專利名稱：甘藍(lán)tt16基因家族及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)及其親本物種白菜(Brassica rapa)和甘藍(lán)(Brassica oleracea) TT16 (TRANSPARENT TESTA 16,透明種皮 16 ;又稱 ABS，ARABIDOPSIS BSISTER ;或 AGL32，AGAM0US-LIKE 32)基因家族及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
十字花科(Brassicaceae)的蕓薹屬(Brassica)包括很多油料作物、蔬菜和觀賞植物品種，為人類提供營養(yǎng)價(jià)值豐富的食用油、蔬菜和觀賞植物，并為畜牧業(yè)提供飼料，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在蕓薹屬物種中，異源四倍體物種甘藍(lán)型油菜是由2個(gè)二倍體物種白菜和甘藍(lán)通過種間雜交后再加倍而形成的。甘藍(lán)型油菜是世界第二大油料作物，在全世界廣泛種植，栽培面積和產(chǎn)量僅次于大豆。白菜和甘藍(lán)也是重要的油料、蔬菜和觀賞作物。對甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)功能基因的比較基因組學(xué)研究將為揭示它們之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系提供理論基礎(chǔ)，并為蕓薹屬作物的性狀改良提供應(yīng)用基礎(chǔ)。籽粒顏色是甘藍(lán)型油菜的重要性狀之一。甘藍(lán)型油菜黃籽品系具有種皮薄、皮殼率低、粗纖維含量低、含油量高、餅柏蛋白含量高等優(yōu)點(diǎn)，與黑籽品系相比，餅柏的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和油的品質(zhì)都有所提高。雖然白菜和甘藍(lán)中均存在表型穩(wěn)定的天然黃籽基因型，但自然界中不存在天然的甘藍(lán)型油菜黃籽基因型。已有的甘藍(lán)型油菜黃籽材料主要通過遠(yuǎn)緣雜交等方式而創(chuàng)造，存在黃籽率和黃籽度不高，表型不穩(wěn)定，易受環(huán)境影響而變異，選育效率低，育種周期長，負(fù)相關(guān)性狀難以克服等缺點(diǎn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)要求。因此，獲得穩(wěn)定遺傳的甘藍(lán)型油菜黃籽性狀成為甘藍(lán)型油菜育種的重要目標(biāo)。長期以來，全世界眾多研究者對該性狀進(jìn)行了廣泛研究，但到目前為止對于黃籽性狀形成的分子機(jī)理仍不清楚，更沒有通過轉(zhuǎn)基因分子育種創(chuàng)造黃籽性狀的任何報(bào)道。類黃酮物質(zhì)是廣泛存在于植物界的次生代謝物質(zhì)，是植物組織中紅色、藍(lán)色和紫色等花青素苷色素的呈色物質(zhì)。擬南芥(Arabidopsis thaliana)等植物種皮色素的主要成分為原花青素(proanthocyanidin, PA)單體的聚合物,其是經(jīng)公共苯丙燒途徑-類黃酮途徑-原花青素途徑合成的。目前的研究表明，類黃酮生物合成的調(diào)控是由轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用來完成的，而這些轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的時(shí)空特性受到精密調(diào)控。已知WD40、MYB、 bHLH、MADS-box、WRKY和bZIP轉(zhuǎn)錄因子都參與了類黃酮途徑的調(diào)控，其中MADS_box (TT16)、 WRKY(TTG2)和bZIP(TTl)轉(zhuǎn)錄因子在此途徑中的作用還沒有徹底明確。蕓薹屬和擬南芥同屬十字花科，具有較近的親緣關(guān)系。擬南芥TT16(AtTT16)基因編碼MADS_box轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)其對于BAN基因的表達(dá)和原花青素在內(nèi)種皮中的積累是必需的。擬南芥ttl6突變體表現(xiàn)為透明種皮即黃籽性狀，且內(nèi)種皮細(xì)胞變得不規(guī)則，推測該基因可能還參與調(diào)控內(nèi)種皮細(xì)胞分化和發(fā)育，但具體作用和機(jī)制尚不清楚。因此，在蕓薹屬中對TT16基因進(jìn)行同源克隆和功能鑒定，是篩選甘藍(lán)型油菜黃籽位點(diǎn)的重要途徑。