專利名稱：三維空間細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)和組織工程領(lǐng)域，具體涉及一種三維空間細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)制備方法及其在組織細(xì)胞和新生器官培養(yǎng)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
組織細(xì)胞培養(yǎng)是研究正常、病變和惡性細(xì)胞的一個(gè)重要方法。利用組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可在體外的特定條件下觀察、設(shè)定或改變不同類型的細(xì)胞的激活、增生、分化、移行、 成熟、衰老、脫落乃至細(xì)胞死亡的整個(gè)過(guò)程和其調(diào)控機(jī)制。在過(guò)去的50多年中組織細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的發(fā)展和臨床治療的改進(jìn)起了重要的推動(dòng)作用。臨床所見到的多種疾病或外傷均可引起細(xì)胞的變性壞死或損傷，進(jìn)而導(dǎo)致組織器官的功能受損或喪失。這是人類疾病和死亡的主要原因。同時(shí)也是目前人類對(duì)許多疾病， 由其是對(duì)一些嚴(yán)重危害人類健康和生命的常見病和多發(fā)病缺乏有效治療方法的根本性原因。例如臨床所用的各種治療方法對(duì)糖尿病，慢性肝炎，肝硬化，多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，如巴金森氏病，老年癡呆癥，中風(fēng)和脊髓受傷，以及各種癌癥僅能取得對(duì)癥治療，緩解癥狀的效果。因?yàn)檫@些治療方法通常并不能取代變性壞死的細(xì)胞，也不能恢復(fù)組織器官的正常結(jié)構(gòu)和其功能。所以難以達(dá)到從根本上治愈這些疾病的目的。而組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)本身也生產(chǎn)大量的各種不同類型的細(xì)胞，這些組織細(xì)胞可作為細(xì)胞治療的來(lái)源，用以治療許多傳統(tǒng)性藥物治療所不能治愈的急性和慢性疾病,包括多種退行性和變性性疾病。這些細(xì)胞可直接用于細(xì)胞移植，或種植在生物可降解材料上再回植入機(jī)體，以達(dá)到用來(lái)取代變性壞死的組織細(xì)胞，修復(fù)組織器官的結(jié)構(gòu)和恢復(fù)其正常的功能。傳統(tǒng)的組織細(xì)胞培養(yǎng)方法是在平面，也就是二維空間狀態(tài)下培養(yǎng)細(xì)胞，這是一種簡(jiǎn)便易行的方法，便于觀察所要研究的被培養(yǎng)的細(xì)胞，并可獲得一定程度的細(xì)胞的增生。但細(xì)胞在這種狀態(tài)下生長(zhǎng)很容易發(fā)生擁擠現(xiàn)象，導(dǎo)致細(xì)胞之間的接觸抑制、同時(shí)暴露于培養(yǎng)液的細(xì)胞表面積減少，細(xì)胞黏附面積有限。由于缺乏細(xì)胞和細(xì)胞之間，以及細(xì)胞和細(xì)胞基質(zhì)的交互作用這一體內(nèi)的細(xì)胞和組織生長(zhǎng)所特有的必要的條件，細(xì)胞的增生受到一定的限制，細(xì)胞的功能低下，不能達(dá)到類似于活體狀態(tài)下的組織構(gòu)架的形成和細(xì)胞功能的充分表達(dá)。盡管人們作了一些改進(jìn)，例如將細(xì)胞培養(yǎng)在與基底膜成分有關(guān)的自然物質(zhì)上，比如讓細(xì)胞生長(zhǎng)在膠原和其它細(xì)胞基質(zhì)上，但仍不能獲得細(xì)胞的長(zhǎng)期生長(zhǎng)和終末期分化，以及細(xì)胞功能的充分表達(dá)。因此二維空間的單層細(xì)胞培養(yǎng)并不能產(chǎn)生三維的組織和器官，而只是細(xì)胞的伸展，細(xì)胞常常變?yōu)榍贩只募?xì)胞并缺乏正常細(xì)胞所應(yīng)有的功能。三維組織細(xì)胞的培養(yǎng)是將細(xì)胞培養(yǎng)在事先準(zhǔn)備好的三維細(xì)胞培養(yǎng)材料或支架上， 或是生物可降解的三維空間結(jié)構(gòu)中，然后再進(jìn)行培養(yǎng)。三維空間的結(jié)構(gòu)和環(huán)境可為細(xì)胞黏附提供更大的表面積，可以減少或者避免單層二維空間培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞接觸抑制。同時(shí)三維空間為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了類似于體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境，充分保障了細(xì)胞之間和細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的交互作用，有利于細(xì)胞的移行和運(yùn)動(dòng)，維持了分化細(xì)胞的表型?？傊M織細(xì)胞培養(yǎng)的三維空間結(jié)構(gòu)和環(huán)境促進(jìn)了細(xì)胞的黏附和增生，形態(tài)上的成熟，以及細(xì)胞功能的完善。目前所采用的各種不同三維空間的培養(yǎng)系統(tǒng)雖然比二維空間培養(yǎng)方法有了明顯的改善，但仍有一些不足之處。