專利名稱：一株h1n1亞型豬流感病毒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株HlNl亞型豬流感病毒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬流感(Swine influenza, SI)是由A型流感病毒引起的一種急性、傳染性豬的呼吸道疾病，其通過(guò)不斷抗原漂移或抗原轉(zhuǎn)變實(shí)現(xiàn)進(jìn)化，導(dǎo)致亞型眾多，難以根除。目前豬流感病毒已有 HlNl、H1N2、H3N2、H1N7、H2N3、H3N1、H3N3、H3N6、H4N6、H5N1、H9N2 等 11 種血清亞型，其中在豬群中廣泛流行的主要有古典豬H1N1、類禽H1N2和類人H3N2亞型。同時(shí)豬流感是一種免疫抑制性疾病，經(jīng)常導(dǎo)致豬群并發(fā)或繼發(fā)其他病毒或細(xì)菌的感染，使疫情更為復(fù)雜,死亡率增高,給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬體內(nèi)同時(shí)具有唾液酸α-2，3半乳糖(SA α-2，3_Gal)和唾液酸α-2，6半乳糖 (SAa -2，6_Gal)，所以具有同時(shí)感染禽、馬和人流感病毒的能力，被認(rèn)為是導(dǎo)致新型流感毒株產(chǎn)生的重要中間宿主，被稱為“基因混合器”，是造成流感大流行的重要潛在危險(xiǎn)因素。 2009年3月起始于美國(guó)和墨西哥的HlNl亞型流感疫情，再次證實(shí)了豬流感在獸醫(yī)和人類公共衛(wèi)生學(xué)中的重要地位。研制安全有效的豬流感疫苗是控制豬流感疫情、減少人類流感隱患和保證畜牧業(yè)健康發(fā)展的重要保障，而選取合適的豬流感病毒株則為研制安全、有效的豬流感疫苗的首要條件。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一株HlNl亞型豬流感病毒及其應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一株HlNl亞型豬流感病毒A/Swine/ Shanxi/D5/2011 (HlNl) (Swine influenza virus)，其保藏號(hào)為 CGMCC No. 5323。本發(fā)明還提供含有治療有效量的A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)的疫苗。其中， 所述的A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)優(yōu)選為滅活的病毒。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述疫苗還可含有藥學(xué)可接受的佐劑。其中，所述的佐劑可為本領(lǐng)域公知的任何適合制備疫苗的佐劑，優(yōu)選為以下任何一類佐劑中的一種或幾種I)無(wú)機(jī)佐劑如白油、鋁佐劑、Montanide ISA 206 VG (簡(jiǎn)稱206)佐齊[J、 Montanide ISA 70M VG (簡(jiǎn)稱 70M)佐劑、Montanide ISA70essai Mi (i = 1-8)[簡(jiǎn)稱 70Mi (i = 1-8)]佐劑等；2)表面活性劑佐劑如 MF59、ISCOM 、ISC0MA-TRIX 等；3)內(nèi)源性及生物源性佐劑，如蜂膠、0DN, QS21、SAF、CAMPs、HgM-CSF、IL-12、IL-2、 大腸桿菌不耐熱腸毒素、多糖類物質(zhì)等。在本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗可為油乳劑疫苗、鋁膠疫苗、蜂膠疫苗。進(jìn)一步，本發(fā)明還提供A/Swine/Shanxi/D5/2011(H1N1)在制備治療豬流感藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的HlNl亞型豬流感病毒無(wú)外源病原污染，在雞胚和細(xì)胞上均具有較高的增殖能力，攻毒BALB/c小鼠和豬流感陰性仔豬后可觀察到明顯的臨床癥狀，剖檢病變典型，而且該HlNl亞型豬流感病毒免疫原性良好，以其制備的油乳劑滅活疫苗免疫豬后對(duì)同源病毒攻擊的保護(hù)效率達(dá)100%，為一株良好的豬流感疫苗候選毒株。本發(fā)明的病毒株分尚自疑似流感病豬的肺病料，證實(shí)分尚出的病毒具有血凝活性，RT-PCR證實(shí)具有流感HA基因片段，與Hl亞型豬流感病毒單因子陽(yáng)性血清的HI試驗(yàn)為陽(yáng)性，初步鑒定為Hl亞型，且電鏡觀察具有流感病毒粒子形態(tài)特征。將該病毒株命名為流感病毒4/5 丨1^/51^1 丨/1)5/201101謂1)，并于2011年10月12日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，簡(jiǎn)稱CGMCC，保藏登記號(hào)為CGMCC No. 5323。