蕓薹屬和擬南芥起源于同一祖先，約在1700 1800萬年前發(fā)生分離，蕓薹族植物發(fā)生了基因組水平的三倍化，即蕓薹屬基本種白菜(AA組，529Mbp)、甘藍(lán)(CC組，696Mbp) 和黑芥(BB組，632Mbp)等的基因組約相當(dāng)于擬南芥基因組(157Mbp)的3倍，而甘藍(lán)型油菜(AACC組，1132Mbp)的基因組相當(dāng)于甘藍(lán)和白菜兩個(gè)基因組之和，約相當(dāng)于擬南芥基因組的6倍，也就是說，在擬南芥中為單拷貝的基因在甘藍(lán)和白菜中可能分別有3個(gè)對應(yīng)的拷貝，而在甘藍(lán)型油菜中可能有6個(gè)拷貝。目前對TT16基因的研究報(bào)道較少，而TT16基因在甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)等蕓薹屬物種中的成員數(shù)、蛋白特征、進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)的組織特異性及與黃籽性狀的關(guān)系等都未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT16
基因家族。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)，分別克隆了甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT16基因家族成員的全長cDNA和對應(yīng)的基因組序列，并進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示所述白菜TT16(BrTT16)基因家族包括以下3個(gè)成員BrTT16_l基因、BrTT16_2基因和&TT16-3基因；所述&TT16-1基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 2所示，BrTT16-2 基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 4所示，BrTT16_3基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 6 所示；所述甘藍(lán)TT16(BoTT16)基因家族包括以下3個(gè)成員BoTT16_l基因、BoTT16_2基因和BoIT16-3基因；所述BoIT16-l基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 8所示，BoTT16_2基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 10所示，BoTT16_3基因的全長cDNA序列如SEQ IDNo. 12 所示；所述甘藍(lán)型油菜TT16(BnTT16)基因家族包括以下6個(gè)成員BnTT16_l基因、 BnTT16-2 基因、BnTT16-3 基因、BnTT16-4 基因、BnTT16-5 基因和 BnIT16-6 基因；所述 BnTT16-l基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 14所示，BnTT16_2基因的全長cDNA序列如 SEQ IDNo. 16所示，BnTT16-3基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 18所示，BnTT16-4基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 20所示，BnTT16_5基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 22 所示，BnTT16-6基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 24所示。進(jìn)一步，所述BrTT16-l基因的基因組序列如SEQ ID No. I所示，BrTT16_2基因的基因組序列如SEQ ID No. 3所示，BrTT16-3基因的基因組序列如SEQ ID No. 5所示；所述BoTT16-l基因的基因組序列如SEQ ID No. 7所示，BoTT16_2基因的基因組序列如SEQ ID No. 9所示，BoTT16-3基因的基因組序列如SEQ ID No. 11所示；所述BnTT16-l基因的基因組序列如SEQ ID No. 13所示，BnTT16_2基因的基因組序列如SEQ ID No. 15所示，BnTT16-3基因的基因組序列如SEQ ID No. 17所示，BnTT16_4 基因的基因組序列如SEQ ID No. 19所示，BnTT16-5基因的基因組序列如SEQ ID No. 21所示，BnTT16-6基因的基因組序列如SEQ ID No. 23所示。
