專利名稱：使用核酸擴增法檢測人乳頭瘤病毒的方法和核酸鏈固定化載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測人乳頭瘤病毒和鑒定其基因型的核酸引物序列、試劑盒、和核酸鏈固定化載體，并涉及通過使用核酸擴增法檢測人乳頭瘤病毒的方法。
背景技術(shù)：
在1980年代，據(jù)報道人乳頭瘤病毒(HPV)感染是引起子宮頸癌的原因，并且特別引人注意的是癌惡性度和HPV基因型之間的關(guān)系。也認(rèn)為HPV是引起非子宮頸癌的其它癌的原因，其中所述其它癌如生殖器癌和口腔粘膜癌，因此需要快速且正確地檢測HPV的方法。至今為止，已知通過使用DNA/RNA識別抗體檢測惡性或良性基因型的方法、以及通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增包含對于基因型而言特征性序列的區(qū)域并最后通過使用基因型特異的探針鑒定基因型的方法。但是不能鑒定基因型的前一方法不能應(yīng)用至當(dāng)前開發(fā)的用于疫苗施用的檢測。另外，使用PCR法的后一方法也有缺點，如核酸提取等預(yù)處理的繁鎖操作、需要復(fù)雜的溫度調(diào)節(jié)設(shè)備如熱循環(huán)儀、和較長的兩小時或更長的反應(yīng)期間。此外，PCR法有這樣一種可能性，如果偶然合成了不正確的互補鏈，該產(chǎn)物可用作擴增中的模板，結(jié)果導(dǎo)致不正確的判斷。實際上，難于控制在引物末端僅有一個核苷酸差異的特異性擴增。對于通過使用DNA芯片的檢測，通過PCR法擴增的基因產(chǎn)物通常為雙鏈。因此，出現(xiàn)了互補鏈成為探針的競爭物的問題，降低了在雜交反應(yīng)中使用探針的雜交效率和檢測靈敏性。因此，例如，采用了分解或分離互補鏈的方法，使得靶基因產(chǎn)物成為單鏈。但是，這些方法仍有問題，如由于使用酶和磁珠產(chǎn)生的較高的成本和復(fù)雜的操作，需要替代這些常規(guī)方法的新方法。發(fā)明公開本發(fā)明的一個目的是當(dāng)應(yīng)用允許簡便且快速地檢測核酸的LAMP法的原理時，提供用于檢測存在于LAMP擴增產(chǎn)物中的HPV核苷酸序列的核酸引物，以及使用所述核酸引物的HPV檢測方法。本發(fā)明應(yīng)用了不同于PCR法的方法即LAMP法來鑒定HPV基因型。因此，可能易于鑒定基因型。但是，LAMP產(chǎn)物具有復(fù)雜的高級結(jié)構(gòu)，在雜交中使用結(jié)合有探針的支持物引起物理阻礙，這接下來導(dǎo)致降低雜交效率(參見如JP-A 2005-095043 (KOKAI))。因此，在本發(fā)明中，如此設(shè)計引物，使得衍生自人乳頭瘤病毒的靶序列位于LAMP產(chǎn)物的單鏈環(huán)區(qū)，這與現(xiàn)有技術(shù)不同。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了用于檢測人乳頭瘤病毒和鑒定其基因型的LAMP 擴增用核酸引物，所述核酸引物選自以下的(a)-(f) :(a)核酸引物，其在同一鏈上含有選自表1中所示第一序列組的序列的互補序列和選自表2中所示第二序列組的序列；(b)核酸引物，其在同一鏈上含有選自第一序列組的序列的互補序列和選自表3中所示第三序列組的序列；(c)核酸引物，其在同一鏈上含有選自第二序列組的序列的互補序列和選自第三序列組的序列；(d)核酸引物，其含有通過插入、缺失、或替代一個或多個堿基而不同于核酸引物(a)、(b)和(c)之一的所選序列的序列，并且能夠與具有核酸引物(a)、(b)和(c) 之一的所選序列的互補序列的核酸鏈雜交；(e)核酸引物，其含有選自表4中所示第四序列組的序列或其互補序列；和(f)核酸引物，其含有通過插入、缺失、或替代一個或多個堿基而不同于核酸引物(e)之一的所選序列的序列，并且能夠與具有核酸引物(e)之一的所選序列的互補序列的核酸鏈雜交。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了檢測人乳頭瘤病毒并鑒定其基因型的方法，包括在LAMP反應(yīng)中通過使用多條引物擴增樣本中的核酸鏈的步驟和在擴增反應(yīng)后檢測擴增產(chǎn)物的存在并鑒定它們的基因型的步驟，其中所述多條引物包括選自上述核酸引物中的至少一條引物。