專利名稱：對蝦白斑綜合癥病毒的雞胚培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對蝦白斑綜合癥病毒培養(yǎng)技術(shù)研究領(lǐng)域，尤其是涉及對蝦白斑綜合癥病毒的雞胚培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
對蟲下白斑綜合癥病毒(White Spot Syndrome Virus, WSSV)是引起對蟲下白斑綜合癥的主要病原。于20世紀(jì)90年代初首先在中國臺北發(fā)現(xiàn)，是1993年以來導(dǎo)致我國沿海人工養(yǎng)殖對蝦爆發(fā)性流行病大規(guī)模頻繁發(fā)生的主要病毒病原。隨后在亞洲其他國家以及太平洋海岸國家相繼爆發(fā)類似疾病。該病毒能使對蝦出現(xiàn)各種典型癥狀，如不喜進(jìn)食，在池邊來回游動，體色變紅，對外界反映遲鈍，經(jīng)解剖可見肝胰腺腫大，大多數(shù)病蝦頭胸甲膨大，易被剝離，甲殼上出現(xiàn)明顯的白色斑點(diǎn)。
·
對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)是一種無包涵體的桿狀病毒，外面包有一層囊膜，一端有尾狀突出，核衣殼為(330-350)nmX (58-67) nm，WSSV的DNA是雙鏈結(jié)構(gòu)。完整的WSSV-中國株有12條主要多肽。通過氨基酸測序和反向遺傳學(xué)確定WSSV病毒粒子的5種結(jié)構(gòu)蛋白。這5種結(jié)構(gòu)蛋白分別是主要囊膜蛋白VP28和VP19，主要核衣殼蛋白VP26，VP24和VP15。WSSV經(jīng)口感染和浸泡感染同時存在；對上皮組織和造血組織有較強(qiáng)的嗜性。WSSV宿主范圍廣泛，世界上所有種類的人工養(yǎng)殖對蝦、大部分野生蝦蟹類都是WSSV的宿主，在糠蝦、白蝦、毛蝦、螃蟹、橈足類、海葵甚至昆蟲體內(nèi)都有WSSV的檢出。在最近20余年來，對蝦白斑綜合癥席卷了全球的對蝦養(yǎng)殖地區(qū)，給世界對蝦養(yǎng)殖也造成了不可估量的損失。高密度的對蝦養(yǎng)殖規(guī)模，日益惡化的環(huán)境和世界性的貿(mào)易都加劇了此病的發(fā)生與傳播。國內(nèi)外，對WSSV的病原學(xué)、流行病學(xué)、診斷學(xué)、感染機(jī)理等方面的研究早已深入到了分子水平，目前研究熱點(diǎn)集中在WSSV結(jié)構(gòu)和功能基因的分析及探明分子水平致病機(jī)理。迄今為止已有許多學(xué)者對其進(jìn)行了研究，但諸多問題仍未克服，WSS尚無有效的治療方法。簡單易行的病原繁殖體系是研究的基礎(chǔ)。要建立預(yù)防和控制白斑綜合癥病毒感染的有效方法，一個重要的前提條件是要有穩(wěn)定而純凈的病毒來源，最好的方法就是對其進(jìn)行體外培養(yǎng)。病毒培養(yǎng)常采用細(xì)胞系和雞胚培養(yǎng)進(jìn)行。但是目前還沒有合適的細(xì)胞系來進(jìn)行WSSV的體外培養(yǎng)，國內(nèi)外研究者們嘗試采用組織、原代細(xì)胞培養(yǎng)的方法，這些方法存在著組織、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不成熟、不能傳代、成本及實(shí)驗(yàn)條件要求較高等問題。目前最主要的WSSV增值模式是采用人工感染動物模型來進(jìn)行，較成熟的WSSV動物模型主要有克氏原螯蝦。雖然克氏原螯蝦作為動物模型已經(jīng)運(yùn)用得比較成熟，但是由于水域環(huán)境復(fù)雜，螯蝦易感病毒范圍廣的影響，使得克氏原螯蝦存在著帶有其他病毒的隱患，此外采用動物模型作為病毒增殖的媒介會受到養(yǎng)殖管理和養(yǎng)殖條件等因素影響。因此要對WSSV進(jìn)行深入的研究，就必須建立更為穩(wěn)定、便捷的體外培養(yǎng)方法。