圖I 為 HlNl 亞型豬流感病毒 A/Swine/Shanxi/D5/2011(H1N1)電鏡照片。圖2為正常的MDCK細(xì)胞電鏡照片。圖3 為接種 HlNl 亞型豬流感病毒 A/Swine/Shanxi/D5/2011(HlNl)48h 后的 MDCK 細(xì)胞電鏡照片。圖4為正常小鼠肺臟照片。圖5為攻擊HlNl亞型豬流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011 (H1N1)6天后小鼠肺臟照片。圖6為正常豬肺臟照片。圖7為攻擊HlNl亞型豬流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl) 3天后豬肺臟照片。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I HlNl亞型豬流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011(H1N1)的分離鑒定(I)HlNl 亞型豬流感病毒 A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)的分離從山西某豬場(chǎng)采集疑似豬流感病豬的肺病料剪碎，按Ig 5ml加入含青霉素 (1000U/ml)、鏈霉素(1000 μ g/ml)的滅菌生理鹽水，組織研磨器研磨后反復(fù)凍融3次，經(jīng) 4000r/min離心IOmin,取上清液,一次性過(guò)濾器過(guò)濾后經(jīng)尿囊腔接種9 11日齡SPF雞胚, O. 2ml/胚，35°C恒溫箱孵育，棄去接種24h內(nèi)死亡的雞胚，接種72h后收獲存活雞胚的尿囊液。(2)血凝活性檢測(cè)按照常規(guī)方法對(duì)收獲的雞胚尿囊液進(jìn)行血凝活性檢測(cè)，取96孔血凝板，第一排加入待檢病毒原液100 μ I，后面每孔加入50 μ I I X PBS,吸取50 μ I病毒原液2倍倍比稀釋至11孔，最后一孔留作對(duì)照，加入I %雞紅細(xì)胞懸液，混勾后直室溫感作30min，結(jié)果證實(shí)所分尚的病毒具有血凝活性。(3) RT-PCR 鑒定提取該病毒RNA，以流感病毒的隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用豬流感病毒的HA基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可得到符合預(yù)期大小的片段，經(jīng)測(cè)序證實(shí)為流感HA基因片段。(4)外源病毒檢測(cè)提取病毒的RNA和基因組DNA，RNA應(yīng)用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以病毒的cDNA 和基因組DNA為模板，通過(guò)PCR或RT-PCR方法進(jìn)行禽源和豬源外源病毒的檢測(cè)，所檢禽源病毒包括H5亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒 (IBV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、J亞型白血病病毒(內(nèi)源ALV-J)、J亞型白血病病毒 (外源ALV-J)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增值病病毒(REV)、禽腦脊髓炎病毒(AEV)、禽呼腸孤病毒(REO)、 傳染性喉氣管炎病毒(ILT)、馬立克病毒(MDV)、禽腺病毒(AAV)、禽痘病毒(FPV);所檢豬源病毒包括豬瘟病毒(CSFV)、藍(lán)耳病毒(PRRS)、偽狂犬病毒(PRV)、豬支原體(Mhp)。檢測(cè)所用引物均參考相關(guān)文獻(xiàn)合成。結(jié)果表明所分病毒無(wú)禽源和豬源外源病毒污染。(5)血凝抑制實(shí)驗(yàn)分別應(yīng)用抗新城疫病毒(NDV)和減蛋綜合癥(EDS276)的陽(yáng)性血清對(duì)所分離的病毒進(jìn)行常規(guī)微量法HI試驗(yàn)，結(jié)果病毒與抗NDV和EDS276陽(yáng)性血清的HI均為陰性，然后以抗Hl亞型豬流感病毒單因子陽(yáng)性血清、抗H3亞型豬流感病毒單因子陽(yáng)性血清、抗H5亞型豬流感病毒單因子陽(yáng)性血清、抗H7亞型豬流感病毒單因子陽(yáng)性血清、抗H9亞型豬流感病毒單因子陽(yáng)性血清對(duì)所分離的病毒進(jìn)行微量平板法凝集抑制試驗(yàn)。