專利名稱：甘藍(lán)aha10基因家族及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)及其親本 禾中 (Brassica rapa)禾口(Brassica oleracea) AHAlO (autoinhibitedH+-ATPase 10，自抑制H+-ATP酶10)基因家族及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
十字花科(Brassicaceae)的蕓薹屬(Brassica)包括很多油料作物、蔬菜和觀賞植物品種，為人類提供營養(yǎng)價(jià)值豐富的食用油、蔬菜和觀賞植物，并為畜牧業(yè)提供飼料，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在蕓薹屬物種中，異源四倍體物種甘藍(lán)型油菜是由2個(gè)二倍體物種白菜和甘藍(lán)通過種間雜交后再加倍而形成的。甘藍(lán)型油菜是世界第二大油料作物，在全世界廣泛種植，栽培面積和產(chǎn)量僅次于大豆。白菜和甘藍(lán)也是重要的油料、蔬菜和觀賞作物。對(duì)甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)功能基因的比較基因組學(xué)研究將為揭示它們之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系提供理論基礎(chǔ)，并為蕓薹屬作物的性狀改良提供應(yīng)用基礎(chǔ)。籽粒顏色是甘藍(lán)型油菜的重要性狀之一。甘藍(lán)型油菜黃籽品系具有種皮薄、皮殼率低、粗纖維含量低、含油量高、餅粕蛋白含量高等優(yōu)點(diǎn)，與黑籽品系相比，餅粕的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和油的品質(zhì)都有所提高。雖然白菜和甘藍(lán)中均存在表型穩(wěn)定的天然黃籽基因型，但自然界中不存在天然的甘藍(lán)型油菜黃籽基因型。已有的甘藍(lán)型油菜黃籽材料主要通過遠(yuǎn)緣雜交等方式而創(chuàng)造，存在黃籽率和黃籽度不高，表型不穩(wěn)定，易受環(huán)境影響而變異，選育效率低，育種周期長，負(fù)相關(guān)性狀難以克服等缺點(diǎn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)要求。因此，獲得穩(wěn)定遺傳的甘藍(lán)型油菜黃籽性狀成為甘藍(lán)型油菜育種的重要目標(biāo)。長期以來，全世界眾多研究者對(duì)該性狀進(jìn)行了廣泛研究，但到目前為止對(duì)于黃籽性狀形成的分子機(jī)理仍不清楚，更沒有通過轉(zhuǎn)基因分子育種創(chuàng)造黃籽性狀的任何報(bào)道。蕓薹屬和擬南芥(Arabidopsi staliana)同屬十字花科，具有較近的親緣關(guān)系。原花青素(proanthocyanidin，PA)是形成甘藍(lán)型油菜黑籽顏色的基礎(chǔ)，在黃籽種皮中明顯降低。擬南芥AHAlO (AtAHAlO)基因參與了種皮中原花青素的聚合，也影響著早期種皮細(xì)胞中液泡的發(fā)育。在擬南芥ahalO突變體中，雖然花青素(anthocyanidin)能在種皮中正常的積累，但原花青素的積累量只有非突變體的百分之一，這表明質(zhì)膜H+-ATPase參與了原花青素在種皮細(xì)胞中的代謝，特別是在原花青素的聚合過程中起著重要的調(diào)控作用。AtAHAlO基因的突變同樣使得突變體種子的種皮呈現(xiàn)出透明種皮的特性。在正常的擬南芥種子發(fā)育早期，種皮內(nèi)層細(xì)胞中能觀察到較大的液泡，而在擬南芥ahalO突變體中只能看到一些較小的液泡，但隨著種皮的逐漸成熟，這些差別會(huì)隨之消失，表明該基因的突變導(dǎo)致了液泡發(fā)育的延遲。因此，在蕓薹屬中對(duì)AHA10基因進(jìn)行同源克隆和功能鑒定，將有助于揭示甘藍(lán)型油菜種皮色素和早期種皮細(xì)胞中液泡發(fā)育的分子機(jī)理，是篩選甘藍(lán)型油菜黃籽位點(diǎn)的重要途徑。蕓薹屬和擬南芥起源于同一祖先，約在1700 1800萬年前發(fā)生分離，蕓薹族植物發(fā)生了基因組水平的三倍化，即蕓薹屬基本種白菜(AA組，5^Mbp)、甘藍(lán)(CC組，696Mbp) 和黑芥(BB組，632Mbp)等的基因組約相當(dāng)于擬南芥基因組(157Mbp)的3倍，而甘藍(lán)型油菜(AACC組，1132Mbp)的基因組相當(dāng)于甘藍(lán)和白菜兩個(gè)基因組之和，約相當(dāng)于擬南芥基因組的6倍，也就是說，在擬南芥中為單拷貝的基因在甘藍(lán)和白菜中可能分別有3個(gè)對(duì)應(yīng)的拷貝，而在甘藍(lán)型油菜中可能有6個(gè)拷貝。目前，除AtAHAlO基因外，尚無其它植物的AHAlO 基因被克隆，對(duì)AHAlO基因的研究報(bào)道較少，而AHAlO基因在甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)等蕓薹屬物種中的成員數(shù)、蛋白特征、進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)的組織特異性及與黃籽性狀的關(guān)系、轉(zhuǎn)基因分子育種等都未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán) AHAlO基因家族。