專利名稱：一種使水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本無害攜帶弧菌噬菌體的技術的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種使水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本攜帶菌體的技術，具體為一種使水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本無害攜帶弧菌噬菌體的技術，屬于水產(chǎn)微生物領域。
背景技術：
人類醫(yī)學上，利用噬菌體及其裂解酶，特定蛋白質作為控制耐藥菌株的工具之一。 噬菌體作為抵抗病原宿主菌的有力工具在水產(chǎn)上得到應用，可以采取水體投放的方式，或者創(chuàng)口涂抹，口服，以至于浸泡等方式。在水產(chǎn)應用中，除利用水體投放有效降低宿主致病菌的濃度外，在水產(chǎn)動物體內(nèi)的預防和治療實際上主要依賴于浸泡、口服的方式，其對腸道病原菌有良好的抑制效果，但是對體內(nèi)血液的致病菌的效果變差。在動物感染病原體時，1小時內(nèi)浸泡使用噬菌體，保護率達到100%，感染時間延長，再使用噬菌體效率下降，到24小時后，保護率下降到48% (C R Merril, B Biswas, R Carlton, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 April 16; 93(8): 3188 - 3192)。在水產(chǎn)上，要在感染病原菌數(shù)小時內(nèi)及時投放噬菌體，有較大難度。因此長期保持生物體內(nèi)有足夠量的噬菌體，在預防疾病上有重要意義。噬菌體在動物體內(nèi)存活時間短，在人體體內(nèi)不超過Mh，即使在魚等低等脊椎動物體內(nèi)，一般也不超過48h。因此一直沒有有效方式，保證噬菌體及時殺滅病原宿主菌，有效保護養(yǎng)殖動物。水產(chǎn)無脊椎動物幼體培育中，密度大，水體變化也大，因此，弧菌病害嚴重；同樣， 親本培育過程時間長，相對而言，養(yǎng)殖環(huán)境不能及時更新，弧菌病害也嚴重干擾，因此制作在養(yǎng)殖期動物體內(nèi)長期存活的噬菌體將有利于長期防御宿主菌，也有利于長期保持水體中相當量的噬菌體濃度。這種體內(nèi)長期存活的噬菌體對于具有特定抗體體液免疫的脊椎動物，將會引發(fā)免疫反應，影響動物生長和生存能力，但是對于特異性免疫反應不同的無脊椎動物，沒有致病能力的噬菌體大多數(shù)情況下不會嚴重影響道該無脊椎動物生長和生存能力。C R Merril 等人在其發(fā)表的文章(C R Merril, B Biswas, R Carlton, N C Jensen, G J Creed, S Zullo, and S Adhya. Long-circulating bacteriophage as antibacterial agents. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 April 16; 93(8) : 3188 -3192.)中，為防治多重細菌病原耐藥性研究了長循環(huán)噬菌體，其中，對大腸桿菌coli和傷寒沙門氏菌噬菌體，他們利用一種連續(xù)通道(serial-passage)技術在鼠體內(nèi)選擇能夠在長周期內(nèi)保留于循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的噬菌體變異體，其研究表明在25h時，與對照組比較，血液中噬菌體保留濃度高4-5個數(shù)量級。1998年Adhya，Sankar L. Carlton, Richard Μ.， Merril, Carl R.申報美國專利(U. S，Patent，5811093) “Bacteriophage genotypically modified to delay inactivations by the host defense system，，,對這類大腸桿菌coli 和傷寒沙門氏菌噬菌體在細菌浸染的宿主防御系統(tǒng)失活(減少數(shù)量，減低裂解活性)的非遺傳工程技術的連續(xù)通道(serial-passage)技術申報專利。