專利名稱：利用SLμCUT系統(tǒng)切割小麥染色體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用SLy CUT系統(tǒng)切割小麥染色體技術(shù)體系的建立,屬于分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
染色體微切害I]、微分離與微克隆(chromosome micro-dissection andmicro-cloning)技術(shù)是由 Scalenghe 等(Scalenghe F. , E.Turco, J. E. Edstrom, etal. Microdissection and cloning of DNA from a specific region of Drosophilamelanogaster polytene chromosome [J] · Chromosoma，1981，82 :205-216)創(chuàng)立的一項(xiàng)分子細(xì)胞遺傳學(xué)新技術(shù)。該技術(shù)首先對果蠅染色體進(jìn)行了切割，成功獲得了 80個(gè)克隆，隨后用于鼠和人類(Rohme Dan, Howard Fox, Bernhard Herrmann, et al. Molecular clone sof the mouse complex derived from microdissected metaphase chromosomes[J].Cell, 1984，36 :783-788.)。隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，微切割和微克隆技術(shù)得到了較大發(fā)展(Ludecke HJ,Gabriele Senger,Use Claussen,et al. Cloning defined regions of humangenome by microdissection of banded chromosomes and enzymatic amplification[J].Nature, 1989, 338 :348-350)。自 Sandery 等(Sandery M J, et al. Isolation of sequencecommon to A and B chromosomes of rye(Secale cereal L. )by micro cloning[J]. PlantMolecular Biology Reporter, 1991,9 (I) :21-30)利用染色體微切割和微克隆技術(shù)獲得了黑麥DNA克隆以來，該技術(shù)在植物染色體文庫的構(gòu)建、特異探針篩選、抗性基因的克隆以及遺傳與進(jìn)化研究上得到了較為廣泛應(yīng)用，但是，相比較而言，植物在這方面開展的研究仍然滯后于動(dòng)物和人類。目前，植物染色體顯微切割技術(shù)主要存在以下幾個(gè)方面的困難(I)植物細(xì)胞壁的存在、同步化的困難，阻礙了良好分散染色體標(biāo)本的制備，而染色體標(biāo)本的制備是影響染色體切割最基礎(chǔ)的技術(shù)之一；背景不干凈，影響了切割效率。(2)植物基因組倍性多樣，染色體結(jié)構(gòu)變異大，基因排列順序不夠保守；植物染色體DNA含量高、蛋白質(zhì)含量低，絕大多數(shù)染色體不能象脊椎動(dòng)物染色體顯示G、R或Q帶帶紋而不影響DNA序列(Fukui k. ,M. Minezawa, Y. Kamisugi, et al. Microdissection of plantchromosome by argon-ion laser beam[J]. Theor Appl Genet. , 1992,84 :787-791);通行的C帶,對染色體DNA破壞太大,不利于構(gòu)建完整的DNA文庫；而有些植物染色體不僅小,而且大小差異不明顯，帶紋相似，難于精確識別染色體及其細(xì)微結(jié)構(gòu)，所有這些都加大了分析的復(fù)雜性。(3)植物染色體DNA高度重復(fù)序列多，如小麥、大麥、黑麥和燕麥核基因組有約80%的重復(fù)序列(Albani Diego, Marie-Jose Cote, Ken C, et al. PCR amplification ofmicrodissected wheat chromosome arms in a “single tube，，reaction[J]· Plant J,1993，4 =899-903)。麥類作物DNA含量高，如六倍體燕麥(2n = 6x = 42) DNA含量為13. 2 14. 3pg,約 I. 3 I. 4X IO1Vo 小麥 C 值為 I. 7X109bp,平均每條染色體 O. 8X109bp,相當(dāng)于人類基因組的四分之一(Wang ML, Andrew R. Leitch, Trude Schwarzacher, etal.Construction of a chromosome-enriched HpaII library from flow-sorted wheatchromosomes [J]. Nucl Acids Res，1992，20 :1897-1901)。若每個(gè)插入片段為 lkb，每條染色體特異性DNA文庫包含8X IO5以上克隆，篩庫工作量巨大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用SLy CUT系統(tǒng)切割小麥染色體的方法，以實(shí)現(xiàn)對小麥根尖染色體進(jìn)行顯微切割。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了一種利用SL μ CUT系統(tǒng)切割小麥染色體的方法，以普通小麥(煙農(nóng)15與中國春)、小偃麥異代換系山農(nóng)0095、中間偃麥草根尖細(xì)胞為材料，在利用SLy CUT系統(tǒng)對小麥根尖細(xì)胞染色體初步切割的基礎(chǔ)上，成功地對小麥根尖染色體進(jìn)行了顯微切割。具體包括以下步驟 (I)染色體標(biāo)本制備首先要挑選小麥根尖染色體為制備染色體標(biāo)本的材料，制備的染色體標(biāo)本要求染色體盡量散開，顯帶后帶紋清晰，易于識別；在制片過程中減少酸堿處理的時(shí)間，以防DNA受損；將目標(biāo)染色體轉(zhuǎn)移到膜上；(2)目標(biāo)染色體的識別染色體標(biāo)本制好之后，對目標(biāo)染色體進(jìn)行識別，識別方法可以采用分帶、核型分析、原位雜交等方法；(3)染色體(片斷)顯微切割和分離借助于SLy CELLCUT (Molecular machine industry, MMI)切割系統(tǒng)及系統(tǒng)軟件直接對目標(biāo)染色體進(jìn)行可視化切割，然后運(yùn)用帶有黏性的Eppendorf管的管蓋對目標(biāo)染色體回收，進(jìn)而進(jìn)行下游工作。還包括以下步驟染色體經(jīng)過顯微切割和分離后進(jìn)行微克隆庫的建立分離到的染色體必須經(jīng)過體外擴(kuò)增，才能進(jìn)行下一步的的研究工作。顯微切割染色體微克隆文庫的建立主要包括酶切直接克隆和以PCR為介導(dǎo)克隆技術(shù)兩種。I)酶切直接克隆法首先將分離出的多個(gè)同一目標(biāo)染色體片段抽提去蛋白質(zhì)及DNA純化、酶切，然后加入同一限制性內(nèi)切酶切割的載體及連接酶，連接后再轉(zhuǎn)化一定的宿主菌，以建立染色體DNA文庫。本發(fā)明采用適于對目標(biāo)染色體進(jìn)行酶切。2) PCR介導(dǎo)的微克隆技術(shù)目標(biāo)染色體經(jīng)顯微切割、分離得到的染色體數(shù)量有限，往往通過PCR擴(kuò)增以得到更多的產(chǎn)物以用于后續(xù)研究。常用的PCR方法主要有以下兩種兼并引物PCR(Degenerate Oligonucleotid Primed-PCR，D0P-PCR，)，D0P-PCR 即用一個(gè)簡單的簡并引物，經(jīng)兩次PCR反應(yīng)來擴(kuò)增(第一次復(fù)性溫度低)。利用DOP-PCR技術(shù)擴(kuò)增顯微切割的染色體DNA，無需進(jìn)行染色體DNA的限制性酶切、設(shè)計(jì)連接接頭等步驟，直接以染色體DNA為模板，具有快速、高效的特點(diǎn)。DOP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物既有高度重復(fù)序列，也有低拷貝序列。本發(fā)明采用DOP-PCR對目標(biāo)染色體進(jìn)行擴(kuò)增。