以膠原為支架的技術(shù)有一大限制，即由于位于支架深部的細(xì)胞缺乏營(yíng)養(yǎng)，細(xì)胞傾向于生長(zhǎng)在膠原支架的表面。如以Matrigel作為細(xì)胞外基質(zhì)時(shí)，所培養(yǎng)的細(xì)胞與這一基質(zhì)分離時(shí)要用酶來(lái)降解或溶解膠，這可造成細(xì)胞損傷。有些基質(zhì)缺乏良好的生物相容性，有可能導(dǎo)致細(xì)胞毒性，或致畸或致瘤作用。有些基質(zhì)的生物降解性較差， 不利于細(xì)胞種植治療和組織移植或植入。另外，大多支架材料不具有可透見性，難以對(duì)所培養(yǎng)的組織細(xì)胞直接進(jìn)行隨時(shí)和動(dòng)態(tài)觀察，尤其是在不破壞“標(biāo)本”的條件下。此外，目前所采用的三維空間培養(yǎng)系統(tǒng)尚未能獲得所培養(yǎng)的細(xì)胞能夠維持長(zhǎng)久細(xì)胞增殖。現(xiàn)有方法所產(chǎn)生的細(xì)胞數(shù)量尚不足，組織的大小或厚薄不夠，缺乏應(yīng)有的強(qiáng)度，尚不能成熟分化生長(zhǎng)成類似于正常體內(nèi)組織和器官所特有的形態(tài)。因此，迫切需要建立一個(gè)較為完善的三維組織細(xì)胞空間培養(yǎng)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)應(yīng)有利于細(xì)胞的增生和成熟，并且有利于對(duì)細(xì)胞的觀察以及有利于將細(xì)胞從培養(yǎng)系統(tǒng)中分離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種理想的三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，所述三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可為細(xì)胞提供一個(gè)近似于體內(nèi)生長(zhǎng)的三維空間。本發(fā)明的目的還在于提供所述三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的各種用途。在本發(fā)明的第一方面，提供一種三維細(xì)胞培養(yǎng)裝置，所述系統(tǒng)包括
Ca)容器，在容器內(nèi)裝有液態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)基；以及
(b)位于所述液態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)基中的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元，其中所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元內(nèi)包括用于培養(yǎng)的空腔以及界定所述空腔的空腔壁，所述的空腔壁含有有利于細(xì)胞黏附和長(zhǎng)期生長(zhǎng)的生物可降解的材料，并且所述的空腔壁可透過(guò)以下物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分、細(xì)胞代謝產(chǎn)物。在另一優(yōu)選例中，營(yíng)養(yǎng)成分包括但不限于氧氣、蛋白質(zhì)、糖、脂肪、維生素、激素。在另一優(yōu)選例中，代謝產(chǎn)物包括但不限于二氧化碳、細(xì)胞代謝產(chǎn)物。在另一優(yōu)選例中，所述的空腔壁含有80 - 100wt%的生物可降解材料。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的空腔的橫截面積為O. I-IOOmm2,長(zhǎng)度為 1-lOOOmm，所述空腔壁的厚度為O. I — 10mm。在另一優(yōu)選例中，所述的空腔壁的厚度為O. I — 6mm ;更優(yōu)選的，所述的空腔壁的厚度為O. I — 2_。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的空腔壁可透過(guò)液態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)基。在另一優(yōu)選例中，所述的空腔壁基本上沒有肉眼可見的孔(如直徑大于2mm孔)。
在另一優(yōu)選例中，所述的生物可降解的材料為在較高溫度下(如50-100°C)熔解， 常溫下(如25-37°C)凝固的材料；或在低溫下(如4°C)呈液態(tài)，常溫下(如25-37°C)凝固的材料。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的生物可降解的材料是生物可降解物質(zhì)形成的凝膠，其中所述的生物可降解物質(zhì)選自瓊脂、瓊脂糖、水凝膠、膠原，Matrigel、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的生物可降解的材料是可透見的，透明或半透明的生物可降解材料。在另一優(yōu)選例中，所述的生物可降解的材料中，生物可降解物質(zhì)的濃度為 O. l-10g/100ml生物可降解材料(即O. 1-10%) 較佳地，所述的生物可降解的物質(zhì)可用50-99. 99%以下物質(zhì)溶解水、生理鹽水、 PBS緩沖液、或含有細(xì)胞外基質(zhì)，生長(zhǎng)因子，激素，維生素的細(xì)胞培養(yǎng)液。