上述3個(gè)物種的12條TT16基因與AtTT16基因具有較高的同源性，基因組序列一致性為67. I 70. 3%，編碼區(qū)序列一致性為82. 9 87. 0%，編碼蛋白的氨基酸序列的一致性和相似性分別為73. 0 78. 2%和78. 2 85. 7 %，核酸水平和氨基酸水平的序列比對、系統(tǒng)發(fā)生聚類等方面都表明，它們是AtTT16基因的垂直同源基因。這3個(gè)物種的12條 TT16基因之間也具有很高的同源性，基因組序列一致性為69. 4 100. 0%，編碼區(qū)序列一致性為85. 2 100. 0%，編碼蛋白的氨基酸序列的一致性和相似性分別為75. I 100%和 80. 4 100% ;其中，甘藍(lán)型油菜的BnTT16-l、BnTT16-4、BnTT16-6基因分別來源于白菜的 &TT16-1、BrTT16-2、BrTT16-3 基因，而甘藍(lán)型油菜的 BnIT16-2、BnTT16-3, BnTT16-5 基因分別來源于甘藍(lán)的 BoIT16-l、BoTT16-2、BoIT16-3 基因。BnIT16、BrTT16、BoIT16 基因家族保持了與AtTT16基因類似的器官特異性，主要在生殖器官中表達(dá)，以花和發(fā)育中的種子表達(dá)最高，并隨著種子的發(fā)育進(jìn)程而逐漸下降。此外，TT16基因在甘藍(lán)型油菜和白菜的黑籽與黃籽材料中的表達(dá)存在著較明顯的差異，而在甘藍(lán)的黑籽與黃籽材料中無明顯差異，說明甘藍(lán)型油菜和白菜的黃籽性狀與TT16基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)，而甘藍(lán)的黃籽性狀與TT16基因幾乎沒有關(guān)系?；谏鲜鼋Y(jié)果，利用本發(fā)明的BnTT16、BrTT16、B0TTI6基因家族中的任一種或多種基因或基因截短片段，可以構(gòu)建TT16基因重組表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化體，用于TT16基因的正義表達(dá)、反義抑制、RNA干擾等。本發(fā)明的目的之二在于提供所述甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT16基因家族在蕓薹屬作物種子性狀的分子育種中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT16基因家族在甘藍(lán)型油菜黃籽性狀的分子育種中的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明選取甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT16基因家族特異保守保守區(qū)段BTT16I(核苷酸序列如SEQ ID No. 14中第353 966位堿基所示)為 RNA干擾片段，以基于pFGC5941改造的植物RNA干擾基礎(chǔ)載體pFGC5941M為骨架，將BTT16I 分別以反義和正義方式同時(shí)插入PFGC5941M的CaMV35S啟動子和OCS終止子之間形成反向重復(fù)序列，構(gòu)建了蕓薹屬TT16基因家族RNA干擾載體pFGC5941M-BTT16I，并通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化了甘藍(lán)型油菜典型黑籽品種中雙10號，所得陽性轉(zhuǎn)基因植株的性狀調(diào)查發(fā)現(xiàn)，通過RNA干擾沉默BnTT16基因家族后，轉(zhuǎn)基因植株的背景性狀正常，轉(zhuǎn)基因種子明顯變小且種皮色素明顯減少，多數(shù)呈黃褐色和黃棕色，與非轉(zhuǎn)基因種子的典型黑籽形成鮮明對比。說明在甘藍(lán)型油菜等植物中，TT16基因同時(shí)調(diào)控種子大小發(fā)育、種皮色素積累等性狀的形成， 可以應(yīng)用于蕓薹屬作物種子性狀的分子育種，尤其是甘藍(lán)型油菜黃籽性狀的分子育種，利于創(chuàng)造出新型的甘藍(lán)型油菜黃籽材料，也可以超量表達(dá)后用于增加種子的大小，提高種子千粒重。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了 TT16基因在甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)中的成員數(shù)、各成員的全長cDNA序列和基因組序列、編碼蛋白特征、進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)的組織特異性等，并確認(rèn)了 TT16基因家族同時(shí)參與種子大小的發(fā)育和種皮色素的積累， 由此本發(fā)明提供了 TT16基因在蕓薹屬作物種子性狀改良特別是甘藍(lán)型油菜黃籽性狀的分子育種中的應(yīng)用，應(yīng)用前景好。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中圖I 為 BnTT16 (A)、BrTT16 (B)、B0TTI6 (C)基因家族 5，cDNA 末端的擴(kuò)增。圖2 為 BnTT16 (A)、BrTT16 (B)、B0TTI6 (C)基因家族 3，cDNA 末端的擴(kuò)增。