連接體-結(jié)合體介導(dǎo)的PCR(Linker-adaptor_PCR，LA-PCR)，LA-PCR即將分離的染色體DNA用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，根據(jù)酶切后產(chǎn)生的粘性末端的堿基序列，分別設(shè)計(jì)一個(gè)連接體(linker)和一個(gè)結(jié)合體(adaptor),并使linker與adaptor混合后產(chǎn)生與某一內(nèi)切酶同樣的粘性末端。由于粘性末端不受限制，當(dāng)酶切后的染色體DNA與連接體-結(jié)合體混合后，可大大提高連接效率。再用其中的連接體作PCR擴(kuò)增的引物，由于每個(gè)酶切產(chǎn)物都連接一個(gè)已知的連接體(引物)，這樣就可擴(kuò)增任一未知DNA片段。在PCR反應(yīng)前無需分離程序，所構(gòu)建的染色體區(qū)帶特異性文庫不僅避免了分離等步驟，減少了產(chǎn)生污染的可能，而且由于DNA丟失少而極大提高了文庫的完整性。另外，還包括微克隆的篩選和鑒定所建立的DNA文庫的特異性一般采用Southern雜交、原位雜交和特定片段的PCR擴(kuò)增進(jìn)行鑒定I) Southern 雜交分析 Southern雜交時(shí)可用一定的標(biāo)記物標(biāo)記基因組DNA,與建立的染色體DNA文庫進(jìn)行雜交，或標(biāo)記建立的DNA文庫中插入片段，用其作為探針與基因組DNA進(jìn)行雜交。其目的是初步鑒定該文庫中插入片段的來源。但是Southern雜交可能存在假陽性，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。2)原位雜交分析用得到的染色體DNA文庫中插入片段作探針進(jìn)行原位雜交。其目的是檢測插入片段是否源自目的染色體；鑒別該染色體特有的克??；鑒別與其他染色體共有的克隆。所用探針可用放射性同位素和非放射性標(biāo)記物如地高辛、生物素等進(jìn)行標(biāo)記。3) PCR擴(kuò)增方法PCR擴(kuò)增時(shí)所用DNA模板可以是微分離的染色體DNA，也可以是染色體DNA文庫中的插入片段。只要該染色體某一基因DNA兩側(cè)序列可知，就可利用PCR鑒別該染色體的特異性。本發(fā)明利用定位于不同小麥染色體上的SSR標(biāo)記進(jìn)行鑒定。本發(fā)明采用普通小麥(煙農(nóng)15與中國春)、小偃麥異代換系山農(nóng)0095、中間偃麥草根尖細(xì)胞為材料，利用“原位”移膜法制備適合在SLy CUT 激光切割系統(tǒng)進(jìn)行小麥染色體切割的染色體標(biāo)本。本發(fā)明的方法具有制片簡單、快速、方便，制片快速、染色體分散均勻等優(yōu)點(diǎn)；在利用該系統(tǒng)對小麥根尖細(xì)胞染色體初步切割的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了切割系統(tǒng)切割小麥根尖細(xì)胞染色體的主要技術(shù)參數(shù)，并成功地對小麥染色體片段、單條染色體、兩條/三條染色體進(jìn)行了顯微切割，這為特定小麥染色體、小麥中異源染色體的微切割、微克隆乃至外源染色體攜帶優(yōu)良基因的克隆等后續(xù)研究提供了參考。


圖I為“原位”移膜法制得的小麥根尖染色體標(biāo)本；圖2為染色體顯微切割(示激光參數(shù)設(shè)置不當(dāng))a :表示分離之前；b :分離之后；圖3為CXD機(jī)相關(guān)參數(shù)設(shè)置；圖4為單步收集示意圖；圖5為單條染色體顯微切割；a :切割前b :切割后；圖6為2條染色體顯微切割；a :切割前b :對一條染色體切割c :對另一條染色體切割；圖7為切割后染色體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定。
具體實(shí)施例方式I、根尖細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備(I)催根將小麥煙農(nóng)15、中國春、小偃麥山農(nóng)0095、中間偃麥草種子在室溫下浸泡至露白，1-4°C冰箱中冰凍24h，然后在25°C條件下培養(yǎng)，根長I. 5-2. Ocm時(shí)取根尖；或在溫暖的天氣傍晚將田間生長的材料澆水，第二天上午9-10時(shí)挖取根尖；(2)固定與保存根尖先在冰水中處理24h，再用卡諾氏液于1_4°C條件下固定24h以上后，轉(zhuǎn)入70%酒精保存；

(3)預(yù)處理將根尖細(xì)胞從保存液中取出，無菌蒸餾水低滲處理IOmin ；(4)初步鏡檢對根尖細(xì)胞分裂相進(jìn)行初步鏡檢，挑選大多數(shù)處于中期的根尖細(xì)胞備用；(4)酶解將挑選過的根尖細(xì)胞放于2%纖維素酶+2%果膠酶(Sigma公司)混合酶液于37°C下酶解1-1. 5h，無菌蒸餾水沖洗IOmin ；(5)制片用無菌鑷子將根尖細(xì)胞搗碎于載玻片(蓋玻片亦可)，然后覆膜壓片將染色體“原位”轉(zhuǎn)移到分離膜上，再將玻片與膜剝離，70%、100%酒精各脫水3min，最后制成如圖I所示的小麥根尖染色體標(biāo)本。需要注意的是，制片之前為了清潔和增加分離膜的粘性，可以用紫外光照射，也可以用多聚賴氨酸處理以增加粘性；但是不能采用常規(guī)冷凍揭片的方法，因?yàn)槔鋬鼋移貏e容易撕爛分離膜。2染色體顯微切割的有關(guān)技術(shù)參數(shù)設(shè)置(I)普通光源照明強(qiáng)度設(shè)置120V/100W的普通光源照明強(qiáng)度，能夠滿足所有倍數(shù)下對染色體切割的要求，以下有關(guān)參數(shù)就是在該強(qiáng)度下進(jìn)行的設(shè)置。(2)紫外激光參數(shù)設(shè)置在120V/100W普通光源照明強(qiáng)度下，對紫外激光參數(shù)進(jìn)行了調(diào)試。如圖2所示，當(dāng)在100X物鏡下進(jìn)行切割，激光速度偏高(設(shè)置不當(dāng))，切割速度過快，切割不徹底，需要多次進(jìn)行切割，影響切割效率；加之紫外激光的熱效應(yīng)，容易導(dǎo)致目標(biāo)染色體變形，嚴(yán)重者可能造成“焦煳”染色體，影響回收效率，也影響進(jìn)行下游PCR擴(kuò)增等工作。當(dāng)各種激光參數(shù)設(shè)置適當(dāng)時(shí)，切割的切口自然圓滑，激光的熱效應(yīng)對目標(biāo)染色體影響小(圖5-b所示)。一般情況下，在不改變激光聚焦的情況下，適當(dāng)調(diào)高激光的能量(如以5-10 %的比率遞增)，或是降低激光的速度(如以5-10 %的比率降低)，均可以提高激光切割效率。經(jīng)過多次調(diào)試和試驗(yàn)，初步確定不同倍數(shù)顯微鏡激光參數(shù)設(shè)置如下表I不同物鏡下的紫外激光參數(shù)設(shè)置一覽表物鏡激光速度聚焦激光能量
Object lensLaser rateFocusingLaser energy
4X827970
497279
IOX
597466
20 X515075
40 X104960
IOOx(3) CXD攝像機(jī)設(shè)定可以通過CellCut 軟件的Option菜單更改CCD攝像機(jī)設(shè)定(如圖3)。在軟件中，可以調(diào)整白平衡、曝光時(shí)間和增益等參數(shù)。具體操作可以根據(jù)實(shí)際情況加以自主設(shè)置，只要達(dá)到清晰即可。(4)激光校正多次使用后，激光的位置可能會略有偏差。當(dāng)激光不遵循選定的切割路徑，或是位置與指針位置有所偏差時(shí)，需要調(diào)整和確認(rèn)激光的位置。應(yīng)該在每一個(gè)物鏡倍數(shù)下進(jìn)行染色體切割，都需要進(jìn)行調(diào)整。(5)切割樣本的選擇原則上，使用軟件中所列的所有繪圖工具均可以完成對樣本的切割，但是，在實(shí)際操作過程中，建議采用圓形或者矩形等規(guī)則工具進(jìn)行繪圖，如果采用用手勾畫不規(guī)則形狀，容易出現(xiàn)如圖2所示的情形；另外，要將樣本選擇的區(qū)域與待切割樣本保持一定的距離，以免激光在切割過程中由于熱效應(yīng)造成對樣本的損傷。(6)單步收集在操作CellCut 顯微切割系統(tǒng)時(shí)，可以在全部操作過程中將反應(yīng)管蓋放置在組織上，因?yàn)楣苌w中包含擴(kuò)散體，可以顯著地提高成像質(zhì)量。