更優(yōu)選的，所述的生物可降解的材料中含有80-99. 5%的以下物質(zhì)水、生理鹽水、PBS緩沖液、或含有細(xì)胞外基質(zhì)，生長(zhǎng)因子，激素，維生素的細(xì)胞培養(yǎng)液。在另一優(yōu)選例中，所述的生物可降解的物質(zhì)的溶劑包括但不限于水、生理鹽水、 PBS緩沖液、或細(xì)胞培養(yǎng)液。在另一優(yōu)選例中，所述的生物可降解的物質(zhì)的濃度為O. l-5g/100ml生物可降解材料(O. 1%-5%);更優(yōu)選的，所述的生物可降解的物質(zhì)的濃度為O. 5g/100ml-2g/100ml (O.5%-2%)。在另一優(yōu)選例中，所述的生物可降解的物質(zhì)為瓊脂或瓊脂糖，濃度為 O. l-10g/100ml生物可降解材料(O. 1-10%);更優(yōu)選的，所述的瓊脂或瓊脂糖的濃度為 O. l-5g/100ml生物可降解材料(O. 1%_5%)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，采用了瓊脂作為生物可降解的物質(zhì)，其濃度為lg/100ml生物可降解材料(1%，生物可降解物質(zhì)用PBS緩沖液作為溶劑)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的空腔為長(zhǎng)條形，并且其界面形狀選自長(zhǎng)方形、 正方形、圓形、橢圓形、卵形、五角形、六角形、或螺旋形；
或者所述的空腔的形狀對(duì)應(yīng)于器官的形狀。一些優(yōu)選的空腔為長(zhǎng)方體(即內(nèi)腔橫截面是方型或長(zhǎng)方形，或近似于方型或長(zhǎng)方形)、正方體(即內(nèi)腔橫截面是方型或長(zhǎng)方形，或近似于方型或長(zhǎng)方形)、圓柱體(即內(nèi)腔橫截面是圓形或橢圓形，或近似于圓形或橢圓形)。在另一優(yōu)選例中，所述的空腔的橫截面積為O. 2-60mm2，長(zhǎng)度為3-600mm ;更優(yōu)選的，所述的空腔的橫截面積為O. 5-30mm2，長(zhǎng)度為5_300mm。在另一優(yōu)選例中，所述的空腔為一種長(zhǎng)方體形狀(橫截面為長(zhǎng)方形或近似于長(zhǎng)方形)，空腔為長(zhǎng)方體形狀的培養(yǎng)單元適合于需要較大的表面黏附面積的細(xì)胞生長(zhǎng)，如適合于形成條索狀組織的細(xì)胞的培養(yǎng)。在另一優(yōu)選例中，所述的空腔為一種圓柱體形狀(橫截面為圓形或近似于圓形)， 空腔為圓柱體形的培養(yǎng)單元適合于需要生長(zhǎng)、發(fā)展為微器官或?qū)嶓w器官的細(xì)胞的培養(yǎng)。在另一優(yōu)選例中，所述的空腔為哺乳動(dòng)物組織或器官的形狀。在另一優(yōu)選例中，所述的空腔兩端是封閉的；或者，可選擇的，所述的空腔兩端是敞開的。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元中含有1-100個(gè)空腔。在另一優(yōu)選例中，所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元中含有2-50個(gè)所述空腔；更優(yōu)選的， 所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元中含有2-10個(gè)所述空腔。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的內(nèi)層空腔壁的生物可降解的材料中還可添加細(xì)胞外基質(zhì)、或營(yíng)養(yǎng)成分。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞外基質(zhì)可促進(jìn)細(xì)胞黏附。在另一優(yōu)選例中，所述的營(yíng)養(yǎng)成分包括但不限于細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、或增殖所必須或優(yōu)選的培養(yǎng)基、蛋白質(zhì)、脂肪、糖、維生素、細(xì)胞外基質(zhì)、激素、生長(zhǎng)因子、藥理活性因子和/ 或微量元素等。在本發(fā)明的第二方面，提供一種培養(yǎng)細(xì)胞的方法，包括以下步驟
(O提供一三維細(xì)胞培養(yǎng)單元，所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元內(nèi)包括用于培養(yǎng)的空腔以及界定所述空腔代謝產(chǎn)物的空腔壁，所述的空腔壁含有生物可降解的材料，并且所述的空腔壁可透過(guò)以下物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分、代謝產(chǎn)物。(2)將細(xì)胞引入到三維細(xì)胞培養(yǎng)單元的空腔中；