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了核酸鏈固定化支持物，其攜帶有固定的用于檢測人乳頭瘤病毒LAMP擴增產(chǎn)物的人乳頭瘤病毒特異的或基因型特異的核酸鏈。優(yōu)選地，固定的核酸鏈?zhǔn)?g)核酸探針，其含有選自表5中所示第五序列組的序列或其互補序列，或(h) 核酸探針，其含有通過插入、缺失、或替代一個或多個堿基而不同于核酸引物(g)之一的所選序列的序列，并且能夠與具有核酸引物(g)之一的所選序列的互補序列的核酸鏈雜交。附圖簡述

圖1是顯示常規(guī)LAMP法中的擴增方法的示意圖；圖2是顯示通過常規(guī)LAMP法獲得的擴增產(chǎn)物的示意圖；圖3是顯示制備本發(fā)明的測定用核酸中的擴增方法的示意圖；圖4是顯示本發(fā)明的測定用核酸的示意圖；圖5是闡述用于鑒定HPV基因型的DNA芯片的一個例子的圖示；圖6是闡述用于鑒定HPV基因型的DNA芯片的另一個例子的圖示；圖7是顯示LAMP擴增后的電泳照片的一個例子的圖；圖8是顯示LAMP擴增后的電泳照片的另一個例子的圖；圖9包括顯示通過電流檢測型DNA芯片檢測的結(jié)果的例子的圖示；圖10包括顯示LAMP擴增后的電泳照片的例子的圖示；以及圖11是顯示HPV序列和可用作本發(fā)明的引物或探針的區(qū)域的圖。實施發(fā)明的最佳模式本發(fā)明中所用的擴增法“LAMP法”是一種等溫聚合酶鏈反應(yīng)，使用4種或6種引物。據(jù)報道LAMP法在擴增效率上高于PCR法并且也抗樣本中的雜質(zhì)的影響。因此可以通過簡單預(yù)處理樣本而容易地檢測小量的人乳頭瘤病毒。在LAMP法中的引物設(shè)計和獲得的擴增產(chǎn)物參照圖1和圖2描述。圖1顯示了待檢測的雙鏈DNA。通常地，靶序列位于LAMP擴增產(chǎn)物的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的中央(圖2)。在擴增和檢測靶序列時，從位于靶序列兩側(cè)的序列確定總共四種引物序列(FIP、F3、ΒΙΡ4Π B3引物)。 每一 FIP和BIP引物含有兩個區(qū)域(FIP = Flc+F2，BIP = B2+Blc)。用于這些引物中的總共6個區(qū)域下文中稱為引物區(qū)。通過使用這四種引物的LAMP擴增產(chǎn)生圖2中所示的具有亞鈴型莖環(huán)結(jié)構(gòu)的擴增產(chǎn)物，每一擴增產(chǎn)物互補于圖1所示的DNA的每一鏈。在此不對擴增機制進行描述，但可參考例如JP-A2002-186781 (KOKAI)。另一方面，在本發(fā)明中，如此設(shè)計引物，使得靶序列位于單鏈環(huán)區(qū)中，而不是像圖2 中所示的常規(guī)的靶序列位點。具體地，如圖3中所示，在本發(fā)明中，如此放置6個引物區(qū)，使得靶序列(圖3中的任一？ (、？ 、8 、和8 (3)位于引物區(qū)Fl和F2之間(包括F2區(qū))，位于引物區(qū)F2c和Flc之間(包括F2c區(qū))，位于引物區(qū)Bl和B2之間(包括B2區(qū))，和/或位于引物區(qū)B2c和Blc之間(包括B2c區(qū))。靶序列可位于上述區(qū)域之間形成的任一單鏈環(huán)區(qū)，并且因此在引物區(qū)Fl和F2之間的環(huán)區(qū)包括F2區(qū)?；谟纱舜_定的6個引物區(qū)制備四種引物，并通過使用這些引物進行LAMP擴增而獲得圖4所示的LAMP擴增產(chǎn)物的一部分。 在LAMP擴增產(chǎn)物中，靶序列FPc、FP、BP、和BPc位于擴增產(chǎn)物的亞鈴結(jié)構(gòu)中的單鏈環(huán)中。另一方面，引物區(qū)Flc和Fl以及引物區(qū)Blc和Bl本來就具有互補序列，并因此通過相互地自身雜交形成雙鏈。在擴增產(chǎn)物中含有的一些靶序列如圖4所示為單鏈狀態(tài)。因此，可以無需變性操作而如圖中所示，通過與分別的靶序列互補的探針核酸(FP、FPc、BPJPBPc)的特異性雜交而檢測靶序列。