專利名稱：一種從綿羊毛囊組織中提取總rna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明屬于RNA制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從綿羊毛囊組織中提取總RNA的方法。
背景技術(shù)：
:RNA是一種多功能分子，它作為DNA轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物及蛋白質(zhì)的翻譯模板，與DNA、蛋白質(zhì)及RNA本身都存在許多互作。不同的RNA在生化過程中充當(dāng)著信使、酶及結(jié)構(gòu)組分等多種角色，在生命活動(dòng)的各環(huán)節(jié)發(fā)揮著重要的作用。隨著生物技術(shù)及計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的方法可用于RNA的檢測(cè)與研究，RNA種類及功能的多樣性也不斷的被發(fā)現(xiàn)。隨著研究的深入，人們也意識(shí)到RNA的研究在揭示生命過程本質(zhì)及疾病治療等方面都有著重要意義。欲對(duì)RNA進(jìn)行研究，首先要從組織中提取得到高質(zhì)量的RNA。但RNA與DNA不同，極容易發(fā)生降解，RNA降解將對(duì)后續(xù)研究的真實(shí)性及可靠性產(chǎn)生極大的影像。引起RNA降解的主要因素是RNA酶(章國衛(wèi)等，真核細(xì)胞中mRNA的降解機(jī)制；遺傳；1999，21 (6):49-53.)。RNA酶有2種來源，一種是外源性的，一種是內(nèi)源性的。因此在采集用于RNA提取的樣品時(shí)，重點(diǎn)就在于如何防止外源性RNA酶污染及抑制內(nèi)源性RNA酶活性上。外源性RNA酶可以通過DEPC等RNA酶抑制劑處理實(shí)驗(yàn)用品以及嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)操作和試驗(yàn)環(huán)境的控制來加以排除。而內(nèi)源性RNA酶卻很難去除，只能通過液氮或干冰制造低溫或者組織樣品保護(hù)液浸泡的方法來進(jìn)行抑制(Mutter, G.L.et al.(2004).Comparison of frozen and RNALater solidtissue storage methods for use in RNA expression microarrays.BMC Genomics.5:88)。但對(duì)于某些組織來說，這樣的處理很難達(dá)到預(yù)期效果，比如毛囊組織。由于毛囊組織體積極小，使用液氮凍存后不方便研磨，且角質(zhì)化程度高，使用組織樣品保護(hù)液無法快速滲透到組織內(nèi)部，起不到抑制RNA酶的效果。這些都是影響毛囊組織RNA提取產(chǎn)量及質(zhì)量的重要因素，特別是在野外現(xiàn)場(chǎng)對(duì)綿羊等動(dòng)物進(jìn)行毛囊采集時(shí)這種問題尤為明顯，這些問題都阻礙了對(duì)毛囊組織基因RNA水平表達(dá)研究的進(jìn)展。本發(fā)明就是為了解決以上難題而提供了一種從現(xiàn)場(chǎng)樣品采集開始，包括樣品運(yùn)輸、保存，到RNA提取的綿羊毛囊組織RNA提取方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供了一種獲得高質(zhì)量RNA的方法。本發(fā)明提取的綿羊毛囊組織總RNA，不被外源或內(nèi)源RNA酶降解到最低限度，能最大限度地保持被提取的總RNA的純度，以利于后續(xù)試驗(yàn)的利用。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單方便，成本低，無需液氮和RNA樣品保護(hù)液。本發(fā)明獲得的毛囊組織總RNA純度高、完整度好，可用于反轉(zhuǎn)錄cDNA、PCR、QPCR等下游操作及mRNA與microRNA的檢測(cè)等分子生物學(xué)的操作應(yīng)用。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述:(1)現(xiàn)場(chǎng)采集毛囊組織及處理:
