專利名稱：一種檢測cyp2c19基因分型的熒光pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及體外核酸檢測領域，尤其涉及一種在臨床樣本中檢測常用藥物代謝的細胞色素氧化酶P4502C19(CYP2C19)基因的兩個位點的基因型，即CYP2C19*2 (681G/A)與 CYP2C19*3 (636G/A)的熒光 PCR 試劑盒。
背景技術(shù)：
細胞色素P450(CytochromeP450，CYP450)是由一組結(jié)構(gòu)和功能相關的超家族基因(Superfamily gene)編碼的同工酶，在人類身體中，其主要存在于肝細胞微粒中。在 CYP450超家族中，CYP2是最大的家族，有15個亞家族，它們代謝約20%目前臨床使用的藥物。其中CYP2C19(S-美芬妥英羥化酶)是CYP450的主要成分之一，CYP2C19基因cDNA全長1940，含有9個外顯子，編碼區(qū)為1473bp。其編碼的蛋白S-美芬妥英羥化酶代謝一系列臨床藥物，如氯吡格雷、美芬妥英、奧美拉唑、普萘洛爾、地西泮、去甲地西泮、舍曲林等。研究表明很多藥物代謝表型的差異源于CYP2C19基因突變，中國人常見的兩種單核苷酸突變?yōu)镃YP2C1腫2型和CYP2C19*3型，分別為CYP2C19基因的第5外顯子G681A和第4外顯子G636A的突變。其中CYP2C1腫2型G681A點突變產(chǎn)生了一個異常的拼接位點，使外顯子5'端的前40bp核苷酸發(fā)生缺失，改變了隨后mRNA的閱讀框，從而使蛋白的合成過早終止，使其合成的S-美芬妥英羥化酶缺乏血紅素結(jié)合位點，使其失去活性。CYP2C19*3型 G636A點突變使編碼色氨酸密碼子變?yōu)榻K止子，也導致蛋白合成提前終止，使合成的酶缺乏血紅素及底物結(jié)合區(qū)而失去活性。這些點突變引起了 S-美芬妥英羥化酶的活性和下降，代謝底物的能力減弱，使血藥濃度增高，從而引起與血藥濃度相關的藥品不良反應。根據(jù)CYP2C19基因型改變而引起酶代謝活性的改變，可將人群根據(jù)對藥物代謝能力分為三大類藥物強代謝型(EM，extensive metabolisers)CYP2C19野生型，CYP2C19雜合型代表的是中間代謝型(IM)，弱代謝型(PM)為突變型純合子。CYP2C1腫2在中國人中發(fā)生率是30%，CYP2C19*3是5%，而這兩種突變幾乎涵蓋了中國人所有的弱代謝型(PM)。CYP2C19基因型與腫瘤發(fā)病危險性CYP2C19基因的遺傳多態(tài)性與多種腫瘤癌癥的發(fā)生有關。研究結(jié)果表明，CYP2C19 可能參與食管癌、胃癌、肺癌、急性白血病鱗狀細胞肺癌、肝癌等前致癌物的活化，即 CYP2C19基因的突變將增加患食管癌、胃癌、肺癌、急性白血病鱗狀細胞肺癌、肝癌的危險性。因此，對人群中CYP2C19基因進行分型檢測，能為臨床上對某些腫瘤的易感性預測以及早期癌變預警提供重要的理論依據(jù)，有助于腫瘤癌癥的前期預防。CYP2C19基因主要影響的幾種藥物代謝有氯吡格雷氯吡格雷為噻吩并吡啶衍生物，是一類新型的抗血小板藥物，氯吡格雷本身無治療效應，它由細胞色素P450氧化生成活性代謝產(chǎn)物(一種硫醇衍生物)而發(fā)揮作用。CYP2C19的變異是目前發(fā)現(xiàn)的氯吡格雷療效個體差異的主要原因。CYP2C19基因的突變降低了氯吡格雷抗血小板聚集的療效，并呈現(xiàn)出基因劑量效應。美芬妥英美芬妥英是臨床常用廣譜抗癲癇藥，其血藥濃度、療效和不良反應存在顯著個體差異，主要與藥物代謝及反應的遺傳多態(tài)性有密切關系。其中CYP2C19基因多態(tài)性可引起不同個體服用美芬妥英后出現(xiàn)特異性的藥理及毒理作用，造成藥物治療效果的差已升。奧美拉唑奧美拉唑是目前應用最為廣泛的質(zhì)子泵抑制劑(PPI)之一，能抑制胃酸分泌，但長期大劑量使用將增加患者骨折的危險。在CYP2C19強代謝型人群中，奧美拉唑 80%都是由CYP2C19代謝。故此，CYP2C19基因突變型人群使用奧美拉唑的療效顯著低于 CYP2C19基因野生型人群。CYP2C19基因參與的藥物代謝還包括普萘洛爾、地西泮、去甲地西泮、舍曲林等， 患者對這些藥物的敏感性、耐藥性以及不良反應狀況都與患者本身CYP2C19基因多態(tài)性相關。因此根據(jù)檢測CYP2C19基因型的多態(tài)性來選擇用藥或者選擇最小有效劑量治療方案有重要的臨床意義。CYP2C19基因多態(tài)檢測技術(shù)目前常用的檢測CYP2C19基因點突變的方法有(I)PCR-RFLP基于突變的發(fā)生而形成的限制性內(nèi)切酶酶切位點的消失或增加的原理。是目前最簡單、最常見的一種檢測點突變的技術(shù)，操作簡單，特異性較高。但無法分辨雜合子，只能識別有限的多態(tài)性。(2) PCR-SSCP法，擴增的DNA片段在非變性凝膠電泳中，因電泳遷移率不同，因而可將突變基因和正?；騾^(qū)分開來。具有簡便快速的優(yōu)點，適于大批量篩選，但檢出率受DNA長度影響大。(3)DNA測序法是檢測點突變的金標準，與上述方法相比，最大的優(yōu)點就在于能夠直接顯示已知突變位點的位置和類型，此外還能發(fā)現(xiàn)新的突變位點。但是，這種方法操作步驟繁瑣，試劑和儀器昂貴，影響結(jié)果的因素多，對操作人員水平和實驗室條件要求高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高特異性、高靈敏度、高效率的MGB探針法定性檢測 CYP2C19的熒光PCR試劑盒。