術(shù)語“特異性雜交”是指可以檢測由于單核苷酸多態(tài)性(SNP)或如果存在突變所引起的輕微的差異。本發(fā)明通過將此種引物結(jié)構(gòu)應(yīng)用至HPV病毒而檢測HPV病毒的基因型。圖11所示的序列是HPV病毒序列。已知在該圖中含有SEQ ID No 1、2和3的區(qū)域在許多HPV病毒中是保守的。另外，SEQ ID No. 4顯示了其中已知在惡性和良性腫瘤之間存在多態(tài)性的區(qū)域。為了檢測HPV病毒的基因型，例如通過使用對應(yīng)于SEQ ID No. 4的區(qū)域的序列作為靶序列而檢測多態(tài)性。在此種情況下，使用例如選自第一序列組(表1)和第二序列組(表2)的序列，或者使用例如選自第一序列組和第三序列組(表3)的序列作為對應(yīng)于引物區(qū)Fl和F2的序列。第一序列組、第二序列組和第三序列組為下表1至3中所示的序列組，并分別對應(yīng)于圖11中SEQ ID No. 1、2和3的區(qū)域。在這些區(qū)域中的序列根據(jù)其病毒類型不同而不同，并且不總是與圖11中所示序列相同。此外，在實際的LAMP擴增中還需要由BIP和B3引物組成的引物組。也可使用圖11中的SEQ ID No. 5和6的序列或其互補序列。本發(fā)明的引物優(yōu)選地使用這樣的引物，其在從5'至3'方向的同一鏈上，具有相互連接的選自第一序列組的序列的互補序列和選自第二序列組的序列，具有相互連接的選自第二序列組的序列和選自第一序列組的序列的互補序列，具有相互連接的選自第一序列組的序列的互補序列和選自第三序列組的序列，具有相互連接的選自第三序列組的序列和選自第一序列組的序列的互補序列，具有相互連接的選自第二序列組的序列的互補序列和選自第三序列組的序列，具有相互連接的選自第三序列組的序列和選自第二序列組的序列的互補序列，具有選自第四序列組的序列(表4)，或者具有選自第四序列組的序列的互補序列。互補序列包括嚴(yán)格互補的序列和在嚴(yán)格條件下能夠雜交至上述序列組的序列。通常地在此種條件下，90至95%的序列同源性似乎足以進行雜交反應(yīng)。此種嚴(yán)格條件對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯然的，并且為例如，20°C至65°C的溫度，2XSSC緩沖液，和0. 1% w/vSDS0尤其有利的是溫度至少65°C，0.1 X SSC緩沖液，和0.1% w/v SDS的高嚴(yán)格條件。另外，序列可以是在SEQ ID No. 1、2和3或其互補鏈的至少一條鏈中具有一個或多個核苷酸(如1至 5個核苷酸)被替換、缺失或插入的序列。但是，這些替換、缺失或插入的序列為可以分別與未替換、未缺失或未插入的序列的互補鏈在嚴(yán)格條件下雜交的序列。此外，SEQ ID No. 1,2 和3及其互補鏈的至少之一可以是1至5個核苷酸的混合核苷酸序列，或者SEQ ID No. 1，酸序列。所使用的通用核苷酸的例子包括可自Gren Research公司獲得的脫氧肌苷(dl)、3_硝基吡咯、5_硝基吲哚、 脫氧核糖呋喃糖基(dP)、脫氧-5' -二甲氧基三苯甲基-D-核糖呋喃糖基(dK)。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是在本發(fā)明的引物中，這些引物區(qū)可相互直接連接或通過間隔區(qū)連接。引物的各序列間或末端側(cè)可存在約1至100個核苷酸，優(yōu)選地2至30個核苷酸的序列 (間隔區(qū))。核酸引物的長度為約15至200個核苷酸，優(yōu)選地20至100個核苷酸，且更優(yōu)選地40至60個核苷酸。在用于檢測本發(fā)明的HPV病毒基因型的引物中，可以僅通過使用序列組1至3中序列的組合或序列組4中的序列作為對應(yīng)于引物區(qū)Fl和F2、或者Bl和B2的序列來擴增多態(tài)性區(qū)域。因此可以使用探針檢測在LAMP擴增產(chǎn)物中含有的SEQ ID No. 4中存在的多態(tài)性。因此，位于用LAMP引物擴增的產(chǎn)物的亞鈴結(jié)構(gòu)的單鏈環(huán)中的靶序列FPc、FP、BP、或 BPc對應(yīng)于SEQ ID No. 4的序列。