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)，分別克隆了甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)AHAlO基因家族成員的全長cDNA和對(duì)應(yīng)的基因組序列，并進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示所述白菜AHAlO (BrAHAlO)基因家族包括以下2個(gè)成員BrAHA10_l基因禾口 BrAHA 10-2基因；所述BrAHAlO-I基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 2所示，BrAHAlO-2基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 4所示；所述甘藍(lán)AHAlO (BoAHAIO)基因家族包括以下2個(gè)成員ΒοΑΗΑ10_1基因和 ΒοΑΗΑ10-2基因；所述BoAHAIO-I基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 6所示，ΒοΑΗΑΙΟ-2基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 8所示；所述甘藍(lán)型油菜AHAlO (BnAHAlO)基因家族包括以下2個(gè)成員=BnAHAlO-I基因和 BnAHA 10-2 基因；所述 BnAHAlO-I 基因的全長 cDNA 序列如 SEQ ID No. 10 所示，ΒηΑΗΑΙΟ-2 基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 12所示。進(jìn)一步，所述BrAHAlO-I基因的基因組序列如SEQ ID No. 1所示，BrAHAlO-2基因的基因組序列如SEQ ID No. 3所示；所述BoAHAIO-I基因的基因組序列如SEQ ID No. 5所示，BoAHA10-2基因的基因組序列如SEQ ID No. 7所示；所述BnAHAlO-I基因的基因組序列如SEQ ID No. 9所示，BnAHA 10-2基因的基因組序列如SEQ ID No. 11所示。上述3個(gè)物種的6條AHAlO基因與AtAHAlO基因具有較高的同源性，基因組序列一致性為72. 4 74. 1 %，編碼區(qū)序列一致性為89. 6 90. 6% ;6條AHAlO基因之間也具有很高的同源性，基因組序列一致性為85. 0 99. 8 %，編碼區(qū)序列一致性為95. 7 99. 9%。 核酸水平和氨基酸水平的序列比對(duì)、系統(tǒng)發(fā)生聚類等表明，6條AHAlO基因都是AtAHAlO 基因的垂直同源基因，具有相似的結(jié)構(gòu)特征；其中BnAHAlO-I基因起源于BoAHAIO-I基因，BnAHA10-2基因起源于BrAHAlO-2基因。半定量RT-PCR檢測表明，BnAHAlO, BrAHAlO, BoAHAIO基因家族具有類似AtAHAlO基因的轉(zhuǎn)錄特征，都是在早期發(fā)育中的種子中表達(dá)豐度最高；此外，AHAlO基因在白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜黑籽與黃籽材料的生殖器官中的表達(dá)存在著較明顯的差異，AHAlO基因表達(dá)顯著下調(diào)是蕓薹屬黃籽性狀的重要成因。
基于上述結(jié)果，利用本發(fā)明的BnAHAlO、BrAHA10、BOAHA10基因家族中的任一種或多種基因或基因截短片段，可以構(gòu)建AHAlO基因重組表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化體，用于AHAlO基因的正義表達(dá)、反義抑制、RNA干擾等。本發(fā)明的目的之二在于提供所述甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)AHAlO基因家族在蕓薹屬作物種子性狀的分子育種中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)AHAlO基因家族在甘藍(lán)型油菜黃籽性狀的分子育種中的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明選取甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)AHAlO基因家族特異保守片段BAHA10I (核苷酸序列如SEQ ID No. 10中第2768 30 位堿基所示) 為RNA干擾片段，以基于PTOC5941改造的植物RNA干擾基礎(chǔ)載體PTOC5941M為骨架，將 BAHA10I片段分別以反義和正義方式同時(shí)插入PTOC5941M的CaMV35S啟動(dòng)子和OCS終止子之間形成反向重復(fù)序列，構(gòu)建了蕓薹屬AHAlO基因家族RNA干擾載體PreC5941M-BAHA10I， 并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的下胚軸侵染法轉(zhuǎn)化了甘藍(lán)型油菜典型黑籽品種中雙10號(hào)，所得陽性轉(zhuǎn)基因植株和種子的性狀調(diào)查發(fā)現(xiàn)，通過RNA干擾沉默BnAHAlO基因家族后，轉(zhuǎn)基因種子多數(shù)呈黃棕色和紫黃色，少數(shù)呈金黃色，與非轉(zhuǎn)基因種子的典型黑籽形成鮮明對(duì)比。轉(zhuǎn)基因后代植株的主體形態(tài)特征與非轉(zhuǎn)基因的對(duì)照植株無明顯差異，但是轉(zhuǎn)基因種子普遍偏小，飽滿度偏低。說明在甘藍(lán)型油菜等植物中，AHAlO基因除了參與調(diào)控種皮色素合成以外，還參與調(diào)控了一些其它種子性狀如種子大小，可以應(yīng)用于蕓薹屬作物種子性狀的分子育種，尤其是甘藍(lán)型油菜黃籽性狀的分子育種，利于創(chuàng)造出新型的甘藍(lán)型油菜黃籽材料，也可以超量表達(dá)后用于增加種子的大小，提高種子千粒重。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了 AHAlO基因在甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)中的成員數(shù)、各成員的全長cDNA序列和基因組序列、編碼蛋白特征、進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)的組織特異性等，并確認(rèn)了 AHAlO基因表達(dá)顯著下調(diào)是蕓薹屬黃籽性狀的重要成因，由此本發(fā)明提供了 AHAlO基因在蕓薹屬作物種子性狀改良特別是甘藍(lán)型油菜黃籽性狀的分子育種中的應(yīng)用，應(yīng)用前景好。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中圖1為BrAHAlO、BoAHAIO、BnAHAlO基因家族5，cDNA末端擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳。圖2為BrAHAlO、BoAHAIO、BnAHAlO基因家族3，cDNA末端擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳。圖3為BrAHAlO基因家族全長cDNA和基因組DNA的擴(kuò)增結(jié)果，其中A為 BrAHA10-ImRNA，B 為 BrAHAlO-I(1)和 BrAHA10-2(2)gDNA。圖4為BoAHAIO基因家族全長cDNA和基因組DNA的擴(kuò)增結(jié)果，其中A為 BoAHA 10-ImRNA，B 為 BoAHA 10-2 mRNA, C 為 BoAHA 10-1 (1)和 BoAHA 10-2 (2) gDNA。圖5為BnAHAlO基因家族全長cDNA和基因組DNA的擴(kuò)增結(jié)果，其中A為 BnAHA 10-ImRNA，B 為 BnAHA 10-2 mRNA, C 為 BnAHAlO-I (1)禾口 BnAHA 10-2 (2) gDNA。圖6為BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO基因家族及AtAHAlO基因mRNA的序列比對(duì)。圖7為BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO基因家族與擬南芥AHA基因家族mRNA的聚類分析。圖8為BrAHAlO、BoAHAIO、BnAHAlO家族蛋白及AtAHAlO蛋白的氨基酸序列比對(duì)。圖9為BrAHAlO、BoAHAIO、BnAHAlO家族蛋白與擬南芥AHA家族蛋白的聚類分析。圖10為BrAHAlO、BoAHAIO、BnAHAlO家族蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。圖11為BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO基因家族成員的Southern雜交鑒定，其中M 為地高辛標(biāo)記的分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖12為BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO基因家族總體和成員組織器官特異性表達(dá)檢測。圖13為白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜黑籽、黃籽材料主要生殖器官中AHA10基因家族總體和各成員的表達(dá)。圖14為RNA干擾載體preC5941M_BAHA10I的元件圖。圖15為RNA干擾片段ΒΑΗΑ101的PCR擴(kuò)增。圖16為涉及反義片段插入的酶切和中間載體單克隆的PCR檢測，其中，1為 PMD19-T-BAHA10I 的 NcoI+Aat11 雙酶切；2 為 pFGC5941M 的 NcoI+Aat11 雙酶切，3、4 為 PFGC5941M-BAHA10IA 單克隆用引物組合 F35S3N+FBnAHA10I, RBnAHAlOI+RBnPAP212 檢測， M 為 Marker (1、3、4 為 DL2000 plus, 2 為 λ -HindIII 與 DL2000 plus 的混合物),CK 為未酶切的質(zhì)粒。圖17為涉及正義片段插入的酶切和RNA干擾載體單克隆的PCR檢測，其中， 1 為 pMD19-T-BAHA10I 的 BamHI+Xbal 雙酶切；2 為 pFGC5941M_BAHA10IA 的 BamHI+Xbal 雙酶切，3、4、5、6 為 pFGC5941M-BAHA10IA 單克隆用引物組合 FBnPAP2I2+RBAHA10I、 R0CST5N+FBAHA10I、F35S3N+RBnPAP2I2, FBnPAP2I2+R0CST5N 檢測，M 為 Marker，CK 為未酶切的質(zhì)粒。圖18為再生植株的Basta復(fù)檢鑒定，其中A為陰性植株對(duì)照，B為陽性植株。圖19為RNA干擾載體preC5941M_BAHA10I轉(zhuǎn)基因油菜的PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中1為陽性菌液對(duì)照，2為陰性植株對(duì)照，3 10為轉(zhuǎn)基因植株。圖20為非轉(zhuǎn)基因植株㈧和轉(zhuǎn)基因植株⑶的種皮顏色比較。
具體實(shí)施例方式以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。優(yōu)選實(shí)施例采用的植物材料白菜材料均來自于白菜型油菜亞種(B.rapa ssp. oleifera)，包括黑籽系09L597和黃籽系09L600 ；甘藍(lán)材料均來自于羽衣甘藍(lán)變種 (B. oleracea var. acephala)，包括黑籽系09L598和黃籽系09L599 ；甘藍(lán)型油菜材料包括黑籽系5B和籽色近等基因系(黑籽系09L588、黃籽系09L587)，均由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心選育，大田常規(guī)種植，并經(jīng)過了 10代以上的單花序套袋自交；甘藍(lán)型油菜黑籽品種中雙10號(hào)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所選育，種子由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心提供。優(yōu)選實(shí)施例采用的主要試劑及試劑盒=Easy-Taq DNA聚合酶(5U/ μ 1)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，LA Taq DNA聚合酶(5U/μ 1)、λ -HindIII DNA marker、RNA PCR Kit(AMV)Ver. 3. 0 購自寶生物工程(大連)有限公司，DraI (40U/ul), EcoRI, EcoRV, HindIIiabaI (lOU/μ 1)、尼龍膜、地高辛標(biāo)記的DNA marker、pMD19_T載體連接試劑盒、PCR DIG ProbeSynthesis Kit、DIG Easy Hyb>DIG Wash and Block Buffer Set、DIG Nucleic Acid Detection Kit _ 自RocheMS (Murashige and Skoog medium) ^1^ !