雞胚培養(yǎng)是一種廣泛運(yùn)用于哺乳動物病毒、禽類病毒等的培養(yǎng)方法，如授權(quán)公告號為CN101633911A，公告日為2010年I月27日，發(fā)明名稱為“適合于大規(guī)模生產(chǎn)人用禽流感疫苗的純化技術(shù)中病毒的培養(yǎng)方法”，就采用了 9-11日齡無畸形、血管清晰、活動的健康雞胚進(jìn)行病毒培養(yǎng)，這種培養(yǎng)方法可為規(guī)?；a(chǎn)人用禽流感病毒裂解疫苗提供足夠的、合格的禽流感病毒。但是，病毒雞胚培養(yǎng)多見于一些高等動物病毒的培養(yǎng)，在水生動物病毒領(lǐng)域的研究應(yīng)用更是鮮見報道。目前，國內(nèi)外還沒有關(guān)于利用雞胚培養(yǎng)方法培養(yǎng)蝦病毒包括對蝦白斑綜合癥病毒的方法的相關(guān)研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種首次將雞胚培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于對蝦白斑綜合癥病毒的培養(yǎng)，可實(shí)現(xiàn)對蝦白斑綜合癥病毒快速、有效的體外傳代培養(yǎng)且穩(wěn)定、便捷的對蝦白斑綜合癥病毒的雞胚培養(yǎng)方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種對蝦白斑綜合癥病毒的雞胚培養(yǎng)方法，其特征在于采用SPF雞胚作為對蝦白斑綜合癥病毒的體外培養(yǎng)體系，選擇6-7日齡健康雞胚，將預(yù)先制備除菌了的對蝦白斑綜合癥病毒接種液接種至雞胚尿囊膜上，收集培養(yǎng)時間為5-10天的死亡雞胚進(jìn)行勻漿離心分離，得到含對蝦白斑綜合癥病毒的上清液?！ひ环N對蝦白斑綜合癥病毒的雞胚培養(yǎng)方法，具體的操作步驟如下
(1)選取符合SPF規(guī)格的新鮮種蛋，氣室向上38°C孵化，相對濕度50%，每4小時翻蛋一次，培養(yǎng)6-7天后，選取血管粗大且呈鮮紅色的健康發(fā)育良好的雞胚在暗室內(nèi)畫出氣室邊緣并標(biāo)明大血管所處位置，以備病毒接種用；
(2)選取患白斑綜合癥的日本對蝦若干只，取甲殼和內(nèi)臟，按質(zhì)量體積比Ig=IOml的比例將甲殼和內(nèi)臟加入到PH為7. 4的O. I M的PBS緩沖液，于勻漿器中勻漿，將勻漿液于4°C，6000g離心20min后取含病毒的上清液，將離心所得的沉淀用I 2ml的O. IM的PBS重懸，再次勻漿，將再次勻漿得到的勻漿液于4°C，6000g，離心20min，合并兩次離心所得的上清液，將合并所得上清液先用O. 45 μ m的濾膜抽濾除去組織碎片，再用O. 22 μ m的濾膜抽濾除菌，除菌后的上清液每毫升加入1000單位青霉素和IOOOug鏈霉素后，于4°C冰浴過夜處理，即得到對蝦白斑綜合癥病毒接種液；
(3)選取健康，發(fā)育良好的6-7日齡的雞胚，將對蝦白斑綜合癥病毒接種液按接種量O. 15 O. 2ml接種到雞胚的尿囊膜上；將已接種了病毒的雞胚于33°C的恒溫條件下培養(yǎng)13 14天，收集培養(yǎng)時間為5 10天的死亡雞胚；
(4)將步驟(3)得到的死亡雞胚分離出尿囊膜與尿囊液，按質(zhì)量體積比Ig=IOml的比例將尿囊膜與尿囊液的混合物加入到PH為7. 4的O. I M的PBS緩沖液，重復(fù)步驟(2)即得到含對蝦白斑綜合癥病毒的上清液。步驟(2)中采用的PBS緩沖液配制方法是8g NaCl,O. 2gKCl，3. 62gNa2PO4 12H20,0. 24g KH2PO4,加入800ml雙蒸水完全溶解，調(diào)節(jié)PH至7. 4，加入雙蒸水定容至1000ml,高壓滅菌。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明首次提出了對蝦白斑綜合癥病毒的雞胚培養(yǎng)方法，該方法具有如下優(yōu)點(diǎn)