原則上，在切割之前，管蓋需要放置在染色體標(biāo)本上(如圖4)，激光從下面照射上來，切割染色體和膜。在實(shí)際切割過程中，經(jīng)多次試驗(yàn)，低倍物鏡下，管蓋可以放在膜上，也可以提起來切割；但是在40XU00X物鏡下進(jìn)行切割，則要求必需提起來切割；切割完畢，把管蓋放下進(jìn)行收集，每次切割之后可以單獨(dú)收集樣本,也可以將幾次切割的樣本收集在同一個(gè)反應(yīng)管中。3染色體顯微切割根據(jù)調(diào)試好的技術(shù)參數(shù)，依次打開相應(yīng)激光器、照明電源、CXD機(jī)和Cell⑶T軟件開關(guān)，將制備好的染色體標(biāo)本置于載物臺上，以備切割。(I)小麥根尖細(xì)胞單條染色體(片段)的微切割對小麥的根尖細(xì)胞單條染色體進(jìn)行切割。如在40X物鏡下，對圖5-a箭頭所示的單條染色體進(jìn)行切割，切割之后放下Eppendorf管管蓋進(jìn)行收集，圖5_b表明，該條染色體已經(jīng)被成功切割并進(jìn)行了收集。(2)小麥根尖細(xì)胞兩條/多條染色體的微切割
對小麥根尖多條染色體進(jìn)行切割，用同一個(gè)Eppendorf管進(jìn)行收集。如圖6_a所示的兩條染色體進(jìn)行切割，首先對其中一條進(jìn)行了切割和收集(如圖6-b所示)，然后對另外一條再行切割，并用同一個(gè)管蓋進(jìn)行收集(如圖6-c所示)。這表明，同時(shí)切割兩條相同的或者不同的多條染色單體，用同一個(gè)管蓋進(jìn)行收集，不會影響收集效率，還會大大提高工作效率，也能為下一步的PCR擴(kuò)增提供更多的摸板或者底物。4切割染色體的DOP-PCR擴(kuò)增(I)擴(kuò)增前預(yù)處理切割染色體用黏性的Eppendorf管蓋進(jìn)行收集，然后加入20μ lX20ng/y I的蛋白酶K處理液(內(nèi)含用于DOP-PCR的I XTaq DNA聚合酶緩沖液)于O. 2mlEppendorf 管，1000r/min 離心 3min, 37°C處理 4h, 70°C滅活 20min, -20°C保存?zhèn)溆茫?2) DOP-PCR 擴(kuò)增進(jìn)行兩輪 PCR
第一輪向含有上述酶解液的Eppendorf管中添加4 μ I 10XBuffer、3 μ IMg2+(25mM) ,4 μ I dNTP (2. 5mM)、0· 4 μ I Taq 酶(5U/μ I)、2 μ I 兼并引物(15ng/yl)、ddH20配成體積為50 μ I的反應(yīng)體系，然后按如下程序進(jìn)行擴(kuò)增94°C預(yù)擴(kuò)增IOmin ;然后940C lmin, 30°C I. 5miu,72°C 3min，其中，30°C變化至 72°C需要 3min，共計(jì) 5 個(gè)循環(huán)；接著，940C lmin，57°C I. 5miu,72°C 1.5min，共計(jì) 25 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 lOmin，4°C保存?zhèn)溆?。第二輪取第一輪的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μ I作為第二次擴(kuò)增的模板，其他反應(yīng)條件不變。反應(yīng)程序94°C預(yù)擴(kuò)增 5min，然后 94°C lmin, 55°C I. 5miu,72°C I. 5min，共計(jì) 30 個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10min，4°C保存。為避免外源DNA的污染，上述整個(gè)單染色體體外擴(kuò)增過程均在無菌條件下進(jìn)行，并設(shè)立嚴(yán)格不含染色體DNA的陰性(無菌水)對照和以IOpg總DNA為模板的陽性對照。(3)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測將第二次擴(kuò)增產(chǎn)物中加入適量溴酚蘭(產(chǎn)物/溴酚蘭4V/1V)，6%聚丙烯酰胺非變性凝膠上穩(wěn)壓IlOV電泳，銀染顯色，然后用Tanon Gis-2010型凝膠成像系統(tǒng)照相觀察。