自荷蘭Duchefa公司，結(jié)冷膠購自浙江中肯生物科技有限公司，小量植物組織RNA抽提試劑盒(W7021)購自上海華舜生物工程有限公司，小量膠回收試劑盒及質(zhì)粒抽提試劑盒購自杭州博日生物工程有限公司，pGEM-T easy載體連接試劑盒購自美國!Iomega公司，GeneRacer Kit購自美國hvitrogen公司。改進(jìn)型植物RNA干擾基礎(chǔ)載體PreC5941M是在pTOC5941 的基礎(chǔ)上改進(jìn)而成，改進(jìn)之處是采用來自甘藍(lán)型油菜的&1PAP2基因第2內(nèi)含子(BnPAP2I2) 替換了 PTOC5941上過長的WiChsA間隔區(qū)，并在間隔區(qū)與啟動(dòng)子間增加了一個(gè)AatII切點(diǎn)。一、甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)AHAlO基因家族的克隆1、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)基因組總DNA的提取取大田常規(guī)條件下栽培的甘藍(lán)型油菜5B、白菜09L597和甘藍(lán)09L598的嫩葉，采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因組總DNA，采用電泳法和分光光度法評(píng)價(jià)核酸樣品的質(zhì)量和濃度。1. 0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，提取的3個(gè)物種的基因組總DNA完整性好，平均分子量均大于λ-HindIII DNA Marker的231Λ條帶，RNA消化徹底，純度較高，可以用于PCR擴(kuò)增和Southern雜交。2、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)各器官總RNA的提取取大田常規(guī)條件下栽培的甘藍(lán)型油菜5B、白菜09L597和甘藍(lán)09L598的蕾(Bu)、 花(Fl)以及4個(gè)發(fā)育階段的種子[甘藍(lán)型油菜和甘藍(lán)取開花后15天(15D)、30天(30D)、45 天(45D)和55天(55D)的種子；白菜取開花后10天(IOD)、25天(25D)、40天(40D)和45 天(45D)的種子]；以及大田常規(guī)條件下栽培的甘藍(lán)型油菜09L587和09L588、白菜09L597 和 09L600、甘藍(lán) 09L598 和 09L599 的根(Ro)、下胚軸(Hy)、子葉(Co)、莖(St), Bf (Le)、蕾、 花、莢果皮(SP)以及4個(gè)發(fā)育階段的種子(甘藍(lán)型油菜和甘藍(lán)取15D、30D、45D和55D的種子；白菜取10D、25D、40D和45D的種子)共12個(gè)器官；采用小量植物總RNA抽提試劑盒提取各器官總RNA，采用電泳法和分光光度法評(píng)價(jià)核酸樣品的質(zhì)量和濃度。1. 0%瓊脂糖凝膠電泳顯示，獲得的總RNA特征條帶清晰，且無明顯RNA降解和DNA污染，經(jīng)分光光度法檢測純度較高，能夠滿足RACE操作的基本要求。3、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)RACE第一鏈cDNA的獲得分別取甘藍(lán)型油菜5B、白菜09L597和甘藍(lán)09L598的蕾、花和4個(gè)發(fā)育階段的種子的總RNA混合成總量為5ug的RNA樣品，采用GeneRacer Kit按其說明書進(jìn)行一系列的 RACE操作，最終反轉(zhuǎn)錄獲得在3’端和5’端同時(shí)錨定有人工接頭序列的第一鏈cDNA，PCR放大后進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，反轉(zhuǎn)錄比較完全，三個(gè)物種均得到了較高質(zhì)量的總cDNA，可用于克隆甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)AHAlO基因家族完整的cDNA末端。4、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)AHAlO基因家族5，cDNA末端的克隆根據(jù)AtAHAlO序列多重比對(duì)的結(jié)果，設(shè)計(jì)了對(duì)應(yīng)于兩個(gè)最保守點(diǎn)的反向引物RA HA105-1 -ccagttacatctgtactgtccac-3‘)和 ΚΑΗΑΙΟδ-ΖΝ -cccttcttcttggtcacaggta g-3’)。分別以甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)第一鏈cDNA為模板，用GeneRacer Kit提供的引
7^ 5' P (5' -cgactggagcacgaggacac-tga-3‘)與 RAHA105-1 MM, S^T 5' cDNA μ W RACE 一擴(kuò)。50 μ 1 標(biāo)準(zhǔn) Taq PCR 擴(kuò)增體系為10 X PCR Buffer 5. 0 μ 1，25mmol/L 的 MgCl2 3. 0μ l,10mmol/L 的 dNTPs 1. 0μ l,10ymol/L 的正向引物 1. 0 μ l,10ymol/L 的反向引物1. 0 μ 1，5U/ μ 1的Taq酶0. 5 μ 1，模板0. 5 μ 1，加無菌水至總體積為50 μ 1。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性2分鐘；再94°C變性1分鐘，52°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，共 30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。以一擴(kuò)產(chǎn)物為模板，用 GeneRacer Kit 提供的引物 5’NP (5’-ggacactgacatggactg aagg-agta-3，)與RAHA105-2配對(duì)，進(jìn)行5，cDNA末端的RACE巢擴(kuò)，PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)與一擴(kuò)相同，但模板改為0. lul，退火溫度改為56°C。