為了達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種檢測CYP2C19基因分型的熒光PCR試劑盒，所述試劑盒包括檢測基因 CYP2C1腫2型的PCR反應液、檢測基因CYP2C19*3型的PCR反應液、Taq酶、尿嘧啶DNA糖基化酶；所述的檢測CYP2C1腫2和CYP2C19*3基因的PCR反應液中均包含PCR Buffer、dNTP、 PCR擴增引物、MGB探針；其中檢測基因CYP2C19M型的PCR擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 3-4所示，所述檢測基因CYP2C19*3型的PCR擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 7-8所示。進一步地，所述檢測基因CYP2C1腫2型的MGB探針的核苷酸序列如SEQ ID NO 1~2 所示，檢測基因CYP2C19*3型的MGB探針的核苷酸序列如SEQ ID NO :5_6所示。進一步地，所述試劑盒還包括CYP2C1腫2型陽性對照品、CYP2C19*3型陽性對照品以及陰性對照品。進一步地，所述CYP2C1腫2型陽性對照品包含CYP2C1腫2型陽性對照品1_1、 CYP2C1腫2型陽性對照品1-2和CYP2C1腫2型陽性對照品1_3 ；所述CYP2C19*3型陽性對照品包含CYP2C19*3型陽性對照品2-1、CYP2C 19*3型陽性對照品2_2以及CYP2C19*3型陽性對照品2-3
進一步地，所述的CYP2C1腫2型陽性對照品1_1插入有如SEQ IDNO 10所示的核苷酸序列的野生純合子質(zhì)粒；CYP2C1腫2型陽性對照品1-2為插入有如SEQ ID NO 9所示的核苷酸序列的突變純合子質(zhì)粒；CYP2C1腫2型陽性對照品1-3為由所述突變純合子質(zhì)粒和所述野生純合子質(zhì)粒組成的雜合子質(zhì)粒。進一步地，所述雜合子質(zhì)粒中，述突變純合子質(zhì)粒和所述野生純合子質(zhì)粒的比例為 1 1。進一步地，所述的CYP2C19*3型陽性對照品2-1為插入有如SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列的野生純合子質(zhì)粒；CYP2C19*3型陽性對照品2-2為插入有如SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列的突變純合子質(zhì)粒；CYP2C19*3型陽性對照品2-3為由所述突變純合子質(zhì)粒和所述野生純合子質(zhì)粒組成的雜合子質(zhì)粒。進一步地，所述雜合子質(zhì)粒中，述突變純合子質(zhì)粒和所述野生純合子質(zhì)粒的比例為 1 1。進一步地，所述質(zhì)粒為pMD18-T質(zhì)粒。進一步地，所述的陰性參考品為β -actin質(zhì)粒。本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果1)本發(fā)明提供的檢測CYP2C19基因分型的熒光PCR試劑盒具有PCR的高靈敏性、 DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)精確定性的優(yōu)點，結(jié)果直觀，能直接監(jiān)測PCR過程中的變化。 與普通PCR相比，其結(jié)果可實時觀察，產(chǎn)物不需要凝膠電泳檢測，完全閉管操作，有效地降低了 PCR產(chǎn)物污染的風險；2)本發(fā)明提供的檢測CYP2C19基因分型的熒光PCR試劑盒，MGB探針與所針對擴增靶模板序列特異性相結(jié)合，根據(jù)模板核苷酸序列特異性定制，因此設計的探針與靶模板特異結(jié)合性好，能夠最大限度的提高檢測的準確性；3)本發(fā)明提供的檢測CYP2C19基因分型的熒光PCR試劑盒檢測速度快，操作步驟
簡單；4)本發(fā)明提供的檢測CYP2C19基因分型的熒光PCR試劑盒可同時進行較高通量的樣本檢測。熒光PCR-MGB探針技術(shù)靈敏度高，特異性好，可實時監(jiān)測反應進程，反應時間短， 而且是閉管操作，無需后續(xù)處理，可最大限度避免反應產(chǎn)物污染，可以取代傳統(tǒng)蛋白檢測或者普通PCR檢測進行CYP2C19基因的分型診斷。


圖1為CYP2C19M的陽性對照和陰性對照熒光PCR擴增基因分型圖；圖2為臨床樣本的CYP2C1腫2熒光PCR基因分型圖。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實施例1 試劑盒的制備1.引物設計與合成
使用I^rimer premier5. 0，針對CYP2C19基因的全序列，設計上下游擴增引物。引物委托專業(yè)公司合成，其中引物為PAGE純化。擴增序列如表1 表1.特異性擴增引物序列
權(quán)利要求