結(jié)果所分病毒與抗H3、H5、 H7、H9亞型豬流感病毒單因子陽(yáng)性血清的HI試驗(yàn)均為陰性，但與Hl亞型豬流感病毒單因子陽(yáng)性血清的HI試驗(yàn)為陽(yáng)性。(6)亞型鑒定經(jīng)HI試驗(yàn)初步確定所分病毒為Hl亞型，再通過(guò)RT-PCR方法以豬流感型特異性 PCR鑒定引物進(jìn)一步鑒定所分病毒為HlNl亞型。HlNl亞型特異性PCR鑒定引物均參考相關(guān)文獻(xiàn)合成，引物序列如下Hl-F AGCAAAAGCAGGGGAAAATAA ；Hl-R TGCATTCTGGTAGAGACTTTG ；Nl-F TTGCTTGGTCRGCAAGTGC ；Nl-R YCWGTCCAYCCATTWGGATCC (7)電鏡觀察將收獲病毒的雞胚尿囊液超速離心，沉淀用滅菌TNE重懸，重懸病毒液經(jīng)過(guò)磷鎢酸負(fù)染后進(jìn)行電鏡觀察。結(jié)果如圖I所示，電鏡下SIV病毒粒子呈圓形、橢圓形，少數(shù)呈不規(guī)則的形狀，可見(jiàn)病毒囊膜和纖突，直徑約為60 120nm，具有流感病毒粒子形態(tài)特征。經(jīng)鑒定，分離到的病毒株為HlNl亞型豬流感病毒的新病毒株，命名為A/Swine/ Shanxi/D5/2011(H1N1)，并于2011年10月12日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為CGMCC No. 5323。實(shí)施例2 HlNl亞型豬流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/201 UHlNl全基因組序列測(cè)定及進(jìn)化村繪制(1)8個(gè)基因片段的RT-PCR擴(kuò)增參考已發(fā)表的HlNl亞型豬流感的相關(guān)資料，設(shè)計(jì)合成流感病毒8個(gè)基因HA、NA、 NP、PB1、PB2、PA、M、NS的RT-PCR引物，引物序列參見(jiàn)表I。提取病毒的RNA并應(yīng)用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增8個(gè)基因片段，其中PB2、PB1、PA3個(gè)長(zhǎng)片段采用分段擴(kuò)增，得到分段擴(kuò)增的兩端產(chǎn)物后再采用重疊PCR法擴(kuò)增全長(zhǎng)。其余5個(gè)片段HA、NA、NP、 M和NS—次性擴(kuò)增全長(zhǎng)。表I豬流感病毒8個(gè)基因片段的引物序列
引物名稱引物序列PCR擴(kuò)增的目的基因片段HA-FTATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGGHAHA-RATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTNA-FTATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGTNANA-RATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTTNP-F NP-1565RTATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTA ATATCGTCTGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTTNPPB2 -IF PB2 -1205RTAGGAGCGAAAGCAGGTC TCYTCYTGTGARAAYACCATPB2- IPB2-1105F PB2 -2341RTAYGARGARTTCACAATGGT GGAGTAGAAACAAGGTCGTTTPB2-IIPBl-IF PBl -1262RATTTAGCGAAAGCAGGCA TTRAACATGCCCATCATCATPBl- IPBl -1142F PBl -2341RARATACCNGCAGARATGCT TGGAGTAGAAACAAGGCATTTPBl-IIPA-IF PA-1498RGGGAGCGAAAGCAGGTAC TNGTYCTRCAYTTGCTTATCATPA- IPA-747F PA-2233RCATTGAGGGCAAGCTTTC CCGGAGTAGAAACAAGGTACTTPA- IINS-IFTATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTGNSNS-890RATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTM-IFTATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAGMM-1027RATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT(2) PCR產(chǎn)物的回收純化RT-PCR產(chǎn)物用I %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,按Gel Extraction kit的說(shuō)明書(shū)回收和核酸純化。