(I)用雞胚培養(yǎng)的方法培養(yǎng)WSSV，避免了細(xì)胞培養(yǎng)成本高、易污染且不能進(jìn)行傳代培養(yǎng)的缺點(diǎn)；本發(fā)明培養(yǎng)的病毒其毒力與原代病毒毒力相當(dāng)，未出現(xiàn)弱化，可用于該病毒的繼續(xù)傳代以及其他任何針對該病毒的研究。
(2)所用雞胚在當(dāng)?shù)赜袑ｉTSPF養(yǎng)殖場供應(yīng)，獲取方便，成本較低，一年四季均可培養(yǎng)。(3)電鏡結(jié)合PCR的檢測方法更方便、準(zhǔn)確的檢測雞胚中病毒的存在與含量，為病毒培養(yǎng)體系建立成功與否提供了一個更便捷的驗(yàn)證途徑。(4)接種了對蝦白斑綜合癥病毒的雞胚在上述相應(yīng)的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間下，病毒能得到較好的繁殖。 (5)相對于現(xiàn)今利用最多的細(xì)胞培養(yǎng)而言，病毒的雞胚培養(yǎng)比細(xì)胞培養(yǎng)容易成功，操作簡單。也比接種動物的來源容易，成本低廉，無飼養(yǎng)管理和隔離等特殊要求。無需特殊的設(shè)備或條件。另外SPF雞胚無病毒隱性感染，同時雞胚的敏感范圍很廣，多種病毒均能適用，且不會產(chǎn)生抗體，是我們建立一種新的、簡便的病毒培養(yǎng)方法的不二之選。具有很高的科研價值和現(xiàn)實(shí)意義。綜上所述，本發(fā)明對蝦白斑綜合癥病毒的雞胚培養(yǎng)方法提供一種更高效、更適用的WSSV體外培養(yǎng)方法，以對WSSV進(jìn)行快速、有效的體外傳代培養(yǎng)，克服了在WSSV培養(yǎng)過程無合適培養(yǎng)體系，現(xiàn)有培養(yǎng)方法難以進(jìn)行病毒傳代培養(yǎng)的問題，因此雞胚培養(yǎng)方法在WSSV中的應(yīng)用將填補(bǔ)水產(chǎn)動物病毒雞胚培養(yǎng)體系的空白，并為以后的研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。


圖I為接種WSSV培養(yǎng)后頻死雞胚卵黃囊膜超薄切片圖，箭頭示W(wǎng)SSV ；
圖2為雞胚組織中WSSV的PCR檢測結(jié)果；圖中從左至右的3條泳道依次為1)Marker, 2)健康沒有接種病毒的雞胚組織，3)病毒接種的雞胚組織。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例對本發(fā)明作了進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此，保護(hù)范圍以權(quán)力要求為準(zhǔn)。本發(fā)明一種對蝦白斑綜合癥病毒的雞胚培養(yǎng)方法，采用SPF雞胚作為對蝦白斑綜合癥病毒的體外培養(yǎng)體系，選擇預(yù)先培養(yǎng)了 6-7天的健康雞胚，將預(yù)先制備除菌了的對蝦白斑綜合癥病毒接種液接種至雞胚尿囊膜上，收集培養(yǎng)時間為5-10天的死亡雞胚進(jìn)行勻漿離心分離，得到含對蝦白斑綜合癥病毒的上清液。其具體培養(yǎng)方法如下
(1)選取符合SPF規(guī)格的新鮮種蛋，氣室向上38°C孵化，相對濕度50%，每4小時翻蛋一次，培養(yǎng)6-7天后，選取血管粗大且呈鮮紅色的健康發(fā)育良好的雞胚在暗室內(nèi)畫出氣室邊緣并標(biāo)明大血管所處位置，以備病毒接種用；