a)在活體狀態(tài)下，從綿羊體側(cè)成股拔取羊毛，用剪刀在距離羊毛根部毛囊泡Icm處將羊毛剪斷，收集毛囊至裝有700 μ L TRIzol的1.5mL錐形底離心管中，收集量至毛囊組織總體積占TRIzol液體體積的1/3即可；b)立刻用小型塑料研磨杵在離心管內(nèi)研磨lmin，向離心管內(nèi)補(bǔ)充300 μ L TRIzol使1.5mL離心管內(nèi)的TRIzoI總量達(dá)lmL，蓋好蓋子甩動(dòng)離心管讓毛囊完全浸泡在TRIzoI液體中，將離心管放入離心管盒內(nèi)，即完成采集；c)在避光條件下，于24小時(shí)內(nèi)將研磨后裝有樣品的離心管放入-20°c暫時(shí)凍存。(2)樣品運(yùn)輸:將裝有樣品的離心管從_20°C取出放入泡沫盒，同時(shí)放入足夠量的冰袋，密封后進(jìn)行運(yùn)輸，使運(yùn)輸過程中的冰袋不完全融化為準(zhǔn)。(3)樣品保存在室溫下解凍浸泡在TRIzol中的樣，于4°C 12000rpm離心lOmin,吸取TRIzol液體至新離心管，此時(shí)，TRIzol液體可放入_80°C保存，至少I個(gè)月毛囊RNA不會(huì)降解。(4) RNA 提取:a)在室溫下解凍由步驟(3)中凍存的TRIzol樣品液體，向每ImL TRIzol樣品中加入200 μ L氯仿，劇烈 震蕩混勻20s，室溫靜置5min ；b)于4°C 12000rpm離心15min,取400 μ L所得上清至新離心管;c)向所得上清中加入400 μ L異丙醇，上下顛倒混勻10次，室溫靜置IOmin ；d)于4°C 12000rpm離心lOmin,可見管底有白色沉淀,棄液體；e)向離心管中加入ImL 75%濃度的乙醇溶液(該乙醇溶液用RNase-Free ddH20稀釋配制，使乙醇溶液的終濃度至75% )，用手指彈動(dòng)離心管底，讓沉淀懸浮于液體之中；f)于4°C 7500rpm離心5min，棄液體。用槍頭吸干管底殘液，不要觸及沉淀，避免將沉淀吸走；g)室溫晾干沉淀后,用RNase-Free ddH20溶解沉淀,得到綿羊毛囊組織總RNA樣品O其中上述實(shí)驗(yàn)所用到所有耗材均經(jīng)由0.1 %濃度的焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液浸泡8h后12CTC高壓蒸汽滅菌30min。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:簡(jiǎn)單方便，成本低，無需液氮及RNA組織樣品保護(hù)液，易于在羊場(chǎng)等野外環(huán)境下操作。所得到的總RNA完整度高，質(zhì)量好，可用于下游的反轉(zhuǎn)錄cDNA、PCR或QPCR等實(shí)驗(yàn)。


序列表SEQID NO:1是本發(fā)明的應(yīng)用實(shí)施例中擴(kuò)增的18S基因的部分核苷酸序列(119bp)。序列表SEQID NO:2是本發(fā)明的應(yīng)用實(shí)施例中擴(kuò)增的GAPDH基因的部分核苷酸序列(15Ibp)。序列表SEQID NO:3是本發(fā)明的應(yīng)用實(shí)施例中擴(kuò)增的KRTAP11.1基因的部分核苷酸序列(127bp)。序列表SEQID NO:4和5是應(yīng)用實(shí)施例中擴(kuò)增18S基因片段的引物序列(上、下游引物)。序列表SEQ ID NO:6是應(yīng)用實(shí)施例中擴(kuò)增GAPDH基因片段的引物序列(上游引物)。序列表SEQ ID NO:7和8是應(yīng)用實(shí)施例中擴(kuò)增KRTAP11.1基因片段的引物序列(上、下游引物)。序列表SEQ ID NO:9是本發(fā)明的應(yīng)用實(shí)施例中擴(kuò)增的5S基因部分核苷酸序列(116bp)。序列表SEQ ID NO: 10是本發(fā)明的應(yīng)用實(shí)施例中擴(kuò)增的U6基因的部分核苷酸序列(91bp)。序列表SEQ ID NO:11和12是本發(fā)明的應(yīng)用實(shí)施例中擴(kuò)增5S基因片段的引物序列(上、下游引物)。序列表SEQ ID NO:13和14應(yīng)用實(shí)施例中擴(kuò)增U6基因片段的引物序列(上、下游引物)。序列表SEQ ID NO:15和16是應(yīng)用實(shí)施例中擴(kuò)增miR_31基因片段的引物序列(上、下游引物)。序列表SEQ ID NO: 17是應(yīng)用實(shí)施例中擴(kuò)增的miR_31基因的部分核苷酸序列(65bp)ο序列表SEQ ID NO:18是應(yīng)用實(shí)施例中反轉(zhuǎn)錄miR_31基因的莖環(huán)引物序列(44bp)。

