專利名稱：重組人硫氧還蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種重組人硫氧還蛋白的制備方法，具體涉及從原核表達(dá)重組人硫氧還蛋白，重組人硫氧還蛋白的純化及鑒定，構(gòu)建重組人硫氧還蛋白菌種庫(kù)、測(cè)定種子庫(kù)的傳代穩(wěn)定性，鑒定重組人硫氧還蛋白的體外生物活性等。
背景技術(shù)：
硫氧還蛋白(Trx)是分子量約為12kDa的小分子蛋白質(zhì)，它的氨基酸序列中含有調(diào)節(jié)氧化還原活性的二硫鍵/巰基，該結(jié)構(gòu)位于保守序列=Cys-Gly-PiO-Cys中，為其活性中心。氧化條件下，Cys32和Cys35之間形成二硫鍵(Trx_S2),該二硫鍵能被TrxR通過 NADPH供氫還原，還原型Trx (Trx- (SH) 2)含有巰基。Trx就是通過二硫鍵和巰基的互換來實(shí)現(xiàn)其氧化還原調(diào)節(jié)功能的。研究發(fā)現(xiàn)Trx廣泛存在于原核生物、真核生物、植物和哺乳動(dòng)物中，結(jié)構(gòu)高度保守，人類Trx有105個(gè)氨基酸組成。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的Trx在活性中心以外還存在另外3個(gè)半胱氨酸殘基，可以通過后修飾改變Trx的活性。人的Trx可分為胞衆(zhòng)型(Trxl)和線粒體型(Trx2)兩種亞型。Trx系統(tǒng),包括Trx、 Trx還原酶(TrxR)、還原型輔酶II (NADPH)和Trx過氧化物酶(TrxP)，是一個(gè)控制細(xì)胞還原 /氧化狀態(tài)和細(xì)胞增殖/生存的廣泛表達(dá)的氧化還原酶系統(tǒng)。Trx在TrxR的作用下可以從氧化型轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型，還原型的Trx可以催化許多含有二硫鍵蛋白質(zhì)的還原反應(yīng)。TrxP可以在還原型Trx的參與下將過氧化氫還原為H20。研究發(fā)現(xiàn)，Trx除了基本的氧化還原調(diào)節(jié)功能，還有抗炎、抗凋亡等許多其他生物學(xué)活性，因而其與人類疾病的關(guān)系日益受到人們的重視。人體內(nèi)的Trx是一類防御蛋白，能對(duì)多種應(yīng)激狀況做出響應(yīng)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)。除了其抗氧化效應(yīng)，Trx具有抗凋亡和抗炎作用，并且抑制白細(xì)胞趨化和趨化因子的表達(dá)。已證明在動(dòng)物模型中，在心血管疾病中扮演著重要角色，是維持心血管穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子。 動(dòng)物體內(nèi)注射重組人Trx或者Trx在動(dòng)物體內(nèi)的過表達(dá)都可以有效地發(fā)揮抗氧化和抗炎作用?？梢酝ㄟ^減少氧化/硝化應(yīng)激、抑制心肌細(xì)胞凋亡來減弱心肌缺血/再灌注損傷，改善心臟功能，減少心梗面積，從而發(fā)揮其心臟保護(hù)作用。并且Trx溶解性好，作為其它蛋白的融合表達(dá)標(biāo)簽，可以有效促進(jìn)蛋白的可溶性表達(dá)。Trx有較好的熱穩(wěn)定性，在4°C可保存一個(gè)月以上，可以短時(shí)間耐受80°C的溫度。Trx 在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的半衰期并不相同，在小鼠體內(nèi)是I小時(shí)，大鼠是2小時(shí)，猴子是8小時(shí)，隨尿液排出體外。雖然硫氧還蛋白有著廣泛的應(yīng)用前景，但目前用于實(shí)驗(yàn)室及臨床試驗(yàn)的Trx主要有兩大類，其中主要以從動(dòng)物組織中提取的多見，但從動(dòng)物組織中提取的Trx產(chǎn)量少、純度低、免疫源性強(qiáng)、價(jià)格昂貴。還有少數(shù)是采用基因工程重組的，但這些基因工程重組的Trx 大都是帶有標(biāo)簽的，這種帶有標(biāo)簽的Trx無法應(yīng)用與人體，只有少數(shù)是不帶標(biāo)簽的，但大多僅限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，工藝可行度低、難以擴(kuò)大生產(chǎn)，無法滿足成藥性評(píng)價(jià)這些都使Trx應(yīng)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人硫氧還蛋白的制備方法，本發(fā)明的制備方法步驟簡(jiǎn)單，快速可靠，成本低，僅僅使用了兩步離子交換層析就完成了純化過程，且純度達(dá)到95 % 以上。此方法制備的人硫氧還蛋白具有生物學(xué)活性，可以和鼠抗人硫氧還蛋白抗血清特異性結(jié)合，還可使胰島素二硫鍵還原，其活性和標(biāo)準(zhǔn)品無差別。“重組人硫氧還蛋白”(rhTrx)的DNA序列如SEQ ID No 1所示。本發(fā)明的重組人硫氧還蛋白的制備方法，其特征在于，該制備方法包含以下步驟I)誘導(dǎo)培養(yǎng)含有重組人硫氧還蛋白的重組菌，離心獲得菌體；2)超聲波裂菌，破碎細(xì)胞，離心，收集上清；3)將步驟2)得到的上清上樣于陰離子交換層析柱，收集目的蛋白所在洗脫峰，得到一次純化產(chǎn)物；4)將得到的一次純化產(chǎn)物上樣于陽離子交換層析柱， 收集目的蛋白所在洗脫峰，得到重組人硫氧還蛋白。最終獲得純度達(dá)95%以上、96%以上、 97%以上、98%以上、99%以上、或100%的目的蛋白質(zhì)。步驟I)中，當(dāng)培養(yǎng)至0D600nm達(dá)到7-8時(shí)，加入終濃度為ImM的IPTG作為誘導(dǎo)劑， 所述菌為大腸桿菌BL21 (DE3)。本發(fā)明所述人硫氧還蛋白的基因序列如SEQ ID N0:1所不。步驟2)中，加入裂菌緩沖液進(jìn)行裂菌，菌體和裂菌緩沖液的比例為Ig菌體加IOml 裂菌緩沖液，所述裂菌緩沖液為STE裂菌緩沖液，該裂菌緩沖液由IOOmM NaCl、lmMEDTA、pH 8. O 的 50mM Tris-HCl 組成。步驟3)中，所述陰離子交換層析柱為DEAE陰離子交換層析柱，具體為 DEAESepharose Fast Flow層析柱。步驟4)中,所述陽離子交換層析柱為SP陽離子交換層析柱，具體為SP Sepharose Fast Flow層析柱。在步驟3)中，上清上樣前，先用A液(20mM Tris-HCl，ImM EDTA, pH 8. O)充分平衡 DEAE Sepharose Fast Flow (high sub) (GE 公司)層析柱；上清上樣后，用 B 液(20mM Tris-HCl，ImM EDTA, IM NaCl，pH 8. O)(洗脫緩沖液)連續(xù)梯度洗脫10個(gè)柱床體積，收集目的蛋白所在洗脫峰(見圖8)，再加150倍體積C液(20mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，ImM EDTA, pH 4. O)(透析液)，透析24h，中間換液三到四次。在步驟4)中,先用C液充分平衡SP Sepharose Fast Flow (GE公司)層析柱,再將透析后的上清上樣，用D液(20mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，IM NaCl, ImM EDTA，pH 4.0) (洗脫緩沖液)連續(xù)梯度洗脫10個(gè)柱床體積，收集目的蛋白所在洗脫峰(見圖9)，將其對(duì) 150 倍體積的 PBS (NaCl 10g/L, KCl 0. 2g/L, Na2HPO4. 12H20 2. 9g/L, KH2PO4O. 2g/L)分 3 次透析，用0. 22 μ m濾膜過濾除菌,分裝后-20°C保存?zhèn)溆?。由圖10、12、13可知，僅僅通過一個(gè)陰離子交換層析和一個(gè)陽離子交換層析，就可以獲得純度很高的重組人硫氧還蛋白，純度可以達(dá)到95%以上、96%以上、97%以上、98% 以上、99%以上、或100%。重組人硫氧還蛋白的純度鑒定和活性鑒定，采用SDS-PAGE和免疫印跡的半定性分析，HPLC，質(zhì)譜分析；重組人硫氧還蛋白的體外生物活性鑒定，采用的是胰島素二硫鍵還原法。
本發(fā)明的制備方法中，超聲裂菌后的上清僅僅只需要經(jīng)2步離子交換作用層析就可以完成目的蛋白的純化過程，其中，裂菌上清經(jīng)DEAE離子交換作用層析可去除50%以上的雜蛋白，在經(jīng)SP離子交換作用層析可得到純度大于95%的目的蛋白。


圖I所示為重組質(zhì)粒pET_22b (+) -Trx的雙酶切鑒定圖；A 圖pET-22b (+) -Trx/Nde I 和 BamH I 雙酶切位點(diǎn)示意圖；B圖為酶切后的凝膠電泳圖M為DNA marker,左邊泳道I為目的條帶。圖2所示為pET_22b (+) -Trx的測(cè)序結(jié)果圖。圖3所示為重組菌的菌落形態(tài)鑒定。圖4所示為重組菌的革蘭染色鑒定。圖5所示為重組菌的透射電鏡鑒定；A圖為放大5000倍；B圖為放大10000倍。圖6所示為重組工程菌傳代穩(wěn)定性檢定-重組質(zhì)粒酶切圖譜，其中，重組質(zhì)粒用 Nde I和BamH I雙酶切，進(jìn)行I %瓊脂糖電泳，M. DNA marker, I.原代，2. 10代，3. 20代， 4. 30 代，5. 40 代，6. 50 代。圖7所示為重組工程菌傳代穩(wěn)定性檢定-產(chǎn)物表達(dá)水平檢定，其中EpiOtein marker ；1.誘導(dǎo)前；2.原代；3. 10 代；4. 20 代；5. 30 代；6. 40 代；7. 50 代。圖8所示為重組人硫氧還蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果，其中；A圖隨發(fā)酵時(shí)間變化的OD值，在發(fā)酵6h時(shí)加入ImM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；B 圖1 protein marker ;2 :未誘導(dǎo) BL21/pET_22b (+)-Trx ；3 lmM IPTG 誘導(dǎo) BL21/pET-22b (+) -Trx Ih ；4 lmM IPTG 誘導(dǎo) BL21/pET_22b (+)-Trx 2h ；5 lmM IPTG 誘導(dǎo) BL21/pET-22b (+) -Trx 3h ；6 lmM IPTG 誘導(dǎo) BL21/pET_22b (+)-Trx 4h。圖9所示為DEAE陰離子交換層析結(jié)果，其中，A 圖裂菌上清經(jīng) DEAE Sepharose Fast Flow 層析圖；B圖1 protein marker ；2 :裂菌上清；3 :收集穿過液；4 ;收集峰_目的蛋白。圖10所示為SP陽離子交換層析結(jié)果，其中，A 圖粗純產(chǎn)物經(jīng) SP Sepharose Fast Flow 層析圖；B圖1 protein marker ;2、3 :收集峰_目的蛋白低濃度上樣;4、5 :收集峰_目的蛋白中濃度上樣；6、7、8 :收集峰-目的蛋白高濃度上樣。圖11所示為重組人硫氧還蛋白的純化結(jié)果,其中，I protein marker ；2 :裂菌上清；3 =DEAE陰離子交換作用純化目的蛋白；4 SP陽離子交換作用純化目的蛋白。圖12所示為通過本發(fā)明的制備方法獲得的重組人硫氧還蛋白的免疫印跡鑒定， 左右均為純化出的蛋白。圖13所示為通過本發(fā)明的制備方法獲得的重組人硫氧還蛋白的HPLC分析圖。圖14所示為通過本發(fā)明的制備方法獲得的重組人硫氧還蛋白的質(zhì)譜分析圖。圖15所示為通過本發(fā)明的制備方法獲得的重組人硫氧還蛋白的活性測(cè)定結(jié)果； 反應(yīng)液中有l(wèi)ug/ul標(biāo)準(zhǔn)品Trx ；
■反應(yīng)液中有l(wèi)ug/ul本方法純化出的Trx ；空白對(duì)照。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)材料(I)主要儀器5415C臺(tái)式離心機(jī)，Eppendorf公司；GS_15R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī),美國(guó)Beckman 公司；V0RTEX_2混合器，Scientific industries公司；PHS_3C型精密pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；CSI0I-IE電熱鼓風(fēng)干燥箱，中外合資重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DY-C1轉(zhuǎn)移電泳儀，江蘇省興化市分析儀器廠；SHH-3生化培養(yǎng)箱，重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器廠；恒溫水浴箱， Pharmacia(LKB)公司；SBD50_1 bio 恒溫水浴搖床，丹麥 Heto master Shaker 公司；恒溫空氣搖床，德國(guó)GALLENKAMP ;蛋白電泳儀，Bio-Rad公司；紫外透射反射分析儀，浙江永嘉上塘教學(xué)儀器廠J2-HS全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司；J_6B大容量離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司；377型全自動(dòng)序列分析儀，PE公司；Labo Autoclave高壓滅菌儀， ANYO公司；1815TC C02恒溫孵育箱，美國(guó)Shel-Lab公司；TH_2C恒溫震蕩器，江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；常壓液相色譜儀控制器Phamacia GP-IO ;螺動(dòng)泵Phamacia P_1 ;紫外檢測(cè)儀 Phamacia Uricord SII ;分部收集器Phamacia RediFrac ;超凈工作臺(tái)，安徽蛘埤凈化設(shè)備廠；MiIIi-QUF 純水器，MiIIipore 公司；Lambda UV/VIS 分光光度計(jì)，PE 公司；DW1.0-60E 冷凍干燥機(jī)，丹麥Heto公司。(2)主要試劑材料細(xì)菌菌種E. coli DH5 a，E. coli BL21 (DE3)由大四軍醫(yī)大學(xué)生物技術(shù)中心提供質(zhì)粒載體pET_22b由大四軍醫(yī)大學(xué)生物技術(shù)中心提供分子生物學(xué)試劑質(zhì)粒純化試劑盒與核酸片段純化試劑盒購(gòu)自上海博亞公司Jrizol為 Invitrogen公司產(chǎn)品；M_MLV逆轉(zhuǎn)錄酶為promega產(chǎn)品；限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和EcoR I 購(gòu)自TaKaRa公司；T4DNA連接酶，TaqDNA聚合酶，DNAMarker購(gòu)自TaKaRa公司；蛋白Marker 購(gòu)自Pharmacia公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自omiga公司；離子交換層析柱購(gòu)自QIAGEN 公司?？谷肆蜓踹€蛋白單克隆抗體購(gòu)于Abcam公司。羊抗小鼠IgG-HRP,購(gòu)自Santa公司。 硫氧還蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自sigma公司。主要化學(xué)試劑胰蛋白胨，酵母提取物為Oxide公司產(chǎn)品，Tris base為Promega公司產(chǎn)品，IPTG 為Solon公司產(chǎn)品，TEMED購(gòu)于Bio-Rad公司。丙烯酰胺、N，N' - 二甲基雙丙烯酰胺、SDS、 過硫酸銨、氯化鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、甘油、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸氫鈉、硫酸銨、氯化銨等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。主要工作液的配制LB培養(yǎng)液胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉5g/LLB固體培養(yǎng)基胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，瓊脂15g/L，氯化鈉5g/L種子培養(yǎng)基胰蛋白胨I. 6g/L,酵母提取物lg/L,氯化鈉O. 5g/L,甘油2ml/L發(fā)酵培養(yǎng)基胰蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，甘油20ml/L，硫酸鎂O. 6g/L，
磷酸二氫鉀4g/L，磷酸氫二鉀8g/L，硫酸氫鈉14g/L，硫酸銨2. 4g/L，氯化銨 O.04g/L發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)液胰蛋白胨16g/L，酵母提取物8g/L，甘油80ml/L，硫酸鎂lg/L，PBS NaCl 10g/L, KCl O. 2g/L, Na2HPO4. 12H20 2. 9g/L, KH2PO4 0. 2g/L實(shí)施例一構(gòu)建重組人硫氧還蛋白基因表汰載體pET~22b (+) -rhTrx(I)獲得人硫氧還蛋白全長(zhǎng)cDNA收集HEK293 (人胚胎腎)細(xì)胞并加入ImL Trizol試劑，總RNA的提取按說明常規(guī)操作。紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度A260nm/A280nm = I. 90。根據(jù)已報(bào)道的人Trxl基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，基因登陸號(hào)為Gene ID :7295,由華大基因公司合成。上游引物5’GGAATTCCATATGGTGAAGCAGATC 3’下游引物5’GCGGATCCTTAGACTAATTCATTAATG 3’cDNA 第 I 鏈的合成按照 Promega 公司 M-MLVReverse Transcriptase 說明書進(jìn)行，主要的操作步驟如下在聚合酶鏈反應(yīng)管中加入總RNA1. 5 μ g，隨機(jī)引物 oligo (dT) 2 μ L(濃度為 10 μ mol/L)，DEPC 水補(bǔ)足至 12 μ L，混勻，70 °C 孵育 5min 后迅速冰浴，加入 M-MLV 5XBuffer4y L, 10mmol/L dNTPmix 2 μ L, M-MLVReverse Transcriptase (2OOU/μ L) I μ L，力口 ddH20至總體系 20 μ L，42°C反應(yīng)60min，70°C孵育 IOmin 滅活反轉(zhuǎn)錄酶以終止反應(yīng)。cDNA的聚合酶鏈反應(yīng)總反應(yīng)體積為25 μ L :Template cDNA 4 μ L,上游引物 2 μ L,下游引物 2 μ L, Taq DNA Polymerase 12. 5 μ L，加H20 M 25 μ L0反應(yīng)條件如下94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s, 55°C退火30s， 72°C延伸45s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)lOg/L瓊脂糖凝膠電泳分析后，快速取350bp左右處的條帶進(jìn)行割膠純化。(2) pET-22b (+) -rhTrx 的構(gòu)建及鑒定所得DNA片段經(jīng)Nde I和BamH I雙酶切后連入同樣用Nde I和EcoR I雙酶切得到的pET-22b(+)載體片段，連接產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)入E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定獲得預(yù)期大小的插入片段(圖1)，DNA測(cè)序結(jié)果顯示序列正確(圖2)。將此質(zhì)粒命名為pET-22b (+) -rhTrx。實(shí)施例二構(gòu)津重組人硫氧還蛋白菌種庫(kù)(I)感受態(tài)細(xì)胞的制備取E. coli BL21 (DE3)甘油菌種按I : 100的比例接種于LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)接一次，繼續(xù)培養(yǎng)至0D600約0. 4左右(無菌操作)。將菌液冰浴lOmin， 離心(3000rpmX 5min, 4°C )后棄去上清，加入1/2體積預(yù)冷的100mmol/L CaC12,輕輕吹起沉淀，冰浴40min,離心(3000rpmX5min,4 )，棄上清后加入1/25體積的含25%甘油的 100mmol/L CaC12,吹起沉淀,分裝入Eppendorf管中，-70°C保存?zhèn)溆谩?2)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)將大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞從-70 °C中取出，冰浴溶解5-10min，加入 pET-22b (+) -rhTrx的連接產(chǎn)物，輕微混勻，冰浴20min，42°C熱休克90s，然后鋪板，37°C培養(yǎng)過夜。(3)質(zhì)粒的提取和鑒定
在連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后37°C培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)皿上挑取邊緣整齊，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單克隆，接種到IOOmL含Amp的LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng)9h，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒 50管，用限制性內(nèi)切酶Nde I和BamH I進(jìn)行雙酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有插入片段以及插入的片斷是否與預(yù)期的大小一致。將酶切鑒定陽性的克隆送北京華大基因有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。將測(cè)序正確者命名為pET-22b (+) -rhTrx。(4)甘油菌的制備在連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后37°C培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)皿上挑取邊緣整齊，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的克隆，接種到IOOmL含Amp的LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng)9h，取菌液加入50%甘油，分裝于菌種管內(nèi)，封口，制備50管，-70°C保存。(5)種子庫(kù)的檢定菌落形態(tài)檢定呈典型的大腸桿菌菌落形態(tài)，無其他雜菌生長(zhǎng)(圖3);革蘭氏染色檢定為典型的革蘭氏陰性桿菌(圖4);透射電鏡檢定為典型的大腸桿菌形態(tài)，無支原體、病毒樣顆粒及其它微生物的污染(圖5);抗生素抗性檢定與原始菌種抗性相符；工程菌的生化反應(yīng)特性符合大腸桿菌生物學(xué)性狀。(6)工程菌的傳代穩(wěn)定性檢定工程菌在LB平板上劃痕傳代50次，每10代觀察質(zhì)粒酶切圖譜、產(chǎn)物的的表達(dá)水平和裂菌上清rhTrx活性，結(jié)果顯示，質(zhì)粒酶切圖譜、工程菌表達(dá)水平和裂菌上清硫氧還蛋白活性均與原始菌種一致(圖6、7)。實(shí)施例三重組人硫氧還蛋白的表汰(I)重組人硫氧還蛋白的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室研究階段，我們采用三角搖瓶對(duì)工程菌進(jìn)行培養(yǎng)，具體步驟如下重組質(zhì)粒pET-22b (+) -Trx轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，12h后挑取邊緣整齊，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌落，接種于LB培養(yǎng)液(含氨芐青霉素100mg/L)中，搖床37°C培養(yǎng)過夜，次日以
I 100的比例接種于新鮮LB培養(yǎng)液(含氨芐青霉素100mg/L)中，37°C繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)菌密度達(dá)到0D600 = O. 4 O. 6，加入ImM IPTG，誘導(dǎo)4h后收集菌體。(2)重組人硫氧還蛋白發(fā)酵工藝的建立將_70°C保存的甘油菌種劃線接種于含氨芐青霉素(100mg/L)的固體LB平板， 37°C恒溫孵箱培養(yǎng)過夜，挑生長(zhǎng)良好的單克隆接種于LB培養(yǎng)液(含氨芐青霉素100mg/L) 中，搖床37°C培養(yǎng)至細(xì)菌密度達(dá)到0D600 = 0. 6，以1%接種于50ml種子培養(yǎng)基中(含氨芐青霉素100mg/L)37°C，220rpm培養(yǎng)過夜為一級(jí)種子液；次日以I : 100的比例接種于新鮮 LB培養(yǎng)液(含氨芐青霉素100mg/L) 100mlX2瓶中，37°C，220rpm繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)菌密度達(dá)到 0D600 = 0. 4 0. 6，生長(zhǎng)為二級(jí)種子液。準(zhǔn)備用于上發(fā)酵罐。采用Biostat_CT5自控發(fā)酵罐，發(fā)酵體積為5L，溶氧控制在30% -60%,通過調(diào)節(jié)通氣流速(AIRFL)以及攪拌轉(zhuǎn)數(shù)(STIRR)對(duì)其進(jìn)行控制，當(dāng)轉(zhuǎn)數(shù)達(dá)到最大(800rpm)，氣流為4. 00L/Min時(shí)，通入純氧；溫度控制為37°C ；pH控制在7左右，當(dāng)pH值低于該值時(shí)，用補(bǔ)加氨水來控制；采用分批補(bǔ)料流加方式發(fā)酵前3h不加補(bǔ)料，4-7h流加速率為100ml/h， 7-10h為200ml/h。整個(gè)發(fā)酵過程中，通過控制pH值、活化和誘導(dǎo)時(shí)間、溶解氧飽和度和補(bǔ)料的流加速率，觀察工程菌的生長(zhǎng)和目的蛋白的表達(dá)。每30min取樣測(cè)定0D600nm值，當(dāng)培養(yǎng)至0D600nm達(dá)到7-8時(shí)加入終濃度為ImM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4h后收集菌體，取小量進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，其余菌體保存與_70°C用于純化。(3) SDS-PAGE 電泳鑒定30 μ L超聲裂菌上清，加入30 μ I 2 X載樣緩沖液，混勻。沸水中煮lOmin，冷卻后12000rpm離lOmin，取IOy I上清加樣于15%分離膠6%濃縮膠，上樣后電壓為80V約 30min，樣品進(jìn)入分離膠后電壓升至120V約2h，用O. 5%考馬斯亮蘭R-250振蕩染色2_3h， 脫色直至背景清晰后制備干膠保存。從圖8中可知，當(dāng)培養(yǎng)至0D600nm達(dá)到7_8時(shí)，重組菌的細(xì)胞增殖進(jìn)入了快速分裂增殖期，此時(shí)是加入誘導(dǎo)劑的最佳時(shí)間；當(dāng)1禮IPTG誘導(dǎo)4h時(shí)，重組蛋白質(zhì)的表達(dá)量最大， 因此選擇ImM IPTG誘導(dǎo)4h最佳。實(shí)施例四重組人硫氧還蛋白的純化(I)超聲裂菌取IOg 表達(dá)濕菌，將其懸浮于 IOOmL STE(IOOmMNaCl, 50mM Tris. Cl, ImM EDTAjPH 8. O)中，在冰浴中300W超聲裂菌，超聲5s，間歇10s，全程40min，離心(12000rpmX 40min, 4°C )，保留上清，用O. 45 μ m濾膜過濾除去雜質(zhì)。(2)離子柱層析收集的上清用A液20mM Tris-HCl pH 8. O, ImM EDTA充分平衡的DEAE Sepharose Fast Flow (high sub) (GE 公司)層析純化，用 B 液20mM Tris-HCl, ImM EDTA, IMNacl, pH 8. 0，連續(xù)梯度洗脫10個(gè)柱床體積，收集目的蛋白所在洗脫峰(見圖9)，再加150倍體積C 液20mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，ImM EDTA, pH 4. 0，透析24h，中間換液三到四次。透析后上清用C液充分平衡的SP Sepharose Fast Flow (GE公司)層析純化,用 D液20mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，IM NaCl，ImM EDTA, pH 4. O連續(xù)梯度洗脫10個(gè)柱床體積，收集目的蛋白所在洗脫峰(見圖10)，將其對(duì)150倍體積PBS透析，分3次透析，用
0.22 μ m濾膜過濾除菌，分裝后_20°C保存?zhèn)溆?。由圖11可知，僅僅通過一個(gè)陰離子交換層析和一個(gè)陽離子交換層析，就可以獲得純度很高的重組人硫氧還蛋白。實(shí)施例五重組人硫氧還蛋白的鑒定(I)Lowry’ s法測(cè)蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定精確量取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(100yg/ml)0,0.2,0.4,0.6,0.8,
1.Oml分別置于試管中(雙管)，加蒸餾水補(bǔ)至lml。其余操作同樣品，可得一標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品檢測(cè)方法精確量取一定體積樣品(含蛋白50 μ g左右)，迅速混勾，室溫放置 30min,650nm 比色。蛋白質(zhì)含量計(jì)算根據(jù)OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出所測(cè)樣品蛋白含量或?qū)D值代入回歸方程計(jì)算蛋白含量。注若樣品含量超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，可將樣品作適當(dāng)稀釋。(2)重組人硫氧還蛋白的免疫印跡鑒定誘導(dǎo)后的菌體在SDS-PAGE結(jié)束后，拆下凝膠，按照Bio-Rad產(chǎn)品說明，將凝膠靠近陰極一側(cè)、聚偏氟乙烯(PVDF)膜靠近陽極一側(cè)，在預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液(25mM Tris、192mM Glycine、20%甲醇)中100V恒壓電泳40分鐘，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。電泳結(jié)束后，取出 PVDF膜，洗滌液TBST(20mM Tris-HCl，ρΗ7· 5、150mM NaCl,0. 05% Tween-20)清洗后浸入封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST)中4°C封閉過夜，TBST室溫洗3次，每次lOmin，加入人硫氧還蛋白單克隆抗體(I 1000稀釋孵育I :15h，TBST室溫洗3次，每次lOmin，再加入羊抗小鼠IgG-HRP (按I : 5000稀釋)，室溫孵育45min, TBST室溫洗3次，每次lOmin, PVDF 膜浸入DAB顯色液中，室溫避光顯色lmin，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)(見圖12)。(3)高效液相色譜分析用流動(dòng)相(20mM Tris-HCl pH 8. O)平衡色譜柱至基線平穩(wěn)，流速為O. 6ml/min，取 25μ I蛋白樣品上樣，用流動(dòng)相洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，記錄并分析結(jié)果。見圖13，通過本發(fā)明的制備方法制備獲得的重組人硫氧還蛋白的純度很高，未見雜質(zhì)。(4)質(zhì)譜分析(MALDI-TOF-MS)用截留分子量為3000Da的超濾離心管對(duì)純化的蛋白樣品進(jìn)行除鹽、濃縮， O. 22 μ m濾器過濾除菌后，委托西安工業(yè)大學(xué)對(duì)其進(jìn)行分子量測(cè)定。見圖14，通過本發(fā)明的制備方法制備獲得的重組人硫氧還蛋白的純度很高，未見雜質(zhì)。(5)重組人硫氧還蛋白體外生物學(xué)活性檢測(cè)取純化的蛋白調(diào)整濃度為40 μ g/40 μ I,加入2 μ I的活化液[activationbuffer IOOmM XN-2 輕乙基喊嚷-N -2 乙橫酸(Hepes), 2mM 乙二胺四乙酸(EDTA), lmg/ml BSA, and 2mM dithiothreitol]后在 37°C下孵育 20mins。然后加入 20 μ I 的反應(yīng)液(reaction buffer 100mM Hepes,2. OmM EDTA,0. 2mMNADPH, and 140 μ M insulin)。在待測(cè)樣本中加 Λ I μ I哺乳動(dòng)物Trx還原酶(Trx reductase 1 μ 1,15mU, Sigma),在空白對(duì)照樣品加入相同體積的去離子水。反應(yīng)體系在37°C下孵育20min后加入125 μ I反應(yīng)終止液(Stopping solution 0.2M Tris-CL,10M guanidine-HCl, and I. 7mM 3-carboxy-4-nitrophenyl disulfide)使反應(yīng)停止,將96孔板置于SpectraMax-Plus培養(yǎng)板分光光度計(jì)，于412nm處檢測(cè)反應(yīng)后樣品的吸光度，結(jié)果見圖15。本發(fā)明的效果如下a)利用基因人工合成與PCR技術(shù)成功構(gòu)建了重組人硫氧還蛋白基因表達(dá)載體 pET-22b (+) -rhTrx,其酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期一致。b)工程菌BL21/pET-22b(+)-rhTrx經(jīng)低濃度IPTG(ImM)誘導(dǎo)后便可高效表達(dá)目的蛋白，誘導(dǎo)后菌體的裂菌上清經(jīng)2步離子交換作用層析，可得到純度大于95 %的目的蛋白。c)采用免疫印跡法證明重組人硫氧還蛋白可與鼠抗人硫氧還蛋白抗血清特異性
彡口口 d)純化的重組人硫氧還蛋白與標(biāo)準(zhǔn)品人硫氧還蛋白均能使胰島素二硫鍵還原。e)摸索出穩(wěn)定的適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)的中式工藝。
權(quán)利要求
1.一種重組人硫氧還蛋白(rhTrx)的制備方法，其特征在于，該制備方法包含以下步驟1)誘導(dǎo)培養(yǎng)重組菌，離心獲得菌體；2)裂菌,離心,收集上清；3)上清上樣于陰離子交換層析柱，收集目的蛋白所在洗脫峰，得到一次純化產(chǎn)物；4)將得到的一次純化產(chǎn)物上樣于陽離子交換層析柱，收集目的蛋白所在洗脫峰，得到重組人硫氧還蛋白；最終犾得純度達(dá)95%以上的重組人硫氧還蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟I)中，當(dāng)培養(yǎng)至0D600nm達(dá)到 6-8時(shí)，加入終濃度為ImM的IPTG作為誘導(dǎo)劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟I)中，所述菌為大腸桿菌 BL21(DE3)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟2)中，加入裂菌緩沖液進(jìn)行裂菌，菌體和裂菌緩沖液的比例為Ig菌體加IOml裂菌緩沖液，所述裂菌緩沖液為STE裂菌緩沖液，該裂菌緩沖液由IOOmM NaClUmM EDTA、pH 8. O的50mM Tris-HCl組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟3)中，所述陰離子交換層析柱為 DEAE Sepharose Fast Flow 層析柱。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟4)中，所述陽離子交換層析柱為 SP Sepharose Fast Flow 層析柱。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟3)中，所述陰離子交換層析柱使用的洗脫緩沖液由 20mM Tris-HCl, ImM EDTA, IM NaCl, pH8. O 組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟3)中，收集目的蛋白所在洗脫峰后，再加150倍體積的透析液，分3次透析，所用透析液由20mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液， ImM EDTA，pH 4. O 組成。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟4)中，所述陽離子交換層析柱使用的洗脫緩沖液由20mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，IM NaCl, ImM EDTA, pH 4. O組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟4)中，收集目的蛋白所在洗脫峰后，再加150倍體積的PBS，分3次透析。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種重組人硫氧還蛋白的制備方法。通過該制備方法可獲得純度達(dá)95％以上的目的蛋白質(zhì)，所獲得的人硫氧還蛋白具有生物學(xué)活性。本發(fā)明還構(gòu)建人重組硫氧還蛋白菌種庫(kù)，測(cè)定了種子庫(kù)的傳代穩(wěn)定性；采用免疫印跡法證明該重組人硫氧還蛋白可與鼠抗人硫氧還蛋白抗血清特異性結(jié)合；還通過胰島素二硫鍵還原法測(cè)定該蛋白質(zhì)活性。結(jié)果表明，純化出的重組人硫氧還蛋白具有胰島素二硫鍵還原酶活性，且效果明顯。本發(fā)明方法僅通過兩步離子交換作用層析，就完成了目的蛋白的分離純化，步驟簡(jiǎn)單、快速、成本低，為人硫氧還蛋白的進(jìn)一步研究和廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102586201SQ20121001401
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者孫璐, 屈延, 張立劍, 郭云萍, 陶凌, 高超 申請(qǐng)人:陶凌