專利名稱：一種柞蠶卵巢細胞培養(yǎng)基及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及昆蟲解剖學、昆蟲組織培養(yǎng)學等領(lǐng)域，具體涉及ー種柞蠶卵巢細胞培養(yǎng)基、及其在柞蠶卵巢細胞體外培養(yǎng)技術(shù)中的應用。
背景技術(shù)：
昆蟲細胞培養(yǎng)是從昆蟲體內(nèi)取出細胞，模擬昆蟲體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使細胞生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的ー門技木。原代細胞因剛從組織中分離開，生物學特性未發(fā)生很大變化，仍保留原來的遺傳特性，也最接近和反映體內(nèi)生長特性，適宜用于藥物敏感性試驗、細胞分化等實驗研究。20世紀初，許多昆蟲學家嘗試過使用體外培養(yǎng)的昆蟲細胞作為科學研究的工具。最早進行昆蟲組織體外培養(yǎng)的是德國Richard Goldschmiedt (1915),他使用惜比古天香(Hyalophora cecropia)蛾的精子進行體外培養(yǎng)，用來觀察精子的發(fā)育(Goldschmidt and Kaiser，1915)。在20世紀30年代，美國Trager進行了家蠶(Bombyx mori)細胞原代培養(yǎng),首次研究了昆蟲細胞體外生長條件，家蠶細胞在培養(yǎng)基中的體外生存可維持3周。50年代，加拿大Wyatt改進了家蠶卵巢細胞培養(yǎng)條件，成功設(shè)計了昆蟲細胞培養(yǎng)基IPL-16。60年代，Grace等進ー步改良了昆蟲細胞培養(yǎng)基，至今已廣泛用于昆蟲細胞系的培養(yǎng)與研究。隨著細胞生物學和分子生物學的相互滲透，分子生物學實驗技術(shù)與細胞培養(yǎng)技術(shù)的結(jié)合，使細胞在闡明基因的結(jié)構(gòu)與功能、基因在細胞生長和分化中的作用等方面發(fā)揮了重要的作用。同吋，昆蟲細胞培養(yǎng)和分子生物學的應用對于了解昆蟲的生理和發(fā)育機制，昆蟲與真菌、微孢子蟲、細菌和病毒在細胞和分子水平的相互作用方面也起了重要作用。2002年錢永華等利用家蠶細胞研究家蠶微孢子蟲的形成、生活史和侵染家蠶的過程等。2004年肖仕全利用家蠶胚胎細胞系對家蠶類濃核病毒毒理進行了研究，早在1995年鄧寧等利用昆蟲細胞大規(guī)模培養(yǎng)進行桿狀病毒殺蟲劑的生產(chǎn)。由此可見，建立昆蟲細胞培養(yǎng)方法，對了解昆蟲與微孢子蟲、細菌和病毒等相互作用關(guān)系的ー些理論問題提供了技術(shù)手段；同時也為生物防治エ廠化生產(chǎn)昆蟲病毒制劑開辟了新途徑。昨蠶(Antheraea pernyi)是我國重要的經(jīng)濟昆蟲,遼寧是我國的主產(chǎn)區(qū)，姆年產(chǎn)量5萬噸左右。由于柞蠶以蛹滯育越冬，可長期保存。柞蠶絲除了可以織綢外，還可廣泛用于軍エ、化工、醫(yī)藥等方面；柞蠶蛹含有大量蛋白質(zhì)和氨基酸，營養(yǎng)豐富，也是深受人們喜愛的昆蟲食品；另外，由于柞蠶蛹、蛾、卵、幼蟲等四個不同變態(tài)階段中含有多種生物活性物質(zhì)，近年來又成為保健品、生物藥品等的重要原料；柞蠶蛹或細胞又是近年發(fā)展起來的基因工程中得重要的生物反應器，因此，人們對柞蠶的需求越來越多，其經(jīng)濟價值和社會效益也在不斷提高。但由于柞蠶放養(yǎng)在野外，經(jīng)受著各種病毒、細菌、微孢子蟲等病原微生物的侵襲，時有病害的發(fā)生，導致部分蠶農(nóng)減產(chǎn)甚至絕收，影響了蠶農(nóng)放養(yǎng)柞蠶的積極性，嚴重地阻礙了柞蠶生產(chǎn)的發(fā)展，而柞蠶細胞又是研究這些病害發(fā)病機理及病原侵染規(guī)律必要的工具與平臺，因此，開展柞蠶細胞培養(yǎng)方法研究，建立柞蠶卵巢細胞培養(yǎng)方法對發(fā)展柞蠶生產(chǎn)及相關(guān)研究具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了發(fā)展柞蠶生產(chǎn)及相關(guān)研究，本實驗室已對柞蠶蛹、幼蟲的卵巢細胞進行了大量的離體培養(yǎng)試驗，與此同時，研發(fā)了比較適合該細胞體外生長的培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法。本發(fā)明涉及的柞蠶卵巢細胞培養(yǎng)基的配制方法是，將配制好的氨基酸和糖混合貯藏液(MLM-AAS)、無機鹽貯藏液(MLM-Salt)、維生素貯藏液(MLM-Vit)和牛血清白蛋白、胎球蛋白等按一定比例混合，并調(diào)PH制得MLM-45培養(yǎng)基，用于柞蠶卵巢細胞培養(yǎng)前，加入胎牛血清和青鏈霉素混合液。通過多種實驗確定該細胞體外生長條件為培養(yǎng)溫度，pH值及滲透壓值，本發(fā)明為進行柞蠶生物學、柞蠶病原微生物及相關(guān)領(lǐng)域研究提供技術(shù)服務。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下本發(fā)明的一方面在于提供一種柞蠶卵巢細胞培養(yǎng)基MLM-45的組成成分，每配制IOOOmL,其具體組成成分及用量如下
5 倍濃縮的 MLM-AAS200 mL
10 倍濃縮的 MLM-Salt100 mL
1000 倍濃縮的 MLM-Vit 1 mL
牛血清白蛋白5.Og
胎球蛋白0.02g分別稱取上述組分，加蒸餾水至IOOOmL,調(diào)pH6. 2-6. 4，過濾除菌，4°C保存；其中(a)每配制IOOOmL的5倍濃縮的氨基酸和糖混合貯藏液，其具體組成成分及用量
如下
權(quán)利要求
1.一種柞蠶卵巢細胞培養(yǎng)基MLM-45，每配制IOOOmL,其具體組成成分及用量如下 .5 倍濃縮的 MLM-AAS200 mL .1O 倍濃縮的 MLM-Salt100 mL .1000 倍濃縮的 MLM-Vit I mL 牛血清白蛋白5.Og 胎球蛋白0.02g分別稱取上述組分，加蒸餾水至IOOOmLdM PH6. 2-6. 4，過濾除菌，4°C保存；其中(a)每配制IOOOmL的5倍濃縮的MLM-AAS，其具體組成成分及用量如下5倍濃縮的MLM-AAS成分用量(單位g) L-Cystine0.28 L-Tyrosine0.425 a-Alanine1.55 β-Alanine1.05L-Arginine-HCl3.45 L-Aspartic acid3.75 L-Asparagine3.75 L-Glutamic acid4.5 L-Glutamine4.5 L-Glycine2.3 L-Histidine4.25 L-Isoleucine2.6 L-Leucine0.405 L-Lysine-HCl3.25 L-Methionine2.25L-Phenylalanine3.4 L-Proline1.95 DL-Serine2.65 L-Threonine0.8L-Tryptophan0.425 L-Valine2.5 Glucose12.5 Fructose2.5 Sucrose87.5分別稱取上述組分，加蒸餾水至lOOOmL，過濾除菌，_20°C保存；(b)每配制1OOOmL的10倍濃縮的MLM-Salt，其具體組成成分及用量如下
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的MLM-45培養(yǎng)基，其特征在于用10mol/LKOH調(diào)整pH。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的MLM-45培養(yǎng)基，其特征在于用O.22 μ m或O. 45 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
4.如權(quán)利要求1、2或3中任一項所述的MLM-45培養(yǎng)基在培養(yǎng)細胞中的應用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于培養(yǎng)柞蠶卵巢細胞的條件為 使用前，向MLM-45培養(yǎng)基中，按20 %的體積比加入胎牛血清，按I %的體積比加入青鏈霉素混合液；青鏈霉素混合液中青霉素、鏈霉素的濃度均為10，000單位/mL ； 細胞培養(yǎng)溫度為26 28°C ; 細胞培養(yǎng)pH為6. 2 6. 4 ; 細胞培養(yǎng)滲透壓值為315-350m0sm/kg。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于培養(yǎng)柞蠶卵巢細胞的條件為細胞培養(yǎng)溫度為27°C ；細胞培養(yǎng)PH為6. 3 ; 細胞培養(yǎng)滲透壓值為325mOsm/kg。
全文摘要
本發(fā)明公開一種柞蠶卵巢細胞培養(yǎng)基的組成成分、配制方法及其在柞蠶卵巢細胞培養(yǎng)中的應用。將配制好的氨基酸和糖混合貯藏液(MLM-AAS)、無機鹽貯藏液(MLM-Salt)、維生素貯藏液(MLM-Vit)和牛血清白蛋白、胎球蛋白等按一定比例配制，并調(diào)pH為6.2-6.4，制得MLM-45培養(yǎng)基，用于柞蠶卵巢細胞培養(yǎng)前，按20％體積比加入胎牛血清和1％體積比的青鏈霉素混合液。通過多種實驗確定該細胞體外生長條件為培養(yǎng)溫度26-28℃，pH6.2～6.4；滲透壓315-350mOsm/kg。本發(fā)明為進行柞蠶生物學、柞蠶病原微生物及相關(guān)領(lǐng)域研究提供技術(shù)服務。
文檔編號C12N5/071GK102618487SQ20121002705
公開日2012年8月1日 申請日期2012年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月7日
發(fā)明者岳冬梅, 李樹英, 王林美, 范琦 申請人:遼寧省農(nóng)業(yè)科學院大連生物技術(shù)研究所