序列表SEQ ID NO:19是應(yīng)用實(shí)施例中擴(kuò)增GAPDH基因片段的引物序列(下游引物)。圖1:毛囊采集時(shí)所用到的1.5mL離心管(如圖左所示)及小型塑料研磨杵(如圖右所示)。圖2:利用本發(fā)明提取的綿羊毛囊組織RNA電泳結(jié)果。泳道1、2、3分別對(duì)應(yīng)編號(hào)為1、2、3的三只不同的綿羊個(gè)體的毛囊組織RNA。圖3:18S、GAPDH、KRTAP11.1 基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。泳道M為 IOObp Marker,I為18S擴(kuò)增產(chǎn)物，2為GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物，3為KRTAP11.1擴(kuò)增產(chǎn)物。圖4:5S、U6、miR-31基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。泳道M為50bp Marker, I為5S擴(kuò)增產(chǎn)物，2為U6擴(kuò)增產(chǎn)物，3為miR-31擴(kuò)增產(chǎn)物。圖5:18S、GAPDH、KRTAP11.1基因QPCR擴(kuò)增曲線圖。圖中:縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為PCR循環(huán)數(shù)。其中:1為18S擴(kuò)增曲線，2為GAPDH擴(kuò)增曲線，3為KRTAPl1.1擴(kuò)增曲線。圖6:5S、U6、miR-31基因QPCR擴(kuò)增曲線圖。圖中:縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為PCR循環(huán)數(shù)。其中:1為5S擴(kuò)增曲線，2為U6擴(kuò)增曲線，3為miR-31擴(kuò)增曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:從西藏綿羊毛囊組織中提取總RNA本實(shí)驗(yàn)在西藏林芝地區(qū)羊場(chǎng)采樣，在湖北武漢華中農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行RNA提取。實(shí)驗(yàn)所用試劑包括=TRIzol購買于Invitrogen公司(貨號(hào):15596026) ；RNase-Free ddH20購買于天根生化科技有限公司(貨號(hào):RT121);焦碳酸二乙酯(DEPC)購買于Sigma公司(貨號(hào):D5758)。1.樣品采集(I)在羊場(chǎng)從綿羊體側(cè)成股拔取羊毛，用剪刀在距離羊毛根部毛囊泡Icm處將羊毛剪斷，收集毛囊至裝有700 μ L TRIzol液體的1.5mL錐形底離心管中。收集量為毛囊體積占TRIzoI液體體積的1/3。(2)用小型塑料研磨杵在離心管內(nèi)研磨lmin，向離心管內(nèi)補(bǔ)充300 μ L TRIzol，使毛囊全部浸泡在TRIzol液體中。樣品當(dāng)天在_20°C下過夜。2.樣品運(yùn)輸次日樣品同若干冰袋一起放入泡沫盒中進(jìn)行空運(yùn)，2日后到達(dá)實(shí)驗(yàn)室。開封檢查，冰袋并未完全融化。3.樣品保存將樣品解凍，于4°C 12000rpm離心lOmin,吸取TRIzol液體至新離心管,棄去沉淀毛囊。將吸出的TRIzoI液體樣品放入_80°C冰箱凍存。4.RNA 提取(I) I個(gè)月后，解凍TRIzoI液體樣品，向ImLTRIzol樣品中加入200 μ L氯仿，劇烈震蕩混勻20s，室溫靜置5min。(2)在4°C 12000rpm離心15min，取400 μ L所得上清至新離心管。

(3)向所得上清中加入400 μ L異丙醇，上下顛倒混勻10次，室溫靜置lOmin。(4)在4°C 12000rpm離心lOmin,可見管底有白色沉淀,棄液體。(5)向離心管中加入ImL 75%濃度的乙醇溶液(用RNase-Free ddH20配制，使乙醇溶液的終濃度至75% )，用手指彈動(dòng)離心管底，讓沉淀懸浮于液體之中。(6)在4°C 7500rpm離心5min，棄液體。用槍頭吸干管底殘液，不要觸及沉淀，避免將沉淀吸走。(7)室溫晾干沉淀后，用20 μ L RNase-Free ddH20溶解沉淀，得到毛囊組織總RNA樣品。(8)用該發(fā)明提取了 3只西藏綿羊的毛囊組織總RNA，濃度及純度檢測(cè)結(jié)果如表1，總RNA電泳結(jié)果見圖2。表1:3只西藏綿羊毛囊組織總RNA濃度及純度檢測(cè)
樣品編號(hào)濃度(ng/μΙ.)OD260/280OD260/230
_I_90.76_L99_h90_