用具有引物區(qū)Fl和F2的結(jié)構(gòu)的上述引物通過LAMP法擴增含有HPV的樣本，如圖 4中所示，可以獲得在具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的擴增產(chǎn)物的單鏈環(huán)結(jié)構(gòu)中含有的衍生自HPV的靶序列(即對應(yīng)于SEQ ID No. 4的區(qū)域中的序列)。擴增反應(yīng)可以通過每一試管一引物組實施，或者通過每一試管用于多個基因型的多引物組實施。使用后一方法更有效地用于同時鑒定多個基因型。使用例如具有互補于SEQ ID No. 4的序列的探針核酸(FP，F(xiàn)Pc, BPjP BPc)檢測擴增產(chǎn)物。通過使用被如熒光色素(熒光素，羅丹明，F(xiàn)ITC，F(xiàn)AM, ΤΕΤ, JOE, VIC, MAX, ROX， HEX, TAMRA, Cy3，Cy5，德克薩斯紅等)，淬滅劑(TAMRA，掩蔽劑(Eclipse)，Dabcyl，膠體金等)，電子自旋材料和金屬復(fù)合體(釕，鈷，鐵等)標(biāo)記的核酸探針實施均相雜交。經(jīng)常使用例如分子信標(biāo)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)和電子自旋共振(ESR)技術(shù)用于使用標(biāo)記探針的均相雜交。侵入物(invader)和焦磷酸測序(pyrosequenching)技術(shù)也用于無標(biāo)記的均相雜交。不特別地限定用于LAMP產(chǎn)物的均相雜交測定法。探針核酸可固定在固體支持物的表面用于多相雜交，并且一般使用DNA芯片，但是可使用在另一微陣列上的探針。如上所述，SEQ ID No. 4的區(qū)域為多態(tài)性區(qū)域，并且因此可以根據(jù)欲檢測的多態(tài)性來改變用于檢測擴增產(chǎn)物的探針核酸。用于本發(fā)明的核酸探針序列優(yōu)選地是具有這樣的序列的核酸探針，所述序列含有選自第五序列組(表幻的序列或選自第五序列組的序列的互補序列，或者選自第五序列組的序列或其互補序列的且其中一個或多個核苷酸被替換、缺失或插入的序列。也可使用 Kleter 等人，J. Clin. Microbiol.，37，2508-17 (1999) ；Vernon 等人，BMC Infectious Diseases, 3 =12(2003) JP-A 09-509062 (KOKAI)等中所述的序列。也不特別地限定核酸探針的結(jié)構(gòu)，也可以使用DNA、RNA、PNA、LNA、磷酸甲酯骨架核酸和其它合成的核酸鏈。此外， 也可使用其嵌合核酸。也可導(dǎo)入官能團如氨基、巰基或生物素，用于將核酸探針固定在固體支持物上，也可額外地在官能團和核苷酸之間導(dǎo)入間隔區(qū)。不特別地限制文中使用的間隔區(qū)的類型，并且例如可以使用鏈烷或乙二醇骨架。用于本發(fā)明的通用核苷酸包括可獲自 Gren Research公司的脫氧肌苷(dl)、3_硝基吡咯、5_硝基吲哚、脫氧核糖呋喃糖基(dP)、 和脫氧-5' -二甲氧基三苯甲基-D-核糖呋喃糖基(dK)等。不特別限制用于本發(fā)明的檢測方法，其例子包括使用濁度、可見光、熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、化學(xué)熒光、熒光能量轉(zhuǎn)移、ESR等的光學(xué)方法，以及使用電特性如電流、電壓、頻率、傳導(dǎo)性或電阻的電學(xué)方法。不特別限定本發(fā)明使用的用于固定核酸探針的支持物，并且其例子包括粒子(如樹脂珠、磁珠、金屬微粒子和膠體金)、板(如微量滴定板、玻璃板、硅板、樹脂板、電極板和膜)等。不特別限制本發(fā)明使用的用于支持物的原材料，并且其例子包括能透過的材料如多孔材料和膜，以及不能透過的材料如玻璃和樹脂。