具體結(jié)果詳見圖7。有關(guān)試劑的配置方法如下(I)蛋白酶K處理液的配置稱取O. 3mg蛋白酶K溶入500 μ I ITaq DNA聚合酶緩沖液，配成600ng/ μ I的蛋白酶K溶液，用時(shí)稀釋至20ng/l·! I。 (2)兼并引物序列5 ’ -CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3 ’，由上海生物工程公司(Sangon)合成。(3)小麥基因組DNA的提取I)取5g葉片置液氮中速凍后研成粉末，裝入50ml離心管。2)加入 20ml 已預(yù)熱到 65°C 的提取液(IOOmM Tris. HCl pH8. 5，IOOmM NaCl, 50mMEDTA pH8. 0,2% SDS) 每管中加入 ΙΟΟμΙ 10mg/ml 蛋白酶 K，混勻。3)置65°C水浴中l(wèi)_2h，不時(shí)輕輕倒轉(zhuǎn)離心管以混勻。4)從水浴中取出離心管，加入20ml酚/氯仿(I I)抽提，輕輕混勻20min。5)3000轉(zhuǎn)/分離心20min，取上清，加入等體積氯仿，輕輕混勻。6)3000轉(zhuǎn)/分離心20min，取上清，加入0. 6體積異丙醇，輕輕混勻，用玻璃鉤將DNA纏出，70%酒精沖洗，稍氣干，溶于5ml 1XTE。
7)加入 10 μ I 10mg/ml RNA 酶，輕輕混勻，置 37°C lh。8)加入5ml酹/氯仿抽提,3000轉(zhuǎn)/分離心15min,取上清。9)加入等體積氯仿抽提,3000轉(zhuǎn)/分離心15min,取上清。10)加入1/10體積3M醋酸鈉，混勻，然后加入2倍體積冷乙醇，混勻。11)用玻璃鉤鉤出DNA，70%酒精沖洗，置于I. 5ml離心管，氣干，溶于1XTE，測DNA濃度經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA質(zhì)量。(4)硝酸銀染色步驟I)電泳完畢，取下膠塊在固定液中固定3min。2)用去離子水快速?zèng)_洗2-3次，每次30-40S。 3)于銀染液中染色5_7min。4)用水快速?zèng)_洗(IOS)，不超過20S。5)放入顯影液中顯影至第一條帶出現(xiàn)(一般以泳道出現(xiàn)為準(zhǔn))。6)最后放入停影液中停影。所用試劑的配制6%聚丙烯酰胺凝膠的配方(一塊板用量30ml)
去離子水19.5ml
5 XTBE緩沖液6ml
39 I (丙稀酰胺甲叉雙丙稀酰胺)4.5ml(39g+lg+100ml水)用之前先過濾。
TEMED16μ1
過硫酸氨(0.1g/ml)160μ1其中，后兩者是催化劑，用量可隨溫度升高酌情減少。固定液40ml乙醇+360ml水+2ml乙酸銀染液0·6 克 AgN03+300ml 水即 O. 2% AgN03顯影液3% Na0H(12gNa0H+400ml水+2ml甲醛)，甲醛用時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)加停影液10%乙酸(30ml乙酸+270ml水)其中，固定液和銀染液可以重復(fù)利用，前者2次，后者可用3次。電泳電壓一般掌握在低于120V。
權(quán)利要求
1.ー種利用SLy CUT系統(tǒng)切割小麥染色體的方法，其特征在于以普通小麥(煙農(nóng)15與中國春)、小偃麥異代換系山農(nóng)0095、中間偃麥草根尖細(xì)胞為材料，利用SLy CUT系統(tǒng)對小麥根尖細(xì)胞染色體初歩切割的基礎(chǔ)上，對小麥根尖染色體進(jìn)行了顯微切割。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用SLyCUT系統(tǒng)切割小麥染色體的方法，其特征在于所述的普通小麥為煙農(nóng)15或中國春。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用SLyCUT系統(tǒng)切割小麥染色體的方法，其特征在于具體包括以下步驟 (1)染色體標(biāo)本制備 首先要挑選小麥根尖染色體為制備染色體標(biāo)本的材料，將目標(biāo)染色體轉(zhuǎn)移到膜上； (2)目標(biāo)染色體的識別 染色體標(biāo)本制好之后，對目標(biāo)染色體進(jìn)行識別； (3)染色體(片斷)顯微切割和分離 借助于 SLy CELLCUT (Molecular machine industry, MMI)切割系統(tǒng)及系統(tǒng)軟件直接對目標(biāo)染色體進(jìn)行可視化切割，然后運(yùn)用帶有黏性的Eppendorf管的管蓋對目標(biāo)染色體回收，進(jìn)而進(jìn)行下游工作。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用SLyCUT系統(tǒng)切割小麥染色體的方法，其特征在于步驟(2)中的識別方法可以采用分帶、核型分析或原位雜交。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用SLyCUT系統(tǒng)切割小麥染色體的方法，其特征在于在染色體經(jīng)過顯微切割和分離后進(jìn)行微克隆庫的建立。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用SLyCUT系統(tǒng)切割小麥染色體的方法，其特征在于顯微切割染色體微克隆文庫的建立主要包括酶切直接克隆和以PCR為介導(dǎo)克隆方法。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用SLyCUT系統(tǒng)切割小麥染色體的方法，其特征在于酶切直接克隆法為首先將分離出的多個(gè)同一目標(biāo)染色體片段抽提去蛋白質(zhì)及DNA純化、酶切，然后加入同一限制性內(nèi)切酶切割的載體及連接酶，連接后再轉(zhuǎn)化一定的宿主菌，以建立染色體DNA文庫。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用SLyCUT系統(tǒng)切割小麥染色體的方法，其特征在于還包括微克隆的篩選和鑒定步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的利用SLyCUT系統(tǒng)切割小麥染色體的方法，其特征在于所建立的DNA文庫的特異性一般采用Southern雜交、原位雜交和特定片段的PCR擴(kuò)增進(jìn)行鑒定 . 1)Southern雜交分析 Southern雜交時(shí)可用一定的標(biāo)記物標(biāo)記基因組DNA，與建立的染色體DNA文庫進(jìn)行雜交，或標(biāo)記建立的DNA文庫中插入片段，用其作為探針與基因組DNA進(jìn)行雜交； . 2)原位雜交分析 用得到的染色體DNA文庫中插入片段作探針進(jìn)行原位雜交； . 3)PCR擴(kuò)增方法 PCR擴(kuò)增時(shí)所用DNA模板可以是微分離的染色體DNA，也可以是染色體DNA文庫中的插入片段，利用定位于不同小麥染色體上的SSR標(biāo)記進(jìn)行鑒定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用SLμCUT系統(tǒng)切割小麥染色體的方法，以普通小麥(煙農(nóng)15與中國春)、小偃麥異代換系山農(nóng)0095、中間偃麥草根尖細(xì)胞為材料，利用SLμCUT系統(tǒng)對小麥根尖細(xì)胞染色體初步切割的基礎(chǔ)上，對小麥根尖染色體進(jìn)行了顯微切割。本發(fā)明的方法具有制片簡單、快速、方便，制片快速、染色體分散均勻等優(yōu)點(diǎn)；在利用該系統(tǒng)對小麥根尖細(xì)胞染色體初步切割的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了切割系統(tǒng)切割小麥根尖細(xì)胞染色體的主要技術(shù)參數(shù)，并成功地對小麥染色體片段、單條染色體、兩條/三條染色體進(jìn)行了顯微切割，這為特定小麥染色體、小麥中異源染色體的微切割、微克隆乃至外源染色體攜帶優(yōu)良基因的克隆等后續(xù)研究提供了參考。
文檔編號C12Q1/68GK102677179SQ20121001835
公開日2012年9月19日 申請日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者李興鋒, 王洪剛, 王黎明, 袁建國, 袁瑛, 高居榮 申請人:河南科技大學(xué)