圖3為BnTT16(A)、BrTT16(B)、BoTT16(C)基因家族成員全長cDNA的擴(kuò)增，其中I采用引物組合FBT16-l+RBT16-2，2采用引物組合FBT16-3+RBT16-4，3采用引物組合 FBT16-5+RBT16-6。圖4為BnITie (A)、&TT16 (B)、BOIT16 (C)基因家族成員基因組DNA的擴(kuò)增，其中I采用弓I物組合FBT16-1+RBT16-2，2采用弓I物組合FBT16-3+RBT16-4, 3采用弓I物組合 FBT16-5+RBT16-6。圖5為&TT16、BoTT16, BnTT16基因家族成員及AtIT16基因mRNA的序列比對。圖6為BrTT16、BoTT16、BnTT16家族蛋白及AtTT16蛋白的氨基酸序列比對。圖I為^■1'1'16、801'1'16、8111'1'16基因家族成員與4丨1'1'16基因1111 應(yīng)的聚類分析。圖8為BrTT16、BoTT16、BnTT16家族蛋白與AtTT16蛋白的聚類分析。圖9為&TT16、BoTT16, BnTT16基因家族成員的Southern雜交鑒定，其中M為地高辛標(biāo)記的分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖10為BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族總體和成員的器官特異性表達(dá)檢測。圖11為白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜的黑籽、黃籽材料主要生殖器官中TT16基因家族總體和成員的表達(dá)。圖12為RNA干擾片段BTT161的PCR擴(kuò)增。圖13為RNA干擾載體pFGC5941M_BTT16I的結(jié)構(gòu)圖。圖14為RNA干擾載體pFGC5941M_BTT16I構(gòu)建中的酶切和PCR鑒定，其中 A 為 Swa I+Aat II 雙酶切 pMD19-T_BIT16I，M 為 DNA marker, CK 代表酶切前的 PMD19-T-BTT16I ；B 為 Swa I+Aat 11 雙酶切 pFGC5941M, M 為 DNA marker, CK 代表酶切前的 PFGC5941M ；C 為 pFGC594IM-BIT16IA 的克隆子菌液 PCR 檢測；D 為 BamH I+Xba I 雙酶切 PMD19-T-BTT16I, M 為 DNA marker, CK 代表酶切前的 pMD19_T_BTT16I ;E 為 BamH I+Xba I 雙酶切 pFGC594IM-BIT16IA ；M 為 DNA marker, CK 代表酶切前的 pFGC594IM-BIT16IA ；F 為 PFGC5941M-BTT16I 的克隆子菌液 PCR 檢測，M 為 DNA marker。圖15為再生植株的Basta復(fù)檢鑒定，其中CK為非轉(zhuǎn)基因植株，1-3為再生植株。圖16為再生植株的PCR檢測結(jié)果，其中M為DNA marker, CK為陽性對照，I為陰性對照，2-15為再生植株。圖17為轉(zhuǎn)基因種子(左)和非轉(zhuǎn)基因種子(右)的比較。
具體實(shí)施例方式以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。優(yōu)選實(shí)施例采用的植物材料白菜材料均來自于白菜型油菜亞種(B.rapa ssp.oleifera)，包括黑籽系09L597和黃籽系09L600 ;甘藍(lán)材料均來自于羽衣甘藍(lán)變種 (B. oleracea var. acephala)，包括黑桿系09L598和黃桿系09L599 ;甘藍(lán)型油菜材料包括黑籽系5B和籽色近等基因系(黑籽系09L588、黃籽系09L587)，均由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心選育和大田常規(guī)種植，并經(jīng)過了 10代以上的單花序套袋自交；甘藍(lán)型油菜黑籽品種中雙10號由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油菜作物所選育，種子由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心提供。