(3)基因的克隆和PCR鑒定純化后的HA、NA、NP、PBl、PB2、PA、NS、M 基因的 RT-PCR 產(chǎn)物與 PMD-18T 載體連接并轉(zhuǎn)化T0P-10感受態(tài)細(xì)胞。藍(lán)白斑篩選，挑取培養(yǎng)基上的白色菌落，37°c搖床中培養(yǎng)過(guò)夜， 應(yīng)用載體克隆位點(diǎn)兩端的T7和pol I序列作為引物，對(duì)菌液進(jìn)行PCR鑒定。(4)全基因組序列的測(cè)定及進(jìn)化樹(shù)分析每個(gè)片段取三個(gè)經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆菌進(jìn)行測(cè)序，得HA、NA、NP、PBU PB2、 PA,NS,M基因的序列分別依次如SEQ No. I 8所示。應(yīng)用DNAstar中的MegAlign軟件進(jìn)行核酸同源性比較和進(jìn)化樹(shù)的繪制，證實(shí)NP基因與A/Ann Arbor/6/1960 (H2N2)核苷酸同源性為99. 8%，其余7個(gè)基因均與A/Puerto Rico/8/1934(HlNl)高度同源HA全基因序列99. 8%同源、NA全基因序列99. 6%同源、PBl全基因序列99. 7%同源、PB2全基因序列 99. 6%同源、PA全基因序列99. 7%同源、NS全基因序列99. 7%同源、M全基因序列99. 8% 同源。實(shí)施例3 HlNl亞型豬流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)的生物學(xué)特性測(cè)I. HlNl亞型豬流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)在雞胚上連續(xù)傳代及 EID50的測(cè)定(I)雞胚上連續(xù)傳代將Fl 代 HlNl 亞型豬流感病毒 A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)以 IXPBS 進(jìn)行 1(Γ3稀釋，接種9 11日齡的SPF雞胚，O. 2ml/胚，于孵化器中35°C條件下孵育72h，收取雞胚尿囊液進(jìn)行血凝檢測(cè)。按此方法，病毒在雞胚上連傳12代，血凝價(jià)穩(wěn)定，可達(dá)29，每代收取的尿囊液均保存于_80°C備用。⑵EID5tl的測(cè)定將F13 代 HlNl 亞型豬流感病毒 A/Swine/Shanxi/D5/2011(H1N1)以 IXPBS 進(jìn)行 10倍倍比稀釋，將10_5 10,各稀釋度分別接種9 11日齡的SPF雞胚，每個(gè)稀釋度4 枚，O. Iml/胚，于孵化器中35°C條件下孵育48h后，收取雞胚尿囊液進(jìn)行血凝檢測(cè)。按照 Reed-Muench 方法計(jì)算 HlNl 亞型豬流感病毒 A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)的 EID5tl 為 1(T8.45EID50Ail。2. HlNl亞型豬流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)在MDCK細(xì)胞中增殖試驗(yàn)及TCID5tl的測(cè)定(I)在MDCK細(xì)胞中增殖試驗(yàn)500 μ I F13 代 HlNl 亞型豬流感病毒 A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)用 Hank，s 緩沖液稀釋至5ml，接種于長(zhǎng)滿MDCK細(xì)胞的75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于CO2培養(yǎng)箱中，37°C條件下吸附作用I. 5h后，棄去培養(yǎng)瓶中的病毒液，用Hank’s緩沖液洗I次，加入IOml不含血清的DMEM培養(yǎng)基(其中TPCK-trypsin的終濃度為5 μ g/ml)，另設(shè)未接病毒的MDCK對(duì)照。 接毒24h后每間隔6h收細(xì)胞培養(yǎng)上清O. 2ml，5000g，離心2min，_20°C冰箱中保存。