(3)將(2)中帶有細(xì)胞的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元置于含有液態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)基的容器中，并在適合生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，營(yíng)養(yǎng)成分包括但不限于氧氣、蛋白質(zhì)、糖、脂肪、維生素、激素。在另一優(yōu)選例中，代謝產(chǎn)物包括但不限于二氧化碳、細(xì)胞代謝產(chǎn)物。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞可以是任何細(xì)胞，包括但不限于真核細(xì)胞、原核細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、或單細(xì)胞微生物，哺乳動(dòng)物組織或器官細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞、各種主要組織細(xì)胞、各種實(shí)體腫瘤細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的哺乳動(dòng)物組織或器官細(xì)胞包括但不限于神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、胰島細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、腸細(xì)胞、腎細(xì)胞、腦細(xì)胞、心細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、胃細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、泌尿生殖系統(tǒng)細(xì)胞、神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、免疫系統(tǒng)細(xì)胞、脾細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤細(xì)胞為各種良性或惡性腫瘤細(xì)胞，如各種肝癌細(xì)胞、 乳腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、前列腺癌、肺癌細(xì)胞、腦腫瘤細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、骨腫瘤細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、甲狀腺腫瘤細(xì)胞、縱隔腫瘤細(xì)胞、小腸腫瘤細(xì)胞、腎腫瘤細(xì)胞、腎上腺腫瘤細(xì)胞、膀胱腫瘤細(xì)胞、睪丸腫瘤細(xì)胞、惡性淋巴瘤細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞。在本發(fā)明的第三方面，提供所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)裝置的用途，用于離體培養(yǎng)細(xì)胞。所述的細(xì)胞可以是任何細(xì)胞，包括但不限于真核細(xì)胞、原核細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、或單細(xì)胞微生物，哺乳動(dòng)物組織或器官細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞、各種主要組織細(xì)胞、 各種實(shí)體腫瘤細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的哺乳動(dòng)物組織或器官細(xì)胞包括但不限于神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、胰島細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、腸細(xì)胞、腎細(xì)胞、腦細(xì)胞、心細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、胃細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、泌尿生殖系統(tǒng)細(xì)胞、神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、免疫系統(tǒng)細(xì)胞、脾細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤細(xì)胞為各種良性或惡性腫瘤細(xì)胞，如各種肝癌細(xì)胞、 乳腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、前列腺癌、肺癌細(xì)胞、腦腫瘤細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、骨腫瘤細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、甲狀腺腫瘤細(xì)胞、縱隔腫瘤細(xì)胞、小腸腫瘤細(xì)胞、腎腫瘤細(xì)胞、腎上腺腫瘤細(xì)胞、膀胱腫瘤細(xì)胞、睪丸腫瘤細(xì)胞、惡性淋巴瘤細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)裝置用于觀察各種細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、成熟、運(yùn)動(dòng)、或遷移。在另一優(yōu)選例中，一個(gè)本發(fā)明的三維細(xì)胞培養(yǎng)裝置中可培養(yǎng)至少一種細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，一個(gè)本發(fā)明的三維細(xì)胞培養(yǎng)裝置中培養(yǎng)兩種或兩種以上的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)裝置可用于制備哺乳動(dòng)物的組織或器官。