(2)選取患白斑綜合癥的日本對蝦若干只，取甲殼和內(nèi)臟，按質(zhì)量體積比Ig=IOml的比例將甲殼和內(nèi)臟加入到PH為7. 4的O. I M的PBS緩沖液，于勻漿器中勻漿，將勻漿液于4°C，6000g離心20min后取含病毒的上清液，將離心所得的沉淀用I 2ml的O. IM的PBS重懸，再次勻漿，將再次勻漿得到的勻漿液于4°C，6000g，離心20min，合并兩次離心所得的上清液，將合并所得上清液先用O. 45 μ m的濾膜抽濾除去組織碎片，再用O. 22 μ m的濾膜抽濾除菌，除菌后的上清液每毫升加入1000單位青霉素和IOOOug鏈霉素后，于4°C冰浴過夜處理，即得到對蝦白斑綜合癥病毒接種液；(3)選取健康，發(fā)育良好的6-7日齡的雞胚，將對蝦白斑綜合癥病毒接種液按接種量O. 15-0. 2ml接種到雞胚的尿囊膜上；將已接種了病毒的雞胚于33°C的恒溫條件下培養(yǎng)13-14天，收集培養(yǎng)時間為5-10天的死亡雞胚；
(4)將步驟(3)得到的死亡雞胚分離出尿囊膜與尿囊液，按質(zhì)量體積比Ig=IOml的比例將尿囊膜與尿囊液的混合物后加入到PH為7. 4的O. I M的PBS緩沖液，重復(fù)步驟(2)即得到含對蝦白斑綜合癥病毒的上清液。步驟(2)中采用的PBS緩沖液配制方法是8g NaCl,O. 2gKCl，3. 62gNa2PO4 12H20,0. 24g KH2PO4,加入800ml雙蒸水完全溶解，調(diào)節(jié)PH至7. 4，加入雙蒸水定容至1000ml,高壓滅菌。電鏡觀察各組織中病毒粒子情況(圖I)。結(jié)合WSSV特異引物用PCR的方法進(jìn)行輔助檢測(圖2)。

從圖I中我們可以觀察到大量的桿狀病毒粒子，這些病毒粒子無論在形態(tài)還是大小上都與純化的WSSV以及對蝦組織中的WSSV的形態(tài)和大小相同。初步說明本發(fā)明中使用的雞胚培養(yǎng)WSSV的方法獲得成功。根據(jù)對蝦白斑綜合癥病毒的基因序列(參考文獻(xiàn)Xie, X.，Li, H., Xu, L.，andYang, F. (2005). A simple and efficient method for purification of intact whitespot syndrome virus (WSSV) viral particles. Virus Research 108(1-2)，63-67.)設(shè)計(jì)一對引物進(jìn)行PCR檢測，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為300bp，
引物 F: 5，-TATTGTCTCTCCTGACGTAC-3，
引物 R :5’ -CACATTCTTCACGAGTCTAC-3’
利用該對引物對接種了病毒的雞胚樣進(jìn)行PCR，PCR結(jié)果經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，經(jīng)EB染色顯示擴(kuò)增出了 300bp的條帶，條帶大小與預(yù)期相符。圖2結(jié)果進(jìn)一步證明了接種了WSSV的雞胚在經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后確實(shí)存在WSSV。從培養(yǎng)病毒成功的雞胚中純化病毒后回歸接種感染對蝦成功，致死率100%，臨床癥狀與自然發(fā)病死亡對蝦相同，說明病毒經(jīng)雞胚培養(yǎng)后病毒毒力沒有減弱，這進(jìn)一步證明了本發(fā)明中涉及的利用雞胚進(jìn)行WSSV體外培養(yǎng)的方法是可行的。通過采用雞胚培養(yǎng)的途徑，成功的對WSSV進(jìn)行了體外培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1.