待接毒后72h將凍存的上清樣品融化，以血凝試驗(yàn)檢測(cè)各時(shí)間段細(xì)胞培養(yǎng)上清的血凝價(jià)。結(jié)果在接毒48h后可見(jiàn)MDCK細(xì)胞皺縮聚集成團(tuán)塊狀，并出現(xiàn)大量崩解(圖2、圖3)，接毒MDCK細(xì)胞60h時(shí)血凝價(jià)最高可達(dá)到27。(2)組織半數(shù)感染量測(cè)定(TCID5tl)血凝價(jià)為29 的 F13 代 HlNl 亞型豬流感病毒 A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)用 Hank’ s緩沖液進(jìn)行10倍倍比稀釋，將KT1 10,各稀釋度分別接種于長(zhǎng)滿MDCK細(xì)胞的 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度接種8孔，100 μ I/孔，接毒后觀察細(xì)胞病變，接毒后72h測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液的血凝活性，根據(jù)Reed-Muench方法計(jì)算病毒的TCID5tl為105_78TCID5(l/ml。實(shí)施例4 HlNl亞型豬流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)的動(dòng)物試驗(yàn)(I)HlNl亞型豬流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)對(duì)小鼠的致病性試驗(yàn)F13 代 HlNl 亞型豬流感病毒 A/Swine/Shanxi/D5/2011(H1N1)以 IXPBS 稀釋至 106EID50/ml,24只6 8周齡的雌性BALB/c小鼠，隨機(jī)分組，用于監(jiān)測(cè)病毒對(duì)小鼠體重變化的影響和病毒在小鼠臟器中的分布情況，其中16只經(jīng)鼻腔途徑分別接種100μ I已稀釋好的病毒，8只接種生理鹽水作為對(duì)照。每日觀察小鼠的精神狀態(tài)，稱量小鼠的體重；同時(shí)每隔Id剖殺兩只攻毒組的小鼠及一只對(duì)照組的小鼠，觀察病變，采集小鼠的心、肝、脾、肺、 腎、腦、腸、血。對(duì)所采病料進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果接種病毒一天后，攻毒組小鼠即開(kāi)始食欲不振，精神萎靡，毛松亂，聚堆，呼吸急促甚至困難，有時(shí)可聽(tīng)到咳嗽聲，體重減輕；而對(duì)照組小鼠精神正常，體重一直持續(xù)增長(zhǎng)。剖檢攻毒組小鼠肺部病變較明顯，其它臟器沒(méi)有明顯病變，RT-PCR檢測(cè)(采用NS基因的通用引物，NS-F AGAAACAAGGGTGTTTTTTA, NS-R AGCAAAAGCAGGGTGACAAA)，可在心、肺、腎檢測(cè)到HlNl亞型豬流感病毒A/Swine/Shanxi/ D5/2011 (HlNl);對(duì)照組小鼠剖檢未見(jiàn)異常，RT-PCR未檢測(cè)到病毒(圖4、圖5)。(2) HlNl亞型豬流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)對(duì)豬的致病性試驗(yàn)選用5 6周齡的豬流感陰性仔豬12頭，隨機(jī)分組，攻毒組一 4只，攻毒劑量為 IO8 ciEID5tl/頭，采用氣管內(nèi)接種和鼻腔內(nèi)接種兩種途徑攻毒，氣管內(nèi)接種IOml病毒，鼻內(nèi)接種2ml病毒；攻毒組二 4只，攻毒劑量為IOiqEID5q/頭，氣管內(nèi)接種IOml病毒，鼻內(nèi)接種2ml 病毒；對(duì)照組4只，氣管內(nèi)接種IOml空白尿囊液,鼻內(nèi)接種2ml空白尿囊液；觀察臨床癥狀，分別在1、3、5、7天剖殺攻毒組一、攻毒組二和對(duì)照組豬各一頭，結(jié)果，攻毒后I天攻毒組一和攻毒組二的豬扎堆、被毛凌亂、精神沉郁、食欲不振、呼吸急促、體溫升高可達(dá)40. 5°C， 剖檢可見(jiàn)感染豬的肺部均有程度不一的病理變化，病變區(qū)域?yàn)樯钭仙?，呈斑塊狀或點(diǎn)狀；攻毒后3天，攻毒組一和攻毒組二的豬均精神沉郁，食欲不振，鼻腔眼睛出現(xiàn)分泌物，呼吸困難，現(xiàn)咳嗽和氣喘，運(yùn)動(dòng)時(shí)咳嗽和氣喘加重。攻毒組二豬可見(jiàn)腹式呼吸，根據(jù)Halbu PG等 (1995)報(bào)道的肺病變打分標(biāo)準(zhǔn)采用直尺測(cè)量每個(gè)肺表面積和病變部位的總表面積，以病變部位的總表面積占肺表面積的百分比進(jìn)行打分，所有豬肺部病變都在5分以上，同時(shí)可見(jiàn)肺門淋巴結(jié)腫大(圖6、圖7)。攻毒后5天，攻毒組的臨床癥狀逐漸緩解，至第七天基本消失，個(gè)別豬在第5天和第7天剖檢可見(jiàn)肺部輕微病變。采集的攻毒組豬所有鼻拭子和肺臟組織中均分離到HlNl亞型豬流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)。實(shí)施例5 HlNl亞型豬流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)疫苗的免疫原性和效力檢查F13 代 HlNl 亞型豬流感病毒 A/Swine/Shanxi/D5/2011(H1N1) (EID5tl 為 KT8 45EID5ci/ ml，HA為29)的病毒尿囊液經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)合格后進(jìn)行病毒濃縮，濃縮后的病毒加入O. 1%甲醛，37°C滅活20小時(shí)，期間陣搖數(shù)次，經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)合格后加入4%吐溫-80充分混勻作為水相；另外取注射用白油93份，司盤-805份，混合后，加硬脂酸鋁2份，隨加隨攪拌至透明為止，121°C高壓滅菌20分鐘，作為油相；以水相與油相體積比為I : 2進(jìn)行乳化制備HlNl 亞型豬流感病毒A/SWine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)株的油乳劑滅活疫苗。選用4周齡的豬流感陰性仔豬34頭，隨機(jī)分組，第一組8頭，注射疫苗，4頭用于監(jiān)測(cè)疫苗的安全性，4頭用于監(jiān)測(cè)HI抗體水平。第二組8頭注射疫苗，作為免疫攻毒組；第三組8頭注射PBS，作為非免疫攻毒對(duì)照；第四組4頭，注射PBS，作為非免疫非攻毒的完全對(duì)照。首免后4周進(jìn)行二免，疫苗接種均采用頸部肌肉接種，接種劑量均為2ml/頭。在二免后兩周，對(duì)第二組和第三組豬進(jìn)行HlNl亞型豬流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl) 攻毒，攻毒劑量為IO8 tlEID5t/頭。實(shí)驗(yàn)分組具體見(jiàn)表2。表2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組情況
權(quán)利要求
1.一株 HlNl 亞型豬流感病毒 A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl) (Swine influenza virus)，其保藏號(hào)為 CGMCC No. 5323。
2.含有治療有效量的權(quán)利要求I所述病毒的疫苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述病毒為滅活病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的疫苗，其特征在于，還含有藥學(xué)可接受的佐劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的疫苗，其特征在于，其為油乳劑疫苗、鋁膠疫苗或蜂膠疫苗。
6.權(quán)利要求I所述的病毒在制備治療豬流感藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株H1N1亞型豬流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011(H1N1)，其保藏號(hào)為CGMCC No.5323。本發(fā)明還提供含有所述病毒的疫苗。本發(fā)明的H1N1亞型豬流感病毒無(wú)外源病原污染，在雞胚和細(xì)胞上均具有較高的增殖能力，攻毒BALB/c小鼠和豬流感陰性仔豬后可觀察到明顯的臨床癥狀，剖檢病變典型，而且該H1N1亞型豬流感病毒免疫原性良好，由其制備的油乳劑滅活疫苗免疫豬后對(duì)同源病毒攻擊的保護(hù)效率達(dá)100％，為一株良好的豬流感疫苗候選毒株。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102586196SQ201210011848
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者呂超超, 孟珊珊, 杜金玲, 王丹娜, 王吉瑋, 石磊, 趙亞榮 申請(qǐng)人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司