優(yōu)選實(shí)施例采用的試劑Easy-Taq DNA聚合酶[5U/iU，附10XPCR Buffer (含 Mg2+)]購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；LA Taq DNA聚合酶[5U/yl，附10XLA PCR Buffer II (含Mg2+)]、X-HindIII DNA marker等購自寶生物工程(大連)有限公司；限制性內(nèi)切酶Dral、EcoRI> EcoRV> Hindlll、尼龍膜、地高辛標(biāo)記的DNA marker等購自立陶宛 MBI Fermentas公司；pMD19_T載體購自寶生物工程(大連)有限公司，MS (Murashige and Skoog medium)培養(yǎng)基購自荷蘭Duchefa公司，結(jié)冷膠購自浙江中肯生物科技有限公司，其它分子、生化和植物組織培養(yǎng)試劑購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司和上海稼豐園藝用品有限公司；改進(jìn)型植物RNA干擾基礎(chǔ)載體pFGC5941M是在pFGC5941的基礎(chǔ)上改進(jìn)而成，改進(jìn)之處是采用來自甘藍(lán)型油菜的BnPAP2基因第2內(nèi)含子(BnPAP2I2)替換pFGC5941 上過長的PhChsA間隔區(qū)，并在間隔區(qū)與啟動子間增加一個(gè)AatII切點(diǎn)。優(yōu)選實(shí)施例采用的試劑盒小量植物組織RNA抽提試劑盒(W7021)購自上海華舜生物工程有限公司，小量膠回收試劑盒及質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)mego公司，pMD19-T載體連接試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，GeneRacer Kit購自美國Invitrogen公司，PCR DIGProbe Synthesis Kit、DIG Easy Hyb>DIG Wash and Block Buffer Set、DIG Nucleic AcidDetection Kit 均購自德國 Roche 公司，RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0 購自寶生物工程 (大連)有限公司。一、甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT16基因家族的克隆I、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)基因組總DNA的提取取大田常規(guī)條件下栽培的甘藍(lán)型油菜5B、白菜09L597和甘藍(lán)09L598的嫩葉，采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因組總DNA，采用電泳法和分光光度法評價(jià)核酸樣品的質(zhì)量和濃度。I. 0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，提取的3個(gè)物種的基因組總DNA完整性好，平均分子量均大于入-HindIII DNA Marker的23kb條帶，RNA消化比較完全，經(jīng)分光光度法檢測純度較高，可以直接用于PCR擴(kuò)增及Southern雜交。2、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)各器官總RNA的提取取大田常規(guī)條件下栽培的甘藍(lán)型油菜5B、白菜09L597和甘藍(lán)09L598的蕾(Bu)、 花(Fl)以及4個(gè)發(fā)育階段的種子[甘藍(lán)型油菜和甘藍(lán)取開花后15天(iro)、30天(30D)、45 天(45D)和55天(55D)的種子;白菜取開花后10天(IOD)、25天(25D)、40天(40D)和45 天(45D)的種子];以及大田常規(guī)條件下栽培的甘藍(lán)型油菜09L587和09L588、白菜09L597 和 09L600、甘藍(lán) 09L598 和 09L599 的根(Ro)、下胚軸(Hy)、子葉(Co)、莖(St)、葉(Le)、蕾、 花、莢果皮(SP)以及4個(gè)發(fā)育階段的種子(甘藍(lán)型油菜和甘藍(lán)取iro、30D、4 和55D的種子；白菜取10D、2 、40D和4 的種子)共12個(gè)器官；采用小量植物總RNA抽提試劑盒提取各器官總RNA，采用電泳法和分光光度法評價(jià)核酸樣品的質(zhì)量和濃度。I. 0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，獲得的總RNA特征條帶清晰，且無明顯RNA降解和DNA污染，經(jīng)分光光度法檢測純度較高，能夠滿足RACE操作的基本要求。3、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)RACE第一鏈cDNA的獲得分別取甘藍(lán)型油菜5B、白菜09L597和甘藍(lán)09L598的蕾、花和4個(gè)發(fā)育階段的種子的總RNA混合成總量為5 μ g的RNA樣品，采用GeneRacer Kit按其說明書進(jìn)行一系列的 RACE操作，最終反轉(zhuǎn)錄獲得在3’端和5’端同時(shí)錨定有人工接頭序列的第一鏈cDNA，PCR 放大后進(jìn)行I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，三個(gè)物種的第一鏈cDNA呈現(xiàn)出大小在 200bp IOkb的拖帶,重心區(qū)域在500bp 4kb,最核心區(qū)在I. 5kb左右，說明反轉(zhuǎn)錄比較完全，得到了較高質(zhì)量的總cDNA，可用于克隆甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)TT16基因家族完整的cDNA末端。