2005年Christal L. Vitiello, Carl R. Merril, Sankar Adhya ( Virus Research, 114 (2005) 101 _ 103)發(fā)文認為是該噬菌體突變導致衣殼蛋白的一個氨基酸變化引起其在血液中循環(huán)周期的變化，λ噬菌體浸泡鼠后Mh，比一般多13，000 - 16，000倍保留于血液中，Capparelli等人在2007年用 Sia/^j^ococciAs atfreiAs 的噬菌體觀察到相似的結果(Ant. Agents. Chem. 51 (8): 2007,2765-2773)o 2009 ^Ξ Joas L. Da Silva; Rosario D. C. Hirata; Mario H. Hirata 等(Braz. J. Microbiol. 40 (3) :1517_8382，2009)再一次認為這種技術對目前狀況特別是醫(yī)院感染是適用的。利用噬菌體抑制水產(chǎn)動物宿主病原菌，已經(jīng)有多個專利。專利200710078116. 7利用多種噬菌體處理凈化環(huán)境病原菌，其中包括霍亂弧菌，副溶血弧菌；專利200910038392. X分離副溶血弧菌噬菌體并用以殺菌，用于水體環(huán)境，包括養(yǎng)殖環(huán)境；專利申請?zhí)?201110050243. 2分離哈維氏弧菌，利用分離得到的病原菌進行噬菌體的分離，防治刺參腐
皮綜合癥。上述研究和發(fā)明專利，在脊椎動物中長循環(huán)噬菌體強化了保護效果和延長了時間，但是對于水產(chǎn)動物而言，并不適用。以浸泡噬菌體方法，不適合于規(guī)?；B(yǎng)殖的水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)；噬菌體在體內(nèi)存活的時間還是不能滿足要求，水產(chǎn)動物(如對蝦)要求數(shù)十日，以至于終生(如貝類)保持在體內(nèi)保持噬菌體，并一直保持對宿主菌的裂解活性，這種類似于“活體疫苗”的噬菌體，將可以有效控制細菌性疾病。但是這有必要的條件需要滿足，即噬菌體對養(yǎng)殖動物無害或低害，不影響生長，養(yǎng)殖動物對該噬菌體低水平免疫反應，噬菌體在體內(nèi)可以保持對宿主菌的裂解性。本發(fā)明涉及的弧菌噬菌體產(chǎn)生很低毒素水平，無脊椎動物沒有以抗體為基礎的特異性免疫反應，奠定了本發(fā)明的基礎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種使水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本無害攜帶弧菌噬菌體的技術，采用該技術可得到無毒無害的噬菌體，且所得到噬菌體在水產(chǎn)無脊椎動物體內(nèi)可長時間保持對宿主裂解活力，同時還可以滿足水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本的生產(chǎn)需要。為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術方案是一種使水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本無害攜帶弧菌噬菌體的技術，包括如下具體步驟
(1)從養(yǎng)殖水體按常規(guī)分離弧菌屬菌株及其噬菌體，得到噬菌體裂解液；
(2)將步驟(1)獲得的噬菌體裂解液經(jīng)離心回收，0.22Mffl濾膜過濾后，用雙平板法測效價，得到濃度為1.5 X IO11 8. 5 X IOltlPfVml的噬菌體液，于4°C保存，作為保存液，備用；
(3)將步驟(2)獲得的保存液以蛋白胨水稀釋，以雙平板法計數(shù)，得到濃度為 0.8 X IO9 1. 5 X IO9 pfu/mL的噬菌體液，作為浸泡使用液；
(4)第一次浸泡將步驟(3)獲得的浸泡使用液投放于養(yǎng)殖海水中，使浸泡使用液終濃度為IXlO6 IXlO7 pfu/ml，然后向養(yǎng)殖海水中加入水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本，浸泡 0. 5 2h，為第一次浸泡；