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，采用小量膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段，與PGEM-T easy載體連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素(Amp)、IPTG和Χ-gal的LB平板培養(yǎng)至藍(lán)白斑清晰，挑取白斑單菌落，用含有Amp的LB液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后，取菌液進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果陽性克隆子表現(xiàn)出明顯的長度多態(tài)性，各挑選10個(gè)具有代表性的陽性克隆子委托上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明=BrAHAlO基因的5’cDNA末端介于691 906bp之間，BoAHAIO基因的5，cDNA末端介于723 856bp之間，BnAHAlO基因的5，cDNA末端介于730 800bp之間。NCBI BLASTn表明，這些5，cDNA末端與AtAHAlO 基因(匪101587.2)具有很高的一致性，表明它們的確為蕓薹屬AHAlO基因家族的5，cDNA 末端。5、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)AHAlO基因家族3，cDNA末端的克隆根據(jù)AtAHAlO序列多重比對(duì)的結(jié)果，設(shè)計(jì)了對(duì)應(yīng)于兩個(gè)最保守點(diǎn)的正向引物FA HA103-1 -gtaacacgtagtcgaagctggtc-3，)和 FAHA103_2(5，-aacgtcccgggactctcctga t_3’)。分別以甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)第一鏈cDNA為模板，用GeneRacer Kit提供的引物 3，P (5，-gctgtcaacgatacgctacgt-aacg_3，)與 FAHA103-1 配對(duì)，進(jìn)行 3，cDNA 末端的 RACE 一擴(kuò)。PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)與5’ cDNA末端的RACE—擴(kuò)相同。以一擴(kuò)產(chǎn)物為模板，用 GeneRacer Kit 提供的引物 3，NP (5，_cgctacgtaacggcatga cagtg-3，)與FAHA103-2配對(duì)，進(jìn)行3，cDNA末端的RACE巢擴(kuò)，PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)與5’ cDNA末端的RACE巢擴(kuò)相同。PCR產(chǎn)物如前法所述進(jìn)行電泳檢測(圖2)、膠回收、 T載體克隆、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、陽性克隆子篩選、菌液PCR鑒定和測序。測序結(jié)果表明BrAHA10基因的3，cDNA末端介于661 697bp之間，BoAHA 10基因的3，cDNA末端介于625 686bp之間，BnAHAlO基因的3，cDNA末端介于650 704bp之間[均不包括 poly(A)]。NCBI BLASTS表明，這些3，cDNA末端與AtAHAlO基因具有很高的一致性，表明它們的確為蕓薹屬AHAlO基因家族的3’ cDNA末端。6、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)AHAlO基因家族成員全長cDNA及基因組DNA的克隆根據(jù)所獲得的甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)AHAlO基因家族5，cDNA和3，cDNA末端序列，設(shè)計(jì)了 7條正向引物和6條反向引物(表1)，將其兩兩組合共得到42對(duì)引物組合；分別以甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)第一鏈cDNA為模板，采用上述引物組合和50 μ 1標(biāo)準(zhǔn)Taq PCR 擴(kuò)增體系，擴(kuò)增甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)AHAlO基因家族各成員的全長cDNA，PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性2分鐘，再94°C變性1分鐘、60°C退火1分鐘、72°C延伸4分鐘，共35 個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；分別以甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)基因組總DNA為模板，采用上述引物組合和50 μ 1標(biāo)準(zhǔn)Taq PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行相同PCR，擴(kuò)增甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán) AHAlO基因家族各成員的基因組DNA ；再如前法所述進(jìn)行電泳檢測、膠回收、T載體克隆、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、陽性克隆子篩選、菌液PCR鑒定和測序。表1 BrAHA 10、BoAHA 10、BnAHA 10基因家族成員全長cDNA及基因組DNA的擴(kuò)增引物
引物名稱_引物序列(5’—3’)_堿基數(shù)(Ht)解鏈溫度("C)
FBRA10-1atctc atcttcctctaactccatacc2663.02
FBRA10-9gtttcgcttatgttcctcaagtag2461.15
FBRA10-16gttaagtcctttgtttcattataattaactca3259.52
FBOAlO-Igttaagtcctttgtttcataataattaactcg3260.81
FBOAlO-8agtagcattctcgaagacaaag2258.95
FBOAlO-21actaaccttattaaaattttcctatttcgtc3159.35
FBNA10-6atcttcctcttactccataccaac2461.15
RBRA10-1 ccttgagaatcattagttgtgtgg 24 61.15 RB RA10-10 agcttctgaaacaagtaaccaaattg 26 59.86 RBOAlO-I gtttcatcggaactacttgatagc 24 61.15 RBOAlO-12 ggttgtgtgggaactacttgatagc 25 64.58 RBNA10-6 cttccttgacaatcatctgtttcatc 26 61.44 RBNA10-C02_agagtttcttccttgagaatcattgg_26_61.44_以白菜第一鏈cDNA為模板，引物組合為FBNA10-6+RBRA10-10，擴(kuò)增得到1條長度為326仙？[不包括？017仏)]的全長cDNA，命名為BrAHAlO-I mRNA (圖3A)。以白菜基因組總DNA為模板，引物組合分別為FBNA10-6+RBRA10-10和FBRA10-1+RBNA10-C02，擴(kuò)增得到2 條長度分別為5323bp和5077bp的基因組DNA，分別命名為BrAHAlO-I gDNA和BrAHA10_2 gDNA (圖 3B)。以甘藍(lán)第一鏈cDNA為模板，引物組合分別為FBRA10-16+RB0A10-1和 FBNA10-6+RB0A10-12，擴(kuò)增得到2條長度均為3322bp [不包括poly (A)]的全長cDNA，命名為BoAHAlO-1 mRNA和BoAHA10_2 mRNA (圖4A、B)。以甘藍(lán)基因組總DNA為模板，利用上述引物組合，擴(kuò)增得到2條長度均為5143bp的基因組DNA，命名為BoAHAlO-1 gDNA和 BoAHA10-2 gDNA(圖 4C)。以甘藍(lán)型油菜第一鏈cDNA為模板，引物組合分別為FBRA10-16+RB0A10-1和 FBNA10-6+RB0A10-12，擴(kuò)增得到2條長度分別為3266bp和3215bp的全長cDNA，分別命名為 BnAHAlO-I mRNA和BnAHA10_2 mRNA (圖5A、B)。以甘藍(lán)型油菜5B基因組總DNA為模板， 利用上述引物組合，擴(kuò)增得到2條長度分別為M13bp和5096bp的基因組DNA，分別命名為 BnAHAlO-I gDNA 和 BnAHAlO-2 gDNA(圖 5C)。除了用上述引物組合擴(kuò)增得到的全長cDNA和基因組DNA外，利用表1中的其它一些引物組合也擴(kuò)增出了 DNA片段，但從序列上看，這些DNA片段均屬于上述全長cDNA或基因組DNA的一部分，代表了一些可變性轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和可變性加尾位點(diǎn)。二、甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)AHAlO基因家族的分析
在Vector NTI Advance 9. 0軟件上進(jìn)行序列比對(duì)、開放閱讀框(ORF)查找與翻譯，在http://www. ncbi. nlm. nih. gov網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST和蛋白序列的CDD搜索，在 http://bip. weizmann. ac. il/ 和 http://www. expasy. org 等網(wǎng)站提供鏈接的生物信息學(xué)在線分析軟件上進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，在http://prodes. toulouse. inra. fr/multalin/ multalin. html和http://www. ebi. ac. uk/clustalw/等網(wǎng)站上進(jìn)行基因和蛋白質(zhì)序列多重比對(duì)和聚類分析。1、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)AHA10基因家族的核酸序列分析BrAHAlO-I基因(SEQ ID No. 1)由20個(gè)內(nèi)含子和21個(gè)外顯子組成，20個(gè)內(nèi)含子分別位于 427 496、617 719、818 890、 1031 1117、 1251 1316、 1503 1576、 1779 1868、1990 2057、2177 2266、2392 2467、2571 2677、2824 2914,3078 3 171,3413 3697、3729 3822、3906 3987、4148 4217、4393 4467、 4650 4745、4890 4998 bp 處；BrAHAlO-ImRNA (SEQ ID No. 2)在 201 30;35bp 處(對(duì)應(yīng)于BrAHAlO-I基因的360 5094bp處)有一個(gè)^35bp的0RF，在ORF的上游和下游分別有200bp的5，非翻譯區(qū)(UTR)和229bp的3，UTR, 5' UTR區(qū)中存在4處可變轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) (G1,A21,A82,A113)和三個(gè)小 ORF (42 62、82 105、95 130bp)，3，UTR 區(qū)中存在 5 處可變 Poly(A)加尾位點(diǎn)(T3202> C3211 > T3218、G3254、T3264)，最末 poly (A)加尾位點(diǎn)上游間隔 185bp 處的AAATAAA為典型poly (A)加尾信號(hào)。BrAHA 10-2基因(SEQ ID No. 3)由21個(gè)內(nèi)含子和22個(gè)外顯子組成，21個(gè)內(nèi)含子分別位于 47 沘4、421 506、627 720、820 892、1031 1117、1253 1319、1500 1573,1781 1871、1992 2075、2196 2278、2402 2477、2583 2689、2835 2905、 3071 3 164,3404 3476、3510 3582、3665 3741、3903 3972、4147 4231、4415 4505,4649 4739bp 處；BrAHA10_2mRNA(SEQ ID No. 4)在 117 四5 Ibp 處(對(duì)應(yīng)于 BrAHA 10-2基因的355 4836bp處)有一個(gè)^35bp的0RF，在ORF的上游和下游分別有 116bp的5，UTR和Mlbp的3，UTR, 5' UTR和3，UTR區(qū)中沒有發(fā)現(xiàn)可變轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和可變poly㈧加尾位點(diǎn)，poly(A)加尾位點(diǎn)上游間隔197bp處的AAATAAA為典型poly㈧加尾信號(hào)。BrAHAlO-2基因第6內(nèi)含子左邊界由GT突變?yōu)镚C，導(dǎo)致該內(nèi)含子不能正確剪接，不能有效翻譯形成功能蛋白，因此該基因的表達(dá)豐度極低，本實(shí)驗(yàn)沒有擴(kuò)增出其對(duì)應(yīng)的cDNA。ΒοΑΗΑΙΟ-1基因(SEQ ID No. 5)由20個(gè)內(nèi)含子和21個(gè)外顯子組成，20個(gè)內(nèi)含子分別位于 423 511、632 731、831 913、 1052 1137、 1273 1333、 1514 1593、1801 1890、2011 2130、2251 2330、2454 2531、2637 2738、2884 2954、 3120 3215、3455 3527、3561 3656、3739 3817、3979 4048、4223 4303、4487 4577,4721 4812 bp 處；BoAHA 10-ImRNA(SEQ ID No. 6)在 254 3088 bp 處(對(duì)應(yīng)于 BoAHAIO-I基因的357 4909 bp處)有一個(gè)的0RF，在ORF的上游和下游分別有 253bp的5，UTR和234bp的3，UTR, 5' UTR區(qū)中存在7處可變轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(A1、G54、G57, A60、A76、A106、A129)禾口 4 個(gè)小 ORF (52 84、136 158、148 183、188 223bp)，3，UTR 區(qū)中存在4處可變poly (A)加尾位點(diǎn)(C3217、C3276、C33(14、Q322)，最末poly (A)加尾位點(diǎn)上游間隔190bp處的AAATAAA為典型poly (A)加尾信號(hào)。BoAHA10-2基因(SEQ ID No. 7)由20個(gè)內(nèi)含子和21個(gè)外顯子組成，20個(gè)內(nèi)含子分別位于 423 511、632 731、831 913、 1052 1137、 1273 1333、 1514 1593、1801 1890、2011 2130、2251 2330、2454 2531、2637 2738、2884 2954、 3120 3215、3455 3527、3561 3654、3737 3815、3977 4046、4221 4301、4485 4575,4719 4812bp 處；BoAHA10_2mRNA(SEQ ID No. 8)在 254 3088 bp 處(對(duì)應(yīng)于 BoAHA10-2基因的357 4909 bp處)有一個(gè)^35bp的0RF，在ORF的上游和下游分別有 253 bp的5，UTR和234 bp的3，UTR, 5' UTR區(qū)中存在2處可變轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(A1^57)和4 個(gè)小 ORF (52 84、134 158、148 183、188 223bp)，3，UTR 區(qū)中存在 6 處可變 poly (A) 加尾位點(diǎn)(T3242> T3267> T3283> C3301 > C3305> G33J，最末poly(A)加尾位點(diǎn)上游間隔190bp處的 AAATAAA為典型poly(A)加尾信號(hào)。BnAHAlO-I基因(SEQ ID No. 9)由20個(gè)內(nèi)含子和21個(gè)外顯子組成，20個(gè)內(nèi)含子分別位于 423 511、632 731、831 913、 1052 1137、 1273 1333、 1514 1593、1801 1890、2011 2130、2251 2330、2454 2531、2637 2738、2884 2954、 3120 3215、3455 3527、3561 3656、3739 3817、3979 4048、4223 4303、4487 4577,4721 4812bp 處；BnAHA 10-ImRNA(SEQ ID No. 10)在 198 3032 bp 處(對(duì)應(yīng)于 BnAHAlO-I基因的357 4909 bp處)有一個(gè)^35bp的0RF，在ORF的上游和下游分別有 197bp的5，UTR和234bp的3，UTR, 5' UTR區(qū)中存在7處可變轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(G1,A4,A18,A20, A23> A27, A71)和 3 個(gè)小 ORF(79 102,92 127,133 167bp)，3，UTR 區(qū)中存在 11 處可變 poly (A)力口尾似點(diǎn)(T3io5>C311 ！>C3161 >T3173>T3186>T32n>G32i6>C322o>G3244>G3263>G3266)，束末 poly (A) 加尾位點(diǎn)上游間隔190bp處的AAATAAA為典型poly (A)加尾信號(hào)。