4、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)TT16基因家族5’ cDNA末端的克隆根據(jù)AtTT16基因序列多重比對的結(jié)果，設(shè)計(jì)了對應(yīng)于兩個(gè)最保守點(diǎn)的反向引物R TT16-50(5’-ggatcgttttgaagattaggctgagcaag-3>)和 RBT16RT(5’-gctcgtgtggaggaatgga gg-3’)。分別以白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜第一鏈cDNA為模板，用GeneRacer Kit提供的引物 5，P (5，-cgactggagcacgaggacactga-3，)與 RTT16-50 配對，進(jìn)行 5，cDNA 末端的 RACE — 擴(kuò)。50 μ I 標(biāo)準(zhǔn) TaqPCR 擴(kuò)增體系為10 X PCR Buffer 5. O μ 1，25mmol/L 的 MgCl2 3. 0μ I, IOmmoI/L 的 dNTPsl. 0μ l,10ymol/L 的正向引物 I. O μ l,10ymol/L 的反向引物 I. O μ 1， 5U/ μ I的Taq酶0. 5 μ I，模板O. 5 μ I，加雙蒸水至總體積為50 μ I。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為 94°C預(yù)變性2分鐘；再94°C變性I分鐘，52°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，共30個(gè)循環(huán)； 最后72°C延伸10分鐘。以一擴(kuò)產(chǎn)物為模板，用GeneRacer Kit 提供的引物 5’NP (5’-ggacactgacatggactg aaggagta-3’ )與RBT16RT配對，進(jìn)行5’ cDNA末端的RACE巢擴(kuò)，PCR擴(kuò)增體系與一擴(kuò)相同但模板改為O. I μ 1，PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性2分鐘；再94°C變性I分鐘，58°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，共25個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物進(jìn)行I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，采用小量膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段，與PMD19-T載體連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素(Amp)、IPTG和Χ-gal的LB平板培養(yǎng)至藍(lán)白斑清晰，挑取白斑單菌落，用含有Amp的LB液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后，取菌液進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果陽性克隆子表現(xiàn)出明顯的長度多態(tài)性，各挑選10個(gè)具有代表性的陽性克隆子委托上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明BrTT16基因家族的5’ cDNA末端介于429 681bp之間，B0TTI6基因家族的5’cDNA末端介于448 658bp之間，BnTT16 基因家族的5’ cDNA末端介于526 649bp之間。NCBI BLASTn表明，這些5’ cDNA末端與 AtTT16/ABS mRNA(AJ318098)具有很高的一致性，表明它們的確為蕓薹屬TT16基因家族的 5，cDNA 末端。5、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)TT16基因家族3’ cDNA末端的克隆根據(jù)AtTT16基因序列多重比對的結(jié)果，設(shè)計(jì)了對應(yīng)于兩個(gè)最保守點(diǎn)的正向引物 FTT16-30(5，-tgagctctct(g/a)ttctctg(c/t)gatgc-3，)和 FTT16-3N(5，-ctcacatcggtctc atcgtcttctc-3’)。分別以白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜第一鏈cDNA為模板,用GeneRacer Kit提供的引物 3，P (5，-gctgtcaacgatacgctacgtaacg-3，)與 FTT16-30 配對，進(jìn)行 3，cDNA 末端的RACE —擴(kuò)。PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)與5’ cDNA末端的RACE —擴(kuò)相同。以一擴(kuò)產(chǎn)物為模板，用GeneRacer Kit提供的引物3’ N