(5)第二次浸泡第一次浸泡后第7天時，采集培養(yǎng)樣本，用雙平板法涂布平板，裂解宿主菌株，選取噬菌斑，分離噬菌體，利用該噬菌斑制作與第一次浸泡的浸泡使用液同等濃度的噬菌體使用液，并在養(yǎng)殖海水中投放與噬菌體使用液同樣濃度的本步驟制作得到的噬菌體，用另一組水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本作第二次浸泡，浸泡0. 5^2h ；
(6)以與第二次浸泡同樣的方式進行連續(xù)多次浸泡，并進行噬菌體的培養(yǎng)選擇，但從第二次浸泡開始，將采集培養(yǎng)樣本時間逐步延長，每一次延長5 7天，經(jīng)過4 12代反復， 延長到27 60天后，停止浸泡；
(7)經(jīng)噬菌體的培養(yǎng)選擇后，所選擇的噬菌體以水體終濃度4XKfpfu/mL的浸泡方式， 進入水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本體內(nèi)，在連續(xù)多次浸泡后，經(jīng)浸泡的水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本體內(nèi)得到長期存活的噬菌體，取出浸泡后的水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本清洗后投入潔凈海水中正常養(yǎng)殖。所述培養(yǎng)樣本的采集方法是從水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本取血淋巴或采集水產(chǎn)無脊椎動物幼體養(yǎng)育成的幼苗，將幼苗清洗、勻漿和離心后取上清液，獲得勻漿液。所述噬菌體的培養(yǎng)選擇方法如下
(1)采集培養(yǎng)樣本，用雙平板法涂布平板，裂解宿主菌株，選取噬菌斑后，由噬菌斑分離的噬菌體株不能在水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本血淋巴中生存達到27天的，棄之不用；
(2)采集培養(yǎng)樣本，將采集得到的無菌的勻漿液作為培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)宿主弧菌3次，然后于TCBS培養(yǎng)基接種劃線培養(yǎng)挑出單菌落，使宿主弧菌培養(yǎng)復壯；在每一次浸泡后，采集培養(yǎng)樣本，分離、純化噬菌體，以雙平板法測定噬菌斑的噬菌體對復壯后的宿主菌的裂解能力，其中保持80% 85%裂解活性的噬菌體繼續(xù)使用，低于80% 85%裂解活性的噬菌體棄之不用；
(3)在每一次浸泡和上一次浸泡比較，噬菌體在水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本血淋巴中的存活數(shù)量增加10% 15%以上，則該噬菌體用于繼續(xù)選擇，否則，該噬菌體不能用于繼續(xù)選擇；
(4)每一次浸泡后，測定已浸泡噬菌體的水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本的超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、一氧化氮活酶，測定得到所有指標變化幅度和未浸泡噬菌體的水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本基本一致，沒有統(tǒng)計學上顯著差異時，該噬菌體用于繼續(xù)選擇，否則，該噬菌體不能用于繼續(xù)選擇；
(5)經(jīng)過權利要求3中的(1) (4)選擇得到最終噬菌體，以該最終噬菌體以水體終濃度為IXlO6 pfu/ ml，浸泡水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本，每間隔15天重復浸泡一次，養(yǎng)殖水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本30 60天，測定其生長速度，其生長速度和未浸泡噬菌體的正常水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本基本一致，沒有統(tǒng)計學上顯著差異的則該最終噬菌體可以用于浸泡，否則，該最終噬菌體不能用于浸泡；
(6)經(jīng)選擇得到的最終噬菌體在用于浸泡過程中，每15天從已投放該最終噬菌體的養(yǎng)殖水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本體內(nèi)抽取血淋巴，用雙平板法在宿主弧菌生長平板得到噬菌斑，重新分離噬菌體，并以雙平板法測定每個噬菌斑的噬菌體裂解能力，其中保持85%裂解活性的該最終噬菌體繼續(xù)使用，低于85%裂解活性的該最終噬菌體棄之不用；則此保持85% 裂解活性的最終噬菌體即為所選擇的噬菌體。所述弧菌噬菌體是指弧菌屬弧菌及其噬菌體。所述水產(chǎn)無脊椎動物為對蝦、東風螺、牡蠣、雜色鮑、扇貝、貽貝、海參中的一種。所述水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本在用于浸泡和投放前經(jīng)檢測不含有使用的弧菌菌株及噬菌體。
所述的使水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本無害攜帶弧菌噬菌體的技術也適用于對蝦養(yǎng)殖場或東風螺、雜色鮑、東風螺工廠化養(yǎng)殖場或牡蠣、扇貝、貽貝、海參養(yǎng)殖場的無脊椎動物幼體與親本無害攜帶多價噬菌體。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術的有益效果是本發(fā)明的使水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本無害攜帶弧菌噬菌體的技術是利用無脊椎動物沒有特異抗體反應的特性，用噬菌體浸泡水產(chǎn)無脊椎動物，浸泡后，從水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本采集培養(yǎng)樣本，再將噬菌體從水產(chǎn)無脊椎動物體內(nèi)分離，再浸泡，反復多次進行連續(xù)浸泡，同時對噬菌體進行培養(yǎng)選擇，最后得到在水產(chǎn)無脊椎動物體內(nèi)長期存活的噬菌體。采用本發(fā)明技術所得到的噬菌體無毒無害，在水產(chǎn)無脊椎動物體內(nèi)可長時間保持對宿主裂解活力，同時還可以滿足水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本的生產(chǎn)需要，為防治水產(chǎn)無脊椎動物弧菌病提供了新的技術。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。實施例1以凡納濱對蝦產(chǎn)卵后剛孵化的幼體(以下簡稱“對蝦幼體”)為例，按下列步驟實施本發(fā)明技術。1、從養(yǎng)殖水體按常規(guī)分離弧菌屬菌株及其噬菌體，得到噬菌體裂解液。2、將步驟1獲得的噬菌體裂解液經(jīng)離心回收，0. 22ΜΠ1濾膜過濾后，用雙平板法測效價，得到濃度為ι. IX IO11PfuAil的噬菌體液，于4°C保存，作為保存液，備用；具體方法 從單個菌落培養(yǎng)的生長對數(shù)期菌液中加入新鮮制備來自噬菌體單斑的噬菌體原液，放入搖床劇烈振搖后得到的裂解液，離心除去細菌碎片，加入胰DNAI酶與胰RNA酶除去細菌核酸。 加入lmol/L氯化鈉至和10%W/V聚乙二醇(PEG6000)，冰浴中使噬菌體顆粒沉淀。離心回收沉淀的噬菌體顆粒，并將噬菌體重懸于PBS中，加入等體積的氯仿，去除噬菌體懸液中的聚乙二醇，離心后回收水相，用滅菌的0. 22ΜΠ1濾膜過濾，用雙平板測效價，于4°C保存?zhèn)溆谩?、將步驟2獲得的保存液以蛋白胨水稀釋，以雙平板法計數(shù)，得到濃度為0.8X IO9 pfu/mL的噬菌體液，作為浸泡使用液。4、第一次浸泡將步驟3獲得的浸泡使用液投放于養(yǎng)殖海水中，使浸泡使用液終濃度為IX IOfiPfuAil，然后向養(yǎng)殖海水中加入對蝦幼體，浸泡0. 5h，為第一次浸泡。5、第二次浸泡第一次浸泡后第7天時，采集培養(yǎng)樣本，用雙平板法涂布平板，裂解宿主菌株，選取噬菌斑，分離噬菌體，利用該噬菌斑制作與第一次浸泡的浸泡使用液同等濃度的噬菌體使用液，并在養(yǎng)殖海水中投放與噬菌體使用液同樣濃度的本步驟制作得到的噬菌體，用另一組對蝦幼體作第二次浸泡，浸泡0.證。6、以與第二次浸泡同樣的方式進行連續(xù)多次浸泡，并進行噬菌體的培養(yǎng)選擇，但從第二次浸泡開始，將采集培養(yǎng)樣本時間逐步延長，每一次延長5天，經(jīng)過4代反復，延長到 27天后，停止浸泡。其中，培養(yǎng)樣本的采集方法和噬菌體的培養(yǎng)選擇方法如下
(1)培養(yǎng)樣本的采集采集對蝦幼體養(yǎng)育成的仔蝦，清洗得到的勻漿經(jīng)離心后取上清液，獲得勻漿液；
