著反應液的洗脫而存在于反應之后的底物中，更利于后面相應的檢測和反應。同時由于酶的催化反應本身的特性，在反應的過程中并不會被消耗，利用溫和的反應條件可以使固相化酶的重復利用成為可能。因此，上述固相化酶催化反應體系具有很好的應用前景。即使用本發(fā)明提供的固相化SUMO化系統(tǒng)可在溫和的反應條件下簡便地將可SUMO化的蛋白進行SUMO化； 使用本發(fā)明提供的固相化去SUMO化系統(tǒng)可在溫和的反應條件下簡便地將SUMO化的蛋白去 SUMO化，同時，上述固相化系統(tǒng)還可重復利用。
權利要求
1.一種固相化去SUMO化系統(tǒng)，其特征在于，所述固相化去SUMO化系統(tǒng)包括固相化的 SUMO水解酶。
2.如權利要求1所述的固相化去SUMO化系統(tǒng)，其特征在于，所述SUMO水解酶的序列選自(1)SEQ ID NO :5 ；或 SEQ ID NO :6 ；或(2)在(1)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有SUMO 水解酶活性的由(1)衍生的蛋白質或多肽。
3.如權利要求1所述的固相化去SUMO化系統(tǒng)，其特征在于，所述SUMO水解酶固相化為通過親和標簽的連接將所述SUMO水解酶吸附在與親和標簽有親和結合作用的介質上。
4.如權利要求3所述的固相化SUMO化系統(tǒng)，其特征在于，所述親和標簽選自但不僅限于以下標簽Chitin binding domain (ChBD), AviTag, Glutathione-S-Transferase (GST), His6hexapeptide, calmodulin binding protein (CBP), protein C tag, hemagglutinin (HA) tag, aFLAGtag 禾口 Myctag0
5.如權利要求3所述的固相化去SUMO化系統(tǒng)，其特征在于，所述SUMO水解酶固相化為通過ChBD序列的連接將所述SUMO水解酶吸附在二乙氨乙基纖維素上。
6.如權利要求5所述的固相化SUMO化系統(tǒng)，其特征在于，所述ChBD序列選自(1)SEQID NO 4 ；或(2)在(1)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有SUMO 水解酶活性的由(1)衍生的蛋白質或多肽。
7.如權利要求5所述的固相化去SUMO化系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟A)制備蛋白pChBD-SUMO水解酶；B)將步驟A中制備好的pChBD-SUMO水解酶與二乙氨乙基纖維素充分混合，以獲得固相化去SUMO化系統(tǒng)。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，在步驟B后還包括高鹽洗脫以去除雜蛋白的步驟。
9.如權利要求1或3所述的固相化去SUMO化系統(tǒng)的應用，其特征在于，所述應用為在體外將SUMO化蛋白去SUMO化，以獲得與天然靶蛋白序列完全相同的重組蛋白質。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種固相化SUMO化系統(tǒng)及一種固相化去SUMO化系統(tǒng)。本發(fā)明提供的固相化SUMO化系統(tǒng)固相化的SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII或SUMO轉移酶Ubc9的SUMO化系統(tǒng)；或固相化SUMO激活酶SAEI和SUMO激活酶SAEII的SUMO化系統(tǒng)；其中，SUMO化系統(tǒng)包括SUMO激活酶SAEI，SUMO激活酶SAEII或SUMO轉移酶Ubc9。固相化去SUMO化系統(tǒng)包括固相化的水解酶Ulp1。使用本發(fā)明提供的固相化SUMO化系統(tǒng)可在溫和的反應條件下簡便地將可SUMO化的蛋白進行SUMO化；使用本發(fā)明提供的固相化去SUMO化系統(tǒng)可在溫和的反應條件下簡便地將SUMO化的蛋白去SUMO化，同時，上述固相化系統(tǒng)還可重復利用。
文檔編號C12P21/06GK102533712SQ20121001097
公開日2012年7月4日 申請日期2009年5月12日 優(yōu)先權日2009年5月12日
發(fā)明者楊淑偉, 程夏楷 申請人:中國科學院上海生命科學研究院