8P (5，-cgctacgtaacggcatgacagtg-3’ )與 FTT16-3N 配對，進(jìn)行 3’ cDNA 末端的 RACE 巢擴(kuò)， PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)與5’ cDNA末端的RACE巢擴(kuò)相同。PCR產(chǎn)物如前法所述進(jìn)行電泳檢測(圖2)、膠回收、PMD19-T載體克隆、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、陽性克隆子篩選、 菌液PCR鑒定和測序。測序結(jié)果表明BrTT16基因家族的3’ cDNA末端介于778 853bp 之間，B0TTI6基因家族的3’ cDNA末端介于733 936bp之間，BnTT16基因家族的3’ cDNA 末端介于687 820bp之間[均不包括poly (A)]。NCBI BLASTn表明，這些3’cDNA末端與 AtTT 16/ABS mRNA基因具有很高的一致性，表明它們的確為蕓薹屬TT16基因家族的3 ’ cDNA 末端。6、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)TT16基因家族成員全長cDNA的克隆根據(jù)BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族5’和3’cDNA末端的測序結(jié)果，設(shè)計(jì)了 3條正向引物和3條反向引物(表I)，得到3對引物組合:FBT16-l+RBT16-2、FBT16-3+RBT16-4、 FBT16-5+RBT16_6 ;分別以白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜第一鏈cDNA為模板，采用上述引物組合和50 μ I標(biāo)準(zhǔn)Taq PCR擴(kuò)增體系，擴(kuò)增BnTT16、BrTT16、B0TTI6基因家族各成員的全長 cDNA，PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性2分鐘，再94°C變性I分鐘、54 57°C退火I分鐘、 72°C延伸2分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；再如前法所述進(jìn)行電泳檢測(圖3)、 膠回收、PMD19-T載體克隆、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、陽性克隆子篩選、菌液PCR鑒定和測序。表I BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族成員全長cDNA的擴(kuò)增引物
引物名稱引物序列(5’—3’)核苷酸數(shù)(nt)解鏈溫度(°c)FBT16-1ggatccgagaaagtctgattaagcatattattccc3561.80/67.01FBT16-3ggatccaaaagcaacttatagatgtatatatgtaagg3759.35/64.68FBT16-5ggatccacacacgctatacacacggagtta3062.86/68.73RBT16-2cccggggalgatgaatgattattatgattaatataalc3856.96/64.69RBTI6-4cccggggatggctagtt aatcatataatcaagacc3561.80/69.36RBT16-6CCCgggagatgtaatgatgattgattatataattaaag3856.96/64.69結(jié)果以白菜第一鏈總cDNA為模板，引物組合分別為FBNA10-6+RBRA10-10、 FBT16-3+RBT16-4、FBT16-5+RBT16-6，各擴(kuò)增得到 I 條長度分別為 1060bp、1242bp、1123bp 的全長 cDNA，分別命名為 fcTT16-lmRNA、BrTT16-2mRNA 和 fcTT16_3mRNA。以甘藍(lán)第一鏈總cDNA為模板，引物組合分別為FBNA10-6+RBRA10-10、 FBT16-3+RBT16-4、FBT16-5+RBT16-6，各擴(kuò)增得到 I 條長度分別為 1087bp、1028bp、1134bp 的全長 cDNA，分別命名為 BoTT16-lmRNA、BoTT16-2mRNA 和 BoTT16_3mRNA。