(2)噬菌體的培養(yǎng)選擇方法
①采集培養(yǎng)樣本，用雙平板法涂布平板，裂解宿主菌株，選取噬菌斑后，由噬菌斑分離的噬菌體株不能在對蝦幼體中生存達到27天的，棄之不用；
②采集培養(yǎng)樣本，將采集得到的無菌的勻漿液作為培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)宿主弧菌3次，然后于TCBS培養(yǎng)基接種劃線培養(yǎng)挑出單菌落，使宿主弧菌培養(yǎng)復壯；在每一次浸泡后，采集培養(yǎng)樣本，分離、純化噬菌體，以雙平板法測定噬菌斑的噬菌體對復壯后的宿主菌的裂解能力，其中保持80% 85%裂解活性的噬菌體繼續(xù)使用，低于80% 85%裂解活性的噬菌體棄之不用；
③在每一次浸泡和上一次浸泡比較，噬菌體在對蝦幼體中的存活數(shù)量增加15%以上， 則該噬菌體用于繼續(xù)選擇，否則，該噬菌體不能用于繼續(xù)選擇；
④每一次浸泡后，測定對蝦幼體樣本的超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、一氧化氮活酶， 測定得到所有指標變化幅度和未浸泡噬菌體的正常對蝦幼體基本一致，沒有統(tǒng)計學上顯著差異時，該噬菌體用于繼續(xù)選擇，否則，該噬菌體不能用于繼續(xù)選擇；
⑤經(jīng)過上述① ④選擇得到最終噬菌體，以該最終噬菌體以水體終濃度為1X IO6 pfu/ ml，浸泡對蝦幼體，每間隔15天重復浸泡一次，養(yǎng)殖對蝦幼體30天，測定其生長速度，其生長速度和未浸泡噬菌體的對蝦幼體基本一致，沒有統(tǒng)計學上顯著差異的則該最終噬菌體可以用于浸泡；
⑥經(jīng)選擇得到的最終噬菌體在用于浸泡過程中，每15天從已投放該最終噬菌體的養(yǎng)殖對蝦幼體體內(nèi)抽取血淋巴，用雙平板法在宿主弧菌生長平板得到噬菌斑，重新分離噬菌體，并以雙平板法測定每個噬菌斑的噬菌體裂解能力，其中保持85%裂解活性的該最終噬菌體繼續(xù)使用，低于85%裂解活性的該最終噬菌體棄之不用；則此保持85%裂解活性的最終噬菌體即為所選擇的噬菌體。7、經(jīng)上述噬菌體的培養(yǎng)選擇后，所選擇的噬菌體以水體終濃度4X Kfpfu/mL的浸泡方式，進入對蝦幼體體內(nèi)，在連續(xù)多次浸泡后，經(jīng)浸泡的對蝦幼體體內(nèi)得到長期存活的噬菌體，取出浸泡后的對蝦幼體清洗后投入潔凈海水中正常養(yǎng)殖。實施例2以體長為16 18cm的凡納濱對蝦親本(以下簡稱“對蝦親本”)為例，按下列步驟實施本發(fā)明技術。1、從養(yǎng)殖水體按常規(guī)分離弧菌屬菌株及其噬菌體，得到噬菌體裂解液。2、將步驟1獲得的噬菌體裂解液經(jīng)離心回收，0. 22ΜΠ1濾膜過濾后，用雙平板法測效價，得到濃度為SAXliTpfu/ml的噬菌體液，于4°C保存，作為保存液，備用；具體方法 從單個菌落培養(yǎng)的生長對數(shù)期菌液中加入新鮮制備來自噬菌體單斑的噬菌體原液，放入搖床劇烈振搖后得到的裂解液，離心除去細菌碎片，加入胰DNAI酶與胰RNA酶除去細菌核酸。 加入lmol/L氯化鈉至和10%W/V聚乙二醇(PEG6000)，冰浴中使噬菌體顆粒沉淀。離心回收沉淀的噬菌體顆粒，并將噬菌體重懸于PBS中，加入等體積的氯仿，去除噬菌體懸液中的聚乙二醇，離心后回收水相，用滅菌的0. 22ΜΠ1濾膜過濾，用雙平板測效價，于4°C保存?zhèn)溆谩?、將步驟2獲得的保存液以蛋白胨水稀釋，以雙平板法計數(shù)，得到濃度為1. 5X IO9 pfu/mL的噬菌體液，作為浸泡使用液。4、第一次浸泡將步驟3獲得的浸泡使用液投放于養(yǎng)殖海水中，使浸泡使用液終濃度為IXlO7 Pfu/ml，然后向養(yǎng)殖海水中加入對蝦親本，浸泡池，為第一次浸泡。5、第二次浸泡第一次浸泡后第7天時，采集培養(yǎng)樣本，用雙平板法涂布平板，裂解宿主菌株，選取噬菌斑，分離噬菌體，利用該噬菌斑制作與第一次浸泡的浸泡使用液同等濃度的噬菌體使用液，并在養(yǎng)殖海水中投放與噬菌體使用液同樣濃度的本步驟制作得到的噬菌體，用另一組對蝦親本作第二次浸泡，浸泡池。6、以與第二次浸泡同樣的方式進行連續(xù)多次浸泡，并進行噬菌體的培養(yǎng)選擇，但從第二次浸泡開始，將采集培養(yǎng)樣本時間逐步延長，每一次延長5天，經(jīng)過12代反復，延長到60天后，停止浸泡。其中，培養(yǎng)樣本的采集方法和噬菌體的培養(yǎng)選擇方法如下
(1)培養(yǎng)樣本的采集從對蝦親本圍心竇取血淋巴，清洗得到的勻漿經(jīng)離心后取上清液，獲得勻漿液；
(2)噬菌體的培養(yǎng)選擇方法
①采集培養(yǎng)樣本，用雙平板法涂布平板，裂解宿主菌株，選取噬菌斑后，由噬菌斑分離的噬菌體株不能在對蝦親本血淋巴中生存達到27天的，棄之不用；
②采集培養(yǎng)樣本，將采集得到的無菌的勻漿液作為培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)宿主弧菌3次，然后于TCBS培養(yǎng)基接種劃線培養(yǎng)挑出單菌落，使宿主弧菌培養(yǎng)復壯；在每一次浸泡后，采集培養(yǎng)樣本，分離、純化噬菌體，以雙平板法測定噬菌斑的噬菌體對復壯后的宿主菌的裂解能力，其中保持80%裂解活性的噬菌體繼續(xù)使用，低于80%裂解活性的噬菌體棄之不用；
③在每一次浸泡和上一次浸泡比較，噬菌體在對蝦親本血淋巴中的存活數(shù)量增加10% 以上，則該噬菌體用于繼續(xù)選擇，否則，該噬菌體不能用于繼續(xù)選擇；
④每一次浸泡后，測定對蝦親本樣本的超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、一氧化氮活酶， 測定得到所有指標變化幅度和未浸泡噬菌體的對蝦親本基本一致，沒有統(tǒng)計學上顯著差異時，該噬菌體用于繼續(xù)選擇，否則，該噬菌體不能用于繼續(xù)選擇；
⑤經(jīng)過上述① ④選擇得到最終噬菌體，以該最終噬菌體以水體終濃度為1X IO6 pfu/ ml，浸泡對蝦親本，每間隔15天重復浸泡一次，養(yǎng)殖對蝦親本60天，測定其生長速度，其生長速度和未浸泡噬菌體的正常對蝦親本基本一致，沒有統(tǒng)計學上顯著差異的則該最終噬菌體可以用于浸泡；
⑥經(jīng)選擇得到的最終噬菌體在用于浸泡過程中，每15天從已投放該最終噬菌體的養(yǎng)殖對蝦親本體內(nèi)抽取血淋巴，用雙平板法在宿主弧菌生長平板得到噬菌斑，重新分離噬菌體，并以雙平板法測定每個噬菌斑的噬菌體裂解能力，其中保持85%裂解活性的該最終噬菌體繼續(xù)使用，低于85%裂解活性的該最終噬菌體棄之不用；則此保持85%裂解活性的最終噬菌體即為所選擇的噬菌體。7、經(jīng)上述噬菌體的培養(yǎng)選擇后，所選擇的噬菌體以水體終濃度4X Kfpfu/mL的浸泡方式，進入對蝦親本體內(nèi)，在連續(xù)多次浸泡后，經(jīng)浸泡的對蝦親本體內(nèi)得到長期存活的噬菌體，取出浸泡后的對蝦親本清洗后投入潔凈海水中正常養(yǎng)殖。實施例3從湛江東海島當?shù)仞B(yǎng)殖場得到副溶血弧菌及其噬菌體。在潔凈海水中加入終濃度均為4X Kfpfu/mL的選擇的副溶血弧菌噬菌體，將剛孵化的凡納濱對蝦幼體在其中浸泡1. 0h，按照常規(guī)育苗方式繼續(xù)培育20天，仔蝦體內(nèi)未見宿主菌，成活率65%，在對照組仔蝦體內(nèi)宿主菌高達4X 104cfu/mL，成活率5%。實施例4從湛江東海島東風螺工廠化養(yǎng)殖場得到溶藻弧菌及其噬菌體。按照本發(fā)明技術，每隔20天一次，反復多次浸泡東風螺親本，每次浸泡1.5h，檢測表明，東風螺親本體內(nèi)噬菌體4X IO6 4Xl(fpfu/mL，東風螺體內(nèi)宿主弧菌0 5 X 10cfu/mL，海水水體 1.0X102 1. 1 X 103cfu/mL,東風螺生長存活正常，對照組海水水體1. 3X 106cfu/mL，體內(nèi)宿主弧菌5 X IO4 1. 5X 108cfu/mL，有弧菌病癥狀和少量死亡。
權利要求
1.一種使水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本無害攜帶弧菌噬菌體的技術，其特征在于該技術包括如下具體步驟(1)從養(yǎng)殖水體按常規(guī)分離弧菌屬菌株及其噬菌體，得到噬菌體裂解液；(2)將步驟(1)獲得的噬菌體裂解液經(jīng)離心回收，0.22Mffl濾膜過濾后，用雙平板法測效價，得到濃度為1.5 X IO11 8. 5 X IOltlPfVml的噬菌體液，于4°C保存，作為保存液，備用；(3)將步驟(2)獲得的保存液以蛋白胨水稀釋，以雙平板法計數(shù)，得到濃度為 0.8 X IO9 1. 5 X IO9 pfu/mL的噬菌體液，作為浸泡使用液；(4)第一次浸泡將步驟(3)獲得的浸泡使用液投放于養(yǎng)殖海水中，使浸泡使用液終濃度為IXlO6 IXlO7 pfu/ml，然后向養(yǎng)殖海水中加入水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本，浸泡 0. 5 2h，為第一次浸泡；(5)第二次浸泡第一次浸泡后第7天時，采集培養(yǎng)樣本，用雙平板法涂布平板，裂解宿主菌株，選取噬菌斑，分離噬菌體，利用該噬菌斑制作與第一次浸泡的浸泡使用液同等濃度的噬菌體使用液，并在養(yǎng)殖海水中投放與噬菌體使用液同樣濃度的本步驟制作得到的噬菌體，用另一組水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本作第二次浸泡，浸泡0. 5^2h ；(6)以與第二次浸泡同樣的方式進行連續(xù)多次浸泡，并進行噬菌體的培養(yǎng)選擇，但從第二次浸泡開始，將采集培養(yǎng)樣本時間逐步延長，每一次延長5 7天，經(jīng)過4 12代反復， 延長到27 60天后，停止浸泡；(7)經(jīng)噬菌體的培養(yǎng)選擇后，所選擇的噬菌體以水體終濃度4XKfpfu/mL的浸泡方式， 進入水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本體內(nèi)，在連續(xù)多次浸泡后，經(jīng)浸泡的水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本體內(nèi)得到長期存活的噬菌體，取出浸泡后的水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本清洗后投入潔凈海水中正常養(yǎng)殖。
2.根據(jù)權利要求1所述一種使水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本無害攜帶弧菌噬菌體的技術，其特征在于所述培養(yǎng)樣本的采集方法是從水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本取血淋巴或采集水產(chǎn)無脊椎動物幼體養(yǎng)育成的幼苗，將幼苗清洗、勻漿和離心后取上清液，獲得勻漿液。
3.根據(jù)權利要求1所述一種使水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本無害攜帶弧菌噬菌體的技術，其特征在于所述噬菌體的培養(yǎng)選擇方法如下(1)采集培養(yǎng)樣本，用雙平板法涂布平板，裂解宿主菌株，選取噬菌斑后，由噬菌斑分離的噬菌體株不能在水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本血淋巴中生存達到27天的，棄之不用；(2)采集培養(yǎng)樣本，將采集得到的無菌的勻漿液作為培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)宿主弧菌3次，然后于TCBS培養(yǎng)基接種劃線培養(yǎng)挑出單菌落，使宿主弧菌培養(yǎng)復壯；在每一次浸泡后，采集培養(yǎng)樣本，分離、純化噬菌體，以雙平板法測定噬菌斑的噬菌體對復壯后的宿主菌的裂解能力，其中保持80% 85%裂解活性的噬菌體繼續(xù)使用，低于80% 85%裂解活性的噬菌體棄之不用；(3)在每一次浸泡和上一次浸泡比較，噬菌體在水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本血淋巴中的存活數(shù)量增加10% 15%以上，則該噬菌體用于繼續(xù)選擇，否則，該噬菌體不能用于繼續(xù)選擇；(4)每一次浸泡后，測定已浸泡噬菌體的水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本的超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、一氧化氮活酶，測定得到所有指標變化幅度和未浸泡噬菌體的水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本基本一致，沒有統(tǒng)計學上顯著差異時，該噬菌體用于繼續(xù)選擇，否則，該噬菌體不能用于繼續(xù)選擇；(5)經(jīng)過權利要求3中的(1) (4)選擇得到最終噬菌體，以該最終噬菌體以水體終濃度為IXlO6Pfu/ ml，浸泡水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本，每間隔15天重復浸泡一次，養(yǎng)殖水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本30 60天，測定其生長速度，其生長速度和未浸泡噬菌體的正常水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本基本一致，沒有統(tǒng)計學上顯著差異的則該最終噬菌體可以用于浸泡，否則，該最終噬菌體不能用于浸泡；(6)經(jīng)選擇得到的最終噬菌體在用于浸泡過程中，每15天從已投放該最終噬菌體的養(yǎng)殖水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本體內(nèi)抽取血淋巴，用雙平板法在宿主弧菌生長平板得到噬菌斑，重新分離噬菌體，并以雙平板法測定每個噬菌斑的噬菌體裂解能力，其中保持85%裂解活性的該最終噬菌體繼續(xù)使用，低于85%裂解活性的該最終噬菌體棄之不用；則此保持85% 裂解活性的最終噬菌體即為所選擇的噬菌體。
4.根據(jù)權利要求1所述一種使水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本無害攜帶弧菌噬菌體的技術，其特征在于所述弧菌噬菌體是指弧菌屬弧菌及其噬菌體。
5.根據(jù)權利要求1所述一種使水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本無害攜帶弧菌噬菌體的技術，其特征在于所述水產(chǎn)無脊椎動物為對蝦、東風螺、牡蠣、雜色鮑、扇貝、貽貝、海參中的一種。
6.根據(jù)權利要求1所述一種使水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本無害攜帶弧菌噬菌體的技術，其特征在于所述水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本在用于浸泡和投放前經(jīng)檢測不含有使用的弧菌菌株及噬菌體。
7.根據(jù)權利要求1所述一種使水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本無害攜帶弧菌噬菌體的技術，其特征在于所述的使水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本無害攜帶弧菌噬菌體的技術也適用于對蝦養(yǎng)殖場或東風螺、雜色鮑、東風螺工廠化養(yǎng)殖場或牡蠣、扇貝、貽貝、海參養(yǎng)殖場的無脊椎動物幼體與親本無害攜帶多價噬菌體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種使水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本無害攜帶弧菌噬菌體的技術。本發(fā)明的使水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本無害攜帶弧菌噬菌體的技術是利用無脊椎動物沒有特異抗體反應的特性，用噬菌體浸泡水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本，浸泡后，從水產(chǎn)無脊椎動物幼體或親本采集培養(yǎng)樣本，再將噬菌體從水產(chǎn)無脊椎動物體內(nèi)分離，再浸泡，反復多次進行連續(xù)浸泡，同時對噬菌體進行培養(yǎng)選擇，最后得到在水產(chǎn)無脊椎動物體內(nèi)長期存活的噬菌體。采用本發(fā)明技術所得到的噬菌體無毒無害，在水產(chǎn)無脊椎動物體內(nèi)可長時間保持對宿主菌裂解活力，同時還可以滿足水產(chǎn)無脊椎動物幼體與親本的生產(chǎn)需要，為防治水產(chǎn)無脊椎動物弧菌病提供了新的技術。
文檔編號C12N7/00GK102550458SQ20121001738
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月19日 優(yōu)先權日2012年1月19日
發(fā)明者楊世平, 王成桂, 申玉春, 邱德全, 邱明生 申請人:廣東海洋大學