2 97.62 1.99 1.93_3_90.94_Z03_h95_從結(jié)果可以看出，使用本發(fā)明提取的RNA純度較高，電泳得到的28S、18S、5S條帶清晰，28S條帶亮度近似18S的2倍，說明RNA完整度良好，無明顯降解現(xiàn)象。說明使用本發(fā)明可以獲得較高質(zhì)量的綿羊毛囊組織總RNA。實(shí)施例2:用本發(fā)明從綿羊毛囊組織中提取的總RNA進(jìn)行基因mRNA水平表達(dá)的PCR檢測(cè)1.使用實(shí)施例1中提取的毛囊組織總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。試劑使用寶生物工程大連有限公司的“P「imeSc「ipt RT reagent Kit With gDNA Eraser”試劑盒(貨號(hào):DRR047S)，儀器為Bio-red公司的MyCycler PCR儀。具體操作步驟如下:(I)基因組DNA的去除反應(yīng)，反應(yīng)體系(總體積)10 μ L，反應(yīng)液配方如下:
權(quán)利要求
1.一種從綿羊毛囊組織中提取總RNA的方法，其特征在于以下步驟: (1)現(xiàn)場(chǎng)采集: a)取綿羊毛囊至裝有700μ L TRIzol的1.5mL錐形底離心管中，毛囊組織的收集量至毛囊組織總體積占TRIzol液體體積的1/3 ； b)立刻用小型塑料研磨杵在離心管內(nèi)研磨lmin，向離心管內(nèi)補(bǔ)充300μ L TRIzol使1.5mL離心管內(nèi)的TRIzoI總量達(dá)ImL ;蓋好蓋子甩動(dòng)離心管讓毛囊完全浸泡在TRIzoI液體中，將離心管放入離心管盒內(nèi)，即完成采集； c)在避光條件下，于24小時(shí)內(nèi)將研磨后裝有樣品的離心管放入_20°C暫時(shí)凍存； (2)樣品運(yùn)輸: 將裝有樣品的離心管從_20°C取出放入泡沫盒，同時(shí)放入足夠量的冰袋，密封后進(jìn)行運(yùn)輸，使保證運(yùn)輸時(shí)冰袋中的冰不完全融化為準(zhǔn)； (3)樣品保存: 在室溫下解凍浸泡在TRIzol液體中的樣品，于4°C 12000rpm離心lOmin，吸取TRIzol液體至新離心管，將TRIzoI液體放入-80°C保存，保存期至少為I個(gè)月至毛囊RNA不被降解；(4)RNA 提取: a)在室溫下解凍由步驟(3)中凍存的TRIzoI樣品液體，向每ImLTRIzol樣品中加入`200 μ L氯仿，劇烈震蕩混勻20`s，于室溫下靜置5min ；` b)于4°C12000rpm離心15min，得上清，取400 μ L所得的上清至新的離心管； c)向所得的上清中加入400μ L異丙醇，上下顛倒混勻10次，于室溫下靜置IOmin ； d)于4°C12000rpm離心lOmin，可見管底有白色沉淀，棄液體，保留管底的白色沉淀； e)向離心管中加入ImL75%濃度的乙醇溶液，用手指彈動(dòng)離心管底，讓沉淀懸浮于液體之中； f)于4°C7500rpm離心5min，棄液體，用槍頭吸干管底殘液，不要觸及沉淀，避免將沉淀吸走；` g)于室溫下晾干沉淀后，用RNase-FreeddH20溶解沉淀，得到綿羊毛囊組織總RNA樣品O
全文摘要
本發(fā)明屬于RNA制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從綿羊毛囊組織提取總RNA的方法。其特征包括，從野外現(xiàn)場(chǎng)采集綿羊毛囊，樣品低溫運(yùn)輸、保存和RNA提取步驟得到毛囊總RNA。本發(fā)明提取毛囊總RNA，不會(huì)被外源或內(nèi)源RNA酶降解到最低限度，能最大限度地保持被提取的總RNA的純度，以利于后續(xù)試驗(yàn)的利用。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單方便，成本低，無需液氮和RNA樣品保護(hù)液。本發(fā)明獲得的毛囊組織總RNA純度高、完整度好，可用于反轉(zhuǎn)錄cDNA、PCR、QPCR等下游操作及mRNA與microRNA的檢測(cè)應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/10GK103243085SQ20121002376
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2012年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月3日
發(fā)明者余梅, 柳廣斌, 趙書紅, 李新云, 曹建華, 李小平, 李長(zhǎng)春, 朱猛進(jìn), 陳若男 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)