支持物材料的典型例子包括無機絕緣材料如玻璃、石英玻璃、氧化鋁、藍(lán)寶石、鎂橄欖石、碳化硅、氧化硅和四氮化三硅，以及有機材料如聚乙烯、乙烯、聚丙烯、聚異丁烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚對苯二甲酸乙二酯、不飽和的聚脂、含氟樹脂、聚氯乙烯、多氯化乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇縮醛、丙烯酸類樹脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、縮醛樹脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚樹脂、脲樹脂、環(huán)氧樹脂、蜜胺樹脂、苯乙烯-丙烯腈共聚物、丙烯腈丁二烯苯乙烯共聚物、有機硅樹脂、聚苯醚、聚砜、聚乙二醇、瓊脂、丙烯酰胺、硝酸纖維素、尼龍和膠乳。其上固定有核酸鏈的支持物表面可例如使用電極材料制成。不特別限制電極材料，但是其例子包括純金屬如金、金的合金、銀、鉬、汞、鎳、鈀、硅、鍺、鎵和鎢，及其合金；碳材料如石墨和玻璃化炭黑；以及它們的氧化物和化合物。其它例子包括半導(dǎo)體化合物如氧化硅，和多種半導(dǎo)體設(shè)備如(XD、FET和CMOS。可通過鋪板、印刷、噴鍍、蒸汽淀積等制備電極。在蒸汽淀積時，通過電阻加熱法、高頻加熱法、或電子束加熱法可形成電極膜。在噴鍍時，通過DC兩極噴鍍、偏置噴鍍、非對稱AC噴鍍、吸氣噴鍍或高頻噴鍍可形成電極膜。也可使用電解聚合膜如聚吡咯或聚苯胺或者使用導(dǎo)電性聚合物。不特別限定用于絕緣除電極以外的部分的材料，但優(yōu)選地為光敏聚合物或光敏抗蝕劑(photoresist)材料。使用的抗蝕材料包括光輻射用光敏抗蝕劑、遠(yuǎn)紫外線用光敏抗蝕劑、X射線輻射用光敏抗蝕劑和電子束輻射用光敏抗蝕劑。光輻射用光敏抗蝕劑的例子包括含有環(huán)化橡膠、聚肉桂酸或酚醛清漆樹脂作為主要原材料的光敏抗蝕劑。將環(huán)化橡膠、酚樹脂、聚甲基異丙烯基酮(PMIPK)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等用作遠(yuǎn)紫外用光敏抗蝕劑。任一 COP、金屬丙烯酸鹽、以及在薄膜手冊(Thin Film Handbook，Ohmsha出版)中所述的物質(zhì)可用作X射線用抗蝕劑。進一步地， 在上述文獻中記載的物質(zhì)如PMMA可用作電子束用抗蝕劑。希望所使用的抗蝕劑(resist) 具有100λ或更大和Imm或更小的厚度。通過使用光敏抗蝕劑包覆電極并進行平版印刷可使面積一定。從而可使在電極間固定的DNA探針的量均一，并使得可實施再現(xiàn)性好的測定。一般在最后移除抗蝕材料，但也可不移除而使用抗蝕材料作為電極的一部分用于基因檢測。在此種情況下，需要使用耐水性高的物質(zhì)作為抗蝕材料。對于電極上形成的絕緣層， 也可使用非光敏抗蝕劑材料的材料。其例子包括金屬如Si、Ti、Al、Zn、mKCd、W、M0、Cr、Ta 和Ni的氧化物、氮化物和碳化物，以及其合金。將所述材料例如通過噴鍍、蒸汽淀積或CVD 形成薄膜后，通過光刻法對電極暴露區(qū)制作圖案，調(diào)節(jié)面積為一個特定值。也可在單個芯片上排布若干個電極單位并固定不同的探針來制備允許同時檢測若干種靶的電極。也可在單個芯片上排布若干個電極單位并固定相同的探針來制備允許同時檢測多個樣本的電極。在此種情況下，事先通過光刻法在基板上對多個電極制作圖案。此時為了防止鄰近的電極接觸，形成分離單個電極的絕緣膜是有效的。絕緣膜的厚度優(yōu)選地約0. 1至100微米。不特別限定本發(fā)明中待分析的樣本，其例子包括血液、血清、白細(xì)胞、尿、糞、精液、唾液、陰道液、組織、活組織檢查樣本、口粘膜、培養(yǎng)的細(xì)胞、咳痰等。自這些樣本提取核酸成分。不特別限制提取方法，其例子包括液液提取，例如用酚-氯仿，以及使用載體的固液提取。此外，可使用市售的核酸提取試劑盒如QIAamp OiIAGEN制備)或Sumai測試(Sumitomo Metal hdustries制備)。通過LAMP法擴增所制備的核酸成分，并將擴增產(chǎn)物與固定在電極上的探針雜交用于基因檢測。在離子強度為0. 01至5且pH為5至10的緩沖液中實施反應(yīng)?？上蛉芤褐刑砑悠渌砑游锶珉s交促進劑硫酸葡聚糖、鮭精DNA、牛胸腺DNA、EDTA 和表面活性劑。向其添加擴增產(chǎn)物。備選地，可通過將溶液滴加至基板上實施雜交。在反應(yīng)期間可例如通過攪拌或振蕩來加快反應(yīng)。