一種對蝦白斑綜合癥病毒的雞胚培養(yǎng)方法，其特征在于采用SPF雞胚作為對蝦白斑綜合癥病毒的體外培養(yǎng)體系，選擇預(yù)先培養(yǎng)了 6-7天的健康雞胚，將預(yù)先制備除菌了的對蝦白斑綜合癥病毒接種液接種至雞胚尿囊膜上，收集培養(yǎng)時間為5-10天的死亡雞胚進(jìn)行勻漿離心分離，得到含對蝦白斑綜合癥病毒的上清液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的對蝦白斑綜合癥病毒的雞胚培養(yǎng)方法，其特征在于具體的操作步驟如下 (1)選取符合SPF規(guī)格的新鮮種蛋，氣室向上38°C孵化，相對濕度50%，每4小時翻蛋一次，培養(yǎng)6-7天后，選取血管粗大且呈鮮紅色的健康發(fā)育良好的雞胚在暗室內(nèi)畫出氣室邊緣并標(biāo)明大血管所處位置，以備病毒接種用； (2)選取患白斑綜合癥的日本對蝦若干只，取甲殼和內(nèi)臟，按質(zhì)量體積比lg:10ml的比例將甲殼和內(nèi)臟加入到PH為7. 4的0. I M的PBS緩沖液，于勻漿器中勻漿，將勻漿液于40C，6000g離心20min后，取含病毒的上清液，將離心所得的沉淀用I 2ml的0. IM的PBS重懸，再次勻漿，將再次勻漿得到的勻漿液于4°C，6000g，離心20min，合并兩次離心所得的上清液，將合并所得上清液先用0. 45 y m的濾膜抽濾除去組織碎片，再用0. 22 y m的濾膜抽濾除菌，除菌后的上清液每毫升加入1000單位青霉素和IOOOug鏈霉素后，于4°C冰浴過夜處理，即得到對蝦白斑綜合癥病毒接種液； (3)選取健康，發(fā)育良好的6-7日齡的雞胚，將對蝦白斑綜合癥病毒接種液按接種量0.15-0. 2ml接種到雞胚的尿囊膜上，將已接種了病毒的雞胚于33 °C的恒溫條件下培養(yǎng)13-14天，收集培養(yǎng)時間為5-10天的死亡雞胚； (4)將步驟(3)得到的死亡雞胚分離出尿囊膜與尿囊液，按質(zhì)量體積比Ig=IOml的比例將尿囊膜與尿囊液的混合物加入到PH為7. 4的0. I M的PBS緩沖液，重復(fù)步驟(2)即得到含對蝦白斑綜合癥病毒的上清液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的對蝦白斑綜合癥病毒的雞胚培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(2)中采用的PBS緩沖液配制方法是8g NaCl,0. 2gKCl,3. 62g Na2P04 12H20,0. 24g KH2PO4,力口A 800ml雙蒸水完全溶解，調(diào)節(jié)PH至7. 4，加入雙蒸水定容至1000ml，高壓滅菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了對蝦白斑綜合癥病毒的雞胚培養(yǎng)方法，特點(diǎn)是采用SPF雞胚作為對蝦白斑綜合癥病毒的體外培養(yǎng)體系，選擇預(yù)先培養(yǎng)了6-7天的健康雞胚，將預(yù)先制備除菌了的對蝦白斑綜合癥病毒接種液接種至雞胚尿囊膜上，收集培養(yǎng)時間為5-10天的死亡雞胚進(jìn)行勻漿離心分離，得到含對蝦白斑綜合癥病毒的上清液，優(yōu)點(diǎn)是提供一種更高效、更適用的WSSV體外培養(yǎng)方法，以對WSSV進(jìn)行快速、有效的體外傳代培養(yǎng)，克服了在WSSV培養(yǎng)過程無合適培養(yǎng)體系，現(xiàn)有培養(yǎng)方法難以進(jìn)行病毒傳代培養(yǎng)的問題，因此雞胚培養(yǎng)方法在WSSV中的應(yīng)用將填補(bǔ)蝦病毒雞胚培養(yǎng)體系的空白，并為以后的研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12N7/02GK102787099SQ20121001877
公開日2012年11月21日 申請日期2012年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月20日
發(fā)明者劉聯(lián)國, 周永強(qiáng), 彭嬌, 李登峰, 陳炯, 顧曉英 申請人:寧波大學(xué)