1.一種檢測CYP2C19基因分型的熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測基因CYP2C1腫2型的PCR反應液、檢測基因CYP2C19*3型的PCR反應液、Taq酶、尿嘧啶DNA 糖基化酶；所述的檢測CYP2C1腫2和CYP2C19*3基因的PCR反應液中均包含PCR Buffer、 dNTP、PCR擴增引物、MGB探針；其中檢測基因CYP2C19M型的PCR擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 3-4所示，所述檢測基因CYP2C19*3型的PCR擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 7-8 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測CYP2C19基因分型的熒光PCR試劑盒，其特征在于， 所述檢測基因CYP2C1腫2型的MGB探針的核苷酸序列如SEQ ID NO 1~2所示，檢測基因 CYP2C19*3型的MGB探針的核苷酸序列如SEQ ID NO :5_6所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測CYP2C19基因分型的熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括CYP2C1腫2型陽性對照品、CYP2C19*3型陽性對照品以及陰性對照品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測CYP2C19基因分型的熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述 CYP2C1腫2型陽性對照品包含CYP2C1腫2型陽性對照品1_1、CYP2C1腫2型陽性對照品1_2 和CYP2C1腫2型陽性對照品1-3 ；所述CYP2C19*3型陽性對照品包含CYP2C19*3型陽性對照品2-l、CYP2C19*3型陽性對照品2_2以及CYP2C19*3型陽性對照品2_3。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測CYP2C19基因分型的熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述的CYP2C1腫2型陽性對照品1-1為插入有如SEQ IDNO 10所示的核苷酸序列的野生純合子質(zhì)粒；CYP2C1腫2型陽性對照品1-2為插入有如SEQ ID NO 9所示的核苷酸序列的突變純合子質(zhì)粒；CYP2C1腫2型陽性對照品1-3為由所述突變純合子質(zhì)粒和所述野生純合子質(zhì)粒組成的雜合子質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測CYP2C19基因分型的熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述雜合子質(zhì)粒中，述突變純合子質(zhì)粒和所述野生純合子質(zhì)粒的比例為1 1。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測CYP2C19基因分型的熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述的CYP2C19*3型陽性對照品2-1為插入有如SEQ IDNO 12所示的核苷酸序列的野生純合子質(zhì)粒；CYP2C19*3型陽性對照品2-2為插入有如SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列的突變純合子質(zhì)粒；CYP2C19*3型陽性對照品2-3為由所述突變純合子質(zhì)粒和所述野生純合子質(zhì)粒組成的雜合子質(zhì)粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測CYP2C19基因分型的熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述雜合子質(zhì)粒中，述突變純合子質(zhì)粒和所述野生純合子質(zhì)粒的比例為1 1。8.根據(jù)權(quán)利要求4至7任一項所述的檢測CYP2C19基因分型的熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述質(zhì)粒為PMD18-T質(zhì)粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測CYP2C19基因分型的熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述的陰性參考品為β-actin質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測CYP2C19基因分型的熒光PCR試劑盒，屬于體外核酸檢測領域，包括檢測基因CYP2C19*2和CYP2C19*3型的PCR反應液、Taq酶、尿嘧啶DNA糖基化酶；檢測CYP2C19*2和CYP2C19*3基因的PCR反應液當中均包含PCR擴增引物、MGB探針等；檢測基因CYP2C19*2型和CYP2C19*3型的擴增引物的核苷酸序列分別如SEQ IDNO3-4及SEQ ID NO5-6所示。本發(fā)明提供的試劑盒靈敏度高，特異性好，可實時監(jiān)測反應進程，反應時間短，無需后續(xù)處理，可最大限度避免反應產(chǎn)物污染，可以取代傳統(tǒng)蛋白檢測或普通PCR檢測CYP2C19基因的分型診斷。
文檔編號C12Q1/68GK102534005SQ20121001118
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月14日
發(fā)明者黃雙 申請人:長沙三濟生物科技有限公司