在另一優(yōu)選例中，所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)裝置用于制備各種哺乳動(dòng)物的再生組織和微型器官。在另一優(yōu)選例中，所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)裝置用于觀察一種類型的細(xì)胞中各個(gè)體之間的相互影響，或用于觀察兩種或兩種以上的細(xì)胞之間的相互影響。在另一優(yōu)選例中，所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)裝置用于進(jìn)行種子細(xì)胞的培養(yǎng)。在另一優(yōu)選例中，所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)裝置用于培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，觀察腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、運(yùn)動(dòng)、侵潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。在另一優(yōu)選例中，所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)裝置用于體外研究各種細(xì)胞在不同生理狀態(tài)和病理情況時(shí)的反應(yīng)和變化。在另一優(yōu)選例中，所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)裝置用于培養(yǎng)基因工程重組細(xì)胞，如含有外源基因的大腸桿菌細(xì)胞，含有外源基因的CHO細(xì)胞等。在另一優(yōu)選例中，所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)裝置用于腫瘤高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株和干細(xì)胞的分
離鑒定。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖I是本發(fā)明的一種三維細(xì)胞培養(yǎng)單元的預(yù)制模具的示意圖(模具兩端的蓋套忽略)。其中，圖IA為本發(fā)明的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元的模具的正視示意圖，圖IB為本發(fā)明的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元的模具的側(cè)視示意圖。在一種方形外套中預(yù)置三根方形條索，在所述裝置的外套中可注入生物可降解的材料，待所述生物可降解的材料凝固后取出條索即可形成供種植細(xì)胞的管道。圖中所示I為外套；2為條索。圖2A和圖2B本發(fā)明的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元的模具的立體示意圖，其中，圖2A為從正面看的立體圖，圖2B為從上側(cè)看的立體圖。圖中所示I為外套；2為條索。圖3顯示了細(xì)胞種植入本發(fā)明的方形和圓形的三維空間細(xì)胞培養(yǎng)單元的比較。圖 3A是細(xì)胞種植入空腔橫截面為方形的細(xì)胞培養(yǎng)單元的結(jié)果，圖3B是細(xì)胞種植入空腔橫截面為圓形的細(xì)胞培養(yǎng)單元的結(jié)果。圖4所示肝癌細(xì)胞株SMMC7721在在一般的二維培養(yǎng)系統(tǒng)和本發(fā)明的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)的比較和觀察。其中圖4A為在傳統(tǒng)二維培養(yǎng)系統(tǒng)中腫瘤細(xì)胞SMMC7721的培養(yǎng)生長(zhǎng)情況；圖4B、圖4C和圖4D分別是在本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)中腫瘤細(xì)胞SMMC7721的培養(yǎng)生長(zhǎng)情況。圖5所不胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞ΜΙΝ6在一般的二維培養(yǎng)系統(tǒng)和本發(fā)明的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)的比較和觀察。其中圖5Α為在傳統(tǒng)二維培養(yǎng)系統(tǒng)中腫瘤細(xì)胞ΜΙΝ6的培養(yǎng)生長(zhǎng)情況；圖5Β、圖5C和圖分別是在本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)中腫瘤細(xì)胞MIN6的培養(yǎng)生長(zhǎng)情況。圖6是一種肝細(xì)胞株ATCC CRL 2254在一般的二維培養(yǎng)系統(tǒng)和本發(fā)明的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)的比較。其中圖6A為肝細(xì)胞ATCC CRL 2254在二維環(huán)境中培養(yǎng)生長(zhǎng)的照片；圖 6B、圖6C、圖6D分別是肝細(xì)胞株ATