專利名稱：一種ndm-1泛耐藥基因pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病病原體基因檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及一種含有NDM-I泛耐藥基因的細(xì)菌的PCR檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
2010年來(lái)國(guó)際上陸續(xù)報(bào)道在印度、巴基斯坦、英國(guó)等地發(fā)現(xiàn)產(chǎn)NDM-I (I型新德里金屬細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶)泛耐藥腸桿菌科細(xì)菌，引發(fā)社會(huì)廣泛關(guān)注。此類細(xì)菌能夠產(chǎn)生可水解β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的酶，對(duì)青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類藥物廣泛耐藥。最早報(bào)道的產(chǎn)NDM-I細(xì)菌為肺炎克雷伯菌，于2008年在一位印度裔瑞典尿路感染患者中發(fā)現(xiàn)， 對(duì)所有β -內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，對(duì)環(huán)丙沙星也不敏感，僅對(duì)粘菌素敏感，深入研究發(fā)現(xiàn)這株細(xì)菌攜帶一種新型金屬內(nèi)酰胺酶，根據(jù)患者可能感染地點(diǎn)命名這種酶為NDM-I。據(jù)上述研究結(jié)果，研究人員在印度、巴基斯坦、英國(guó)等開展了較大范圍的流行病學(xué)調(diào)查，產(chǎn)NDM-I 腸桿菌科細(xì)菌占所監(jiān)測(cè)細(xì)菌的1. 2% _13%，主要菌種為大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，其他細(xì)菌還有陰溝腸桿菌、變形桿菌、弗勞地枸櫞酸菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、摩根摩根菌、普羅威登菌等。這些細(xì)菌主要引起尿路、血流、傷口、肺部和導(dǎo)管相關(guān)感染等。在美國(guó)、加拿大、日本、韓國(guó)、澳大利亞、比利時(shí)以及我國(guó)香港、臺(tái)灣地區(qū)等都已經(jīng)有感染病例報(bào)道。根據(jù)患者感染情況及細(xì)菌本身特點(diǎn)，專家認(rèn)為產(chǎn)NDM-I細(xì)菌可能主要通過(guò)密切接觸感染。易感人群包括疾病危重、入住重癥監(jiān)護(hù)室、長(zhǎng)期使用抗菌藥物、插管、機(jī)械通氣等患者。感染后患者臨床表現(xiàn)與敏感細(xì)菌沒(méi)有差別，但對(duì)一般抗菌治療無(wú)效?，F(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題由于產(chǎn)NDM-I細(xì)菌感染臨床表現(xiàn)與敏感菌沒(méi)有差異，臨床診斷困難。對(duì)碳青霉烯治療無(wú)效的陰性菌感染需要考慮這類細(xì)菌感染可能。目前對(duì)產(chǎn)NDM-I 細(xì)菌的診斷診斷主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，檢查分為三步表型篩查-表型確認(rèn)-基因確證。并要求各醫(yī)院對(duì)陽(yáng)性結(jié)果須加以復(fù)核，同時(shí)將菌株送有條件的參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步檢測(cè)確證。我國(guó)衛(wèi)生部門高度重視，衛(wèi)生部會(huì)同總后衛(wèi)生部和國(guó)家中醫(yī)藥管理局共同組織專家制定下發(fā)了《產(chǎn)NDM-I泛耐藥腸桿菌科細(xì)菌感染診療指南(試行版)》，提出產(chǎn)NDM-I細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)室診斷包括表型篩查、表型確認(rèn)和基因確證三個(gè)步驟。(一 )表型篩查在細(xì)茵藥物敏感性測(cè)定中，以美羅培南或亞胺培南紙片法(K-B 法)或最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定法對(duì)腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)酶情況進(jìn)行初步篩查，如果達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)，需要進(jìn)行表型確認(rèn)。厄他培南特異性較低，不推薦用于篩查試驗(yàn)。1. K-B法美羅培南(10 μ g紙片)或亞胺培南(10 μ g紙片)抑菌圈直徑彡22mm。2. MIC測(cè)定法美羅培南MIC ^ 2mg/L ；或亞胺培南對(duì)大腸埃希菌、克雷伯菌屬、沙門菌屬和腸桿菌屬M(fèi)IC彡2mg/L0( 二)表型確認(rèn)雙紙片協(xié)同試驗(yàn)采用亞胺培南(10 μ g) ,EDTA (1500 μ g)兩種紙片進(jìn)行K-B法，兩紙片距離10-15mm，在含EDTA紙片方向處，亞胺培南抑菌圈擴(kuò)大，即可判定
產(chǎn)金屬酶。
采用亞胺培南(美羅培南)/EDTA復(fù)合紙片進(jìn)行K-B法藥敏試驗(yàn)，復(fù)合紙片比單藥紙片的抑菌圈直徑增大值> 5mm ；亞胺培南(美羅培南)/EDTA復(fù)合E試條協(xié)同試驗(yàn)測(cè)定 MIC,單藥與復(fù)合制劑的MIC比值彡8，即可判定產(chǎn)金屬酶。(三)基因確證采用NDM-I泛耐藥基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序，確定菌株是否攜帶NDM-I泛耐藥基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述第三步基因確認(rèn)中的采用NDM-I泛耐藥基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序這一步驟，改進(jìn)為采用熒光PCR的手段來(lái)取代傳統(tǒng)的PCR及產(chǎn)物測(cè)序。本發(fā)明的技術(shù)方案為提供一種NDM-I泛耐藥基因PCR檢測(cè)試劑盒，包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括上游引物5，-GCAGGTTGATCTCCTGCTTGAT-3，；下游引物5，-GCGTGCTGGTGGTCGATAC-3，；熒光探針5，-CAGTTGAGGATCTGGGCGGTCTGG-3，；所述探針5’端用熒光染料標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料標(biāo)記。優(yōu)選的，上述試劑盒所述熒光染料選自FAM、JOE和HEX，所述淬滅熒光染料選自 Eclipse 禾口 TAMRA0優(yōu)選的，上述試劑盒所述熒光探針5，端標(biāo)記FAM，3，端標(biāo)記TAMARA。優(yōu)選的，上述試劑盒所述上游引物的濃度為ΙΟμΜ，所述下游引物的濃度為 10 μ Μ,所述熒光探針的濃度為10 μ Μ。優(yōu)選的，上述試劑盒所述PCR反應(yīng)試劑還包括純水、10XPCR buffer,25mM MgCl2, 20mM dUTP、Taq 酶、UNG 酶，所述 dNTP 包括 dATP、dUTP、dGTP、dCTP。優(yōu)選的，上述試劑盒還包括陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品，所述陽(yáng)性質(zhì)控品為導(dǎo)入了如 SEQ ID NO. 4所述序列的質(zhì)粒。本發(fā)明的有益效果為使用本發(fā)明的試劑盒與傳統(tǒng)的診療相比免去了后續(xù)的測(cè)序步驟，使得檢測(cè)時(shí)間從傳統(tǒng)的2-3天，縮短到2-3個(gè)小時(shí)。本試劑盒的靈敏度與特異性強(qiáng)， 結(jié)果判斷客觀準(zhǔn)確，為檢測(cè)臨床樣本中的NDM-I泛耐藥基因的存在提供了有力的工具。


圖1為陽(yáng)性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線；圖2為陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。
具體實(shí)施例方式為詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式并配合附圖詳予說(shuō)明。實(shí)施例1本試劑盒組成主要組成成份如表1所示。表 權(quán)利要求
1.一種NDM-I泛耐藥基因PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括上游引物5’ -GCAGGTTGATCTCCTGCTTGAT-3，；下游引物5，-GCGTGCTGGTGGTCGATAC-3，；熒光探針5’ -CAGTTGAGGATCTGGGCGGTCTGG-3’ ；所述探針5’端用熒光染料標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的NDM-I泛耐藥基因PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述熒光染料選自FAM、JOE和HEX，所述淬滅熒光染料選自Eclipse和TAMRA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的NDM-I泛耐藥基因PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述熒光探針5’端標(biāo)記FAM，3’端標(biāo)記TAMARA。
4.按權(quán)利要求1所述的NDM-I泛耐藥基因PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述上游引物的濃度為10 μ M，所述下游引物的濃度為10 μ Μ，所述熒光探針的濃度為ΙΟμΜ。
5.按權(quán)利要求1所述的NDM-I泛耐藥基因PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)試劑還包括純水、10 XPCR buffer,25mM MgCl2,20mM dNTP、Taq 酶、UNG 酶，所述 dNTP 包括 dATP、dUTP、dGTP、dCTP。
6.按權(quán)利要求1所述的NDM-I泛耐藥基因PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，還包括陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品，所述陽(yáng)性質(zhì)控品為導(dǎo)入了如SEQ ID NO. 4所述序列的質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明試劑盒采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，針對(duì)NDM-1泛耐藥基因的保守區(qū)，設(shè)計(jì)特異性引物和熒光標(biāo)記探針，特異擴(kuò)增和檢測(cè)NDM-1泛耐藥基因片段。本發(fā)明的技術(shù)方案為提供一種NDM-1泛耐藥基因PCR檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物；如SEQ ID NO.2所示的下游引物如SEQ ID NO.3所示的熒光探針。本試劑盒的靈敏度與特異性強(qiáng)，結(jié)果判斷客觀準(zhǔn)確，為檢測(cè)臨床樣本中的NDM-1泛耐藥基因的存在提供了有力的工具。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102534014SQ20121001691
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者周曉強(qiáng), 姚銘鋒, 林希瑾, 秦偉, 胡守旺, 謝佐福 申請(qǐng)人:泰普生物科學(xué)(中國(guó))有限公司