反應(yīng)溫度優(yōu)選地為10°C至90°C，并且反應(yīng)期間為約1分鐘或以上至過夜。雜交反應(yīng)后，分離電極并洗滌。離子強度為0.01至5且pH為 5至10的緩沖液用于洗滌?？赏ㄟ^用熒光染料如FITC、Cy3, Cy5或羅丹明；生物素、半抗原、酶如氧化酶或磷酸酶、或者電化學(xué)活性物質(zhì)如二茂鐵或醌檢測所提取的核酸樣本，或者可通過使用事先用上述物質(zhì)標(biāo)記的第二探針檢測。例如當(dāng)使用電化學(xué)活性的DNA結(jié)合物質(zhì)檢測時，以如下方式分析核酸成分。首先洗凈基板，允許選擇性結(jié)合至電極表面形成的雙鏈區(qū)的DNA結(jié)合物質(zhì)反應(yīng)，并且電化學(xué)地分析基板。不特別地限定所使用的DNA結(jié)合物質(zhì)，其例子包括Hoechst 33258、吖啶橙、喹吖因、道諾霉素、金屬嵌入劑、雙嵌入劑如雙吖啶、三嵌入劑、和多嵌入劑。此外，可用電化學(xué)活性金屬復(fù)合體如二茂鐵或紫精(viologen)修飾這些嵌入劑。DNA結(jié)合物質(zhì)的濃度根據(jù)其種類的不同而不同，但通常在lng/ml至lmg/ml的范圍。使用離子強度在0. 001至5的范圍和pH在5至10的范圍的緩沖液。在與DNA結(jié)合物質(zhì)反應(yīng)后，洗電極并進行電化學(xué)分析。 通過包括參照電極、對電極和作用電極的三電極分析儀或通過包括對電極和作用電極的二電極分析儀進行電化學(xué)測定。在測定期間，所應(yīng)用的電壓足夠高以至于引起DNA結(jié)合物質(zhì)的電化學(xué)反應(yīng)，并且測定源自DNA結(jié)合物質(zhì)的反應(yīng)電流。電壓可線性變化，或可以脈沖形式施加或者以恒定電壓施加。在測定期間，通過使用裝置如恒電位儀、數(shù)字萬用表或函數(shù)發(fā)生器(function generator)控制電流和電壓。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，自測定的電流值計算靶基因的濃度。使用基因檢測電極的基因檢測裝置包括基因提取單元、基因反應(yīng)單元、DNA結(jié)合物質(zhì)反應(yīng)單元、電化學(xué)測定單元、洗凈單元等。 通過使用本發(fā)明的方法，可以診斷人乳頭瘤病毒感染。因此，提供了診斷人乳頭瘤病毒感染的方法，所述方法包括自人獲得樣本；從樣本提取核酸成分；使用多條引物，在LAMP反應(yīng)中擴增樣本中的核酸鏈的步驟，其中所述多條引物包括選自上述核酸引物的至少一條引物；以及在擴增反應(yīng)后分析是否有擴增產(chǎn)物的步驟，其中存在擴增產(chǎn)物表明人乳頭瘤病毒感染。也提供了診斷人乳頭瘤病毒感染的方法，所述方法包括自人獲得樣本；從樣本提取核酸成分；使用多條引物，在LAMP反應(yīng)中擴增樣本中的核酸鏈的步驟，其中所述多條引物包括選自上述核酸引物的至少一條引物；以及在擴增反應(yīng)后分析是否有擴增產(chǎn)物或鑒定病毒的基因型的步驟，其中存在擴增產(chǎn)物導(dǎo)致對人乳頭瘤病毒感染的診斷。此外，本發(fā)明提供了用于檢測人乳頭瘤病毒和鑒定其基因型的LAMP擴增試劑盒。 LAMP擴增試劑盒含有選自下列(a)-(f)的核酸引物和額外地對LAMP擴增反應(yīng)所需的任何其它成分如聚合酶、dNTPs、甜菜堿、緩沖劑、陽性對照DNA和無菌水(a)核酸引物，其在同一鏈上含有選自表1中所示第一序列組的序列的互補序列和選自表2中所示第二序列組的序列；(b)核酸引物，其在同一鏈上含有選自第一序列組的序列的互補序列和選自表3 中所示第三序列組的序列；(c)核酸引物，其在同一鏈上含有選自第二序列組的序列的互補序列和選自第三序列組的序列；(d)核酸引物，其含有通過插入、缺失、或替代一個或多個堿基而不同于核酸引物 (a)、(b)和(c)之一的所選序列的序列，并且能夠與具有核酸引物(a)、(b)和(c)之一的所選序列的互補序列的核酸鏈雜交；(e)核酸引物，其含有選自表4中所示第四序列組的序列或其互補序列；和(f)核酸引物，其含有通過插入、缺失、或替代一個或多個堿基而不同于核酸引物 (e)之一的所選序列的序列，并且能夠與具有核酸引物(e)之一的所選序列的互補序列的核酸鏈雜交。