以甘藍(lán)型油菜第一鏈總cDNA為模板，引物組合為FBT16-1+RBT16-2，擴(kuò)增得到2條長度分別為1060bp和1084bp的全長cDNA，分別命名為BnTT16_lmRNA和BnTT16_2mRNA ;引物組合為FBT16-3+RBT16-4，擴(kuò)增得到2條長度分別為1214bp和1243bp的全長cDNA，分別命名為BnTT16-3mRNA和BnTT16_4mRNA ;引物組合為FBT16-5+RBT16-6，擴(kuò)增得到2條長度分別為 1128bp 和 1123bp 的全長 cDNA，分別命名為 BnTT16_5mRNA 和 BnTT16_6mRNA。Vector NTI Advance 9.0多重比對表明，所得的&11'1'16、81'1716、801'1'16基因家族的全長cDNA均有相應(yīng)的RACE末端克隆子序列與之對應(yīng)，說明它們均是可轉(zhuǎn)錄表達(dá)的基因。多重比對還表明，3個(gè)物種中RACE末端所指示的各獨(dú)立基因均已獲得了對應(yīng)的全長cDNA。7、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)TT16基因家族成員基因組DNA的克隆根據(jù)BrTT16、B0TTI6、BnTT16基因家族成員全長cDNA的序列多重比對結(jié)果，設(shè)計(jì)檢測各成員的特異引物組合:FBT16-1S+RBT16-12S、FBT16-2S+RBT16-12S、 FBT16-34S + RBT16-3S、FBT I 6-34S + RBT I 6-4S、FBT I 6-56S + RBT I 6-5S、 FBT16-56S+RBT16-6S (表 2);根據(jù) &ΤΓ16、ΒοΤΤ16、ΒηΤΤ16 基因家族 RACE 末端和全長 cDNA 的克隆結(jié)果，分別以白菜09L597、甘藍(lán)09L598、甘藍(lán)型油菜5B的基因組總DNA為模板，采用上述全長cDNA的擴(kuò)增引物組合和50 μ I標(biāo)準(zhǔn)Taq PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行相同PCR，擴(kuò)增ΒηΤΤ16、 BrTT16、BoTT16基因家族各成員的基因組DNA，再如前法所述進(jìn)行電泳檢測(圖4)、膠回收、 PMD19-T載體克隆、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、陽性克隆子篩選、菌液PCR鑒定和特異引物鑒定(用上述特異引物組合進(jìn)行梯度PCR)，最后測序。表2檢測BrTT 16、BoTT 16、BnTT 16基因家族成員的特異引物
權(quán)利要求
1.甘藍(lán)TT16基因家族，其特征在于包括以下3個(gè)成員BoTT16-l基因、BOTT16-2基因和BoTT16-3基因；所述BoTT16-l基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 8所示，BoTT16_2基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 10所示，BoTT16_3基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 12 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的甘藍(lán)TT16基因家族，其特征在于所述BoTT16-l基因的基因組序列如SEQ ID No. 7所示，BoTT16-2基因的基因組序列如SEQ ID No. 9所示，BoTT16_3 基因的基因組序列如SEQ ID No. 11所不。
3.權(quán)利要求I或2所述的甘藍(lán)TT16基因家族在蕓薹屬作物種子性狀的分子育種中的應(yīng)用，所述種子性狀為種子大小發(fā)育和種皮色素積累。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述蕓薹屬作物種子性狀的分子育種為甘藍(lán)型油菜黃籽性狀的分子育種。
全文摘要
本發(fā)明公開了甘藍(lán)TT16基因家族，包括BoTT16-1基因(全長cDNA序列如SEQ IDNo.8所示)、BoTT16-2基因(全長cDNA序列如SEQ ID No.10所示)和BoTT16-3基因(全長cDNA序列如SEQ ID No.12所示)三個(gè)成員，該基因家族可應(yīng)用于蕓薹屬作物種子大小發(fā)育和種皮色素積累等種子性狀的分子育種。
文檔編號C12N15/29GK102586274SQ20121001847
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者呂俊, 周清元, 李加納, 柴友榮, 諶利, 閆楠, 雷波, 馬麗娟, 馬赑 申請人:西南大學(xué)