BnAHA10-2基因(SEQ ID No. 11)由21個(gè)內(nèi)含子和22個(gè)外顯子組成，21個(gè)內(nèi)含子分別位于 47 284、421 506、627 7205、820 892、1031 1117、1253 1318、 1499 1579、1787 1877、1998 2065、2186 2268、2392 2469、2572 2674、 2820 2902、3068 3165、3405 3481、3515 3605、3688 3751、3913 3982、4157 4242,4426 4512、4656 4734 bp 處；BnAHAlO-2 mRNA(SEQ ID No. 12)在 116 2950bp 處(對(duì)應(yīng)于BnAHA10-2基因的350 1991bp處)有一個(gè)2834bp的0RF，在ORF的上游和下游分別有116bp的5，UTR和^a3p的3，UTR, 5' UTR區(qū)中有兩個(gè)可變轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)⑷、 A6)和1個(gè)小ORF(34 54bp)，3，UTR區(qū)中沒有發(fā)現(xiàn)可變poly (A)加尾位點(diǎn)，poly (A)加尾位點(diǎn)上游間隔209bp處的AATAAA為典型poly (A)加尾信號(hào)。與同源基因比較，ΒηΑΗΑΙΟ-2 基因在第2532bp (mRNA第1489bp)后缺失了一個(gè)堿基T，導(dǎo)致在ORF的中部發(fā)生移碼突變， 理論上是一個(gè)假基因。BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO基因家族及AtAHAlO基因的核苷酸序列比對(duì)結(jié)果如圖6所示，3個(gè)物種的6條AHA10基因之間具有較高的同源性，基因組序列的一致性為 85. 0 99. 8%，編碼區(qū)序列的一致性為95. 7 99. 9% ；它們與AtAHAlO基因也具有很高的同源性，基因組序列的一致性為72. 4 74. 1%，編碼區(qū)序列的一致性為89. 6 90. 2%; BnAHAlO-I與BoAHAIO-I基因組序列的一致性高達(dá)99. 8 %，編碼區(qū)序列的一致性高達(dá) 99. 9%;BnAHA10-2與BrAHA10-2基因組序列的一致性高達(dá)92. 1 %，編碼區(qū)序列的一致性高達(dá) 96. 9%oBrAHA10、BoAHA10、BnAHA10基因家族與擬南芥AHA基因家族mRNA的聚類分析如圖 7所示，BnAHAlO-I mRNA先與BoAHA 10-1 mRNA聚在一起形成一個(gè)小類，再與ΒοΑΗΑΙΟ-2聚在一起形成一個(gè)大類；BnAHA10-2 mRNA先與BrAHA 10_2 mRNA聚在一起形成一個(gè)小組，再與AtAHAlO 聚在一起形成一個(gè)大類；BrAHAlO-I mRNA 單獨(dú)成一類，但與 BnAHAlO-I、BoAHA10-l 和BoAHAlO-2 mRNA聚成的大類關(guān)系較近。聚類分析結(jié)果表明，BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO 基因家族6個(gè)基因成員均是擬南芥AtAHAlO基因的垂直同源基因；BnAHAlO-I基因起源于 BoAHAIO-I 基因，ΒηΑΗΑΙΟ-2 基因起源于 BrAHAlO-2 基因。2、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)AHAlO基因家族的編碼蛋白序列分析BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO基因家族成員所編碼蛋白的基本參數(shù)見表2。由于 ΒηΑΗΑΙΟ-2基因的編碼區(qū)中間發(fā)生了移碼突變，導(dǎo)致其編碼蛋白C-端缺失，為了從蛋白水平研究各個(gè)基因間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)將C-端缺失的氨基酸部分添加在ΒηΑΗΑΙΟ-2之后以表示ΒηΑΗΑΙΟ-2基因未移碼突變前編碼蛋白的狀況，稱為BnAHA10-2ori。表2 BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO家族蛋白的基本參數(shù)
權(quán)利要求
1.甘藍(lán)AHAlO基因家族，其特征在于包括以下2個(gè)成員BoAHA10-l基因和BoAHA10-2 基因；所述BoAHAIO-I基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 6所示，BoAHA10-2基因的全長 cDNA序列如SEQ ID No. 8所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的甘藍(lán)AHAlO基因家族，其特征在于所述BoAHAIO-I基因的基因組序列如SEQ ID No. 5所示，BoAHA10-2基因的基因組序列如SEQ ID No. 7所示。
3.權(quán)利要求I或2所述甘藍(lán)AHAlO基因家族在蕓薹屬作物種子性狀的分子育種中的應(yīng)用，所述種子性狀為種皮成熟轉(zhuǎn)色和種子大小。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述蕓薹屬作物種子性狀的分子育種為甘藍(lán)型油菜黃籽性狀的分子育種。
全文摘要
本發(fā)明公開了甘藍(lán)AHA10基因家族及其應(yīng)用，該基因家族包括二個(gè)成員BoAHA10-1基因(全長cDNA序列如SEQ ID No.6所示)和BoAHA10-2基因(全長cDNA序列如SEQ IDNo.8所示)；該基因家族可應(yīng)用于蕓薹屬作物種皮成熟轉(zhuǎn)色和種子大小等種子性狀的分子育種。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102533785SQ20121001852
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者馮瑜, 唐章林, 李加納, 柴友榮, 殷家明, 王瑞, 諶利, 趙文軍, 陳艷 申請(qǐng)人:西南大學(xué)