此外，本發(fā)明提供了用于檢測人乳頭瘤病毒和鑒定其基因型的檢測試劑盒。檢測試劑盒包括上述的LAMP擴增試劑盒和用于檢測通過使用該LAMP擴增試劑盒擴增的人乳頭瘤病毒LAMP擴增產(chǎn)物的、其上攜帶有固定的核酸鏈的支持物，所述固定的核酸鏈?zhǔn)?g)核酸探針，其含有選自表5中所示第五序列組的序列或其互補序列，或(h)核酸探針，其含有通過插入、缺失、或替代一個或多個堿基而不同于核酸引物 (g)之一的所選序列的序列，并且能夠與具有核酸引物(g)之一的所選序列的互補序列的核酸鏈雜交。可將核酸探針固定在支持物的表面上，并且支持物和支持物表面是使用上述材料制備的。
實施例下面，通過對應(yīng)于引物區(qū)的序列，即第一序列組、第二序列組、第三序列組、和第四序列組中的序列的一般的例子示于下表中。表1代表性的核酸引物序列
權(quán)利要求
1.用于檢測人乳頭瘤病毒基因型的LAMP擴增用核酸引物的一個組，其中所述組是分別由序列SEQ ID No. 474，476，477，475和480組成的五種核酸引物的組。
2.用于檢測人乳頭瘤病毒基因型的LAMP擴增用核酸引物的組的混合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸引物的組和至少一個選自以下的組分別由序列SEQ ID No. 136，132，126，128和138組成的五種核酸引物的組1 ； 分別由序列SEQ ID No. 278，276，277，281和280組成的五種核酸引物的組2 ； 分別由序列SEQ ID No. 527，5 ，5 ，523和5 組成的五種核酸引物的組3 ； 分別由序列SEQ ID No. 164，167，162，166和170組成的五種核酸引物的組4 ； 分別由序列SEQ ID No. 320，327，319，3 和3 組成的五種核酸引物的組5 ； 分別由序列SEQ ID No. 454,457,453,456和458組成的五種核酸引物的組6 ； 分別由序列SEQ ID No. 363，359，366，361和370組成的五種核酸引物的組7 ； 分別由序列SEQ ID No. 399，391，395，388和402組成的五種核酸引物的組8 ； 分別由序列SEQ ID No. 549，547，548，546和572組成的五種核酸引物的組10 ； 分別由序列SEQ ID No. 208，203，210，205和214組成的五種核酸引物的組11 ； 分別由序列SEQ ID No. 251，244，248，242和255組成的五種核酸引物的組12 ；和分別由序列SEQ ID No. 422，425，420，似9和431組成的五種核酸引物的組13。
3.用于檢測人乳頭瘤病毒基因型的檢測試劑盒，其包含由根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸引物的組和SEQ ID No. 752的序列的核酸探針組成的引物-探針的組9。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測試劑盒，其還包含至少一個選自以下的引物-探針的組引物-探針的組1，由根據(jù)權(quán)利要求2的組1和SEQ ID No. 600的序列的核酸探針組成；引物-探針的組2，由根據(jù)權(quán)利要求2的組2和SEQ ID No. 6M的序列的核酸探針組成；引物-探針的組3，由根據(jù)權(quán)利要求2的組3和SEQ ID No. 771的序列的核酸探針組成；引物-探針的組4，由根據(jù)權(quán)利要求2的組4和SEQ ID No. 623的序列的核酸探針組成；引物-探針的組5，由根據(jù)權(quán)利要求2的組5和SEQ ID No. 673的序列的核酸探針組成；引物-探針的組6，由根據(jù)權(quán)利要求2的組6和SEQ ID No. 750的序列的核酸探針組成；引物-探針的組7，由根據(jù)權(quán)利要求2的組7和SEQ ID No. 676的序列的核酸探針組成；引物-探針的組8，由根據(jù)權(quán)利要求2的組8和SEQ ID No. 699的序列的核酸探針組成；引物-探針的組10，由根據(jù)權(quán)利要求2的組10和SEQ ID No. 783的序列的核酸探針組成；引物-探針的組11，由根據(jù)權(quán)利要求2的組11和SEQ ID No. 630的序列的核酸探針組成；引物-探針的組12，由根據(jù)權(quán)利要求2的組12和SEQ ID No. 641的序列的核酸探針組成；引物-探針的組13，由根據(jù)權(quán)利要求2的組13和SEQ ID No. 725的序列的核酸探針組成。
5.檢測人乳頭瘤病毒基因型的方法，其包括通過使用核酸引物由LAMP擴增樣本中的核酸鏈，從而獲得擴增產(chǎn)物的步驟； 將擴增產(chǎn)物與核酸探針雜交的步驟；以及， 檢測通過雜交形成的雙鏈來檢測人乳頭瘤病毒基因型的步驟， 其中核酸引物和核酸探針包含由根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸引物的組和SEQ ID No. 752的序列的核酸探針組成的引物-探針的組9。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中核酸引物和核酸探針包含根據(jù)權(quán)利要求5的引物-探針的組9和至少一個選自以下的引物-探針的組引物-探針的組1，由根據(jù)權(quán)利要求2的組1和SEQ ID No. 600的序列的核酸探針組成；引物-探針的組2，由根據(jù)權(quán)利要求2的組2和SEQ ID No. 6M的序列的核酸探針組成；引物-探針的組3，由根據(jù)權(quán)利要求2的組3和SEQ ID No. 771的序列的核酸探針組成；引物-探針的組4，由根據(jù)權(quán)利要求2的組4和SEQ ID No. 623的序列的核酸探針組成；引物-探針的組5，由根據(jù)權(quán)利要求2的組5和SEQ ID No. 673的序列的核酸探針組成；引物-探針的組6，由根據(jù)權(quán)利要求2的組6和SEQ ID No. 750的序列的核酸探針組成；引物-探針的組7，由根據(jù)權(quán)利要求2的組7和SEQ ID No. 676的序列的核酸探針組成；引物-探針的組8，由根據(jù)權(quán)利要求2的組8和SEQ ID No. 699的序列的核酸探針組成；引物-探針的組10，由根據(jù)權(quán)利要求2的組10和SEQ ID No. 783的序列的核酸探針組成；引物-探針的組11，由根據(jù)權(quán)利要求2的組11和SEQ ID No. 630的序列的核酸探針組成；引物-探針的組12，由根據(jù)權(quán)利要求2的組12和SEQ ID No. 641的序列的核酸探針組成；引物-探針的組13，由根據(jù)權(quán)利要求2的組13和SEQ ID No. 725的序列的核酸探針組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中將核酸探針固定在支持物表面。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中支持物表面是用電極材料制成的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中在檢測雙鏈的步驟中使用電化學(xué)活性的核酸鏈識別劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于檢測人乳頭瘤病毒和鑒定其基因型的LAMP擴增用核酸引物。本發(fā)明還提供了檢測人乳頭瘤病毒和鑒定其基因型的方法，其包括在LAMP反應(yīng)中通過使用多條引物擴增樣本中的核酸鏈的步驟，其中所述多條引物包括選自根據(jù)本發(fā)明的核酸引物中的至少一條引物；以及在擴增反應(yīng)后檢測擴增產(chǎn)物的存在并鑒定它們的基因型的步驟。
文檔編號C12Q1/68GK102517401SQ20121001325
公開日2012年6月27日 申請日期2006年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月8日
發(fā)明者中村奈緒子, 伊藤桂子, 佐藤宰, 堀內(nèi)秀紀(jì), 橋本幸二, 橋本美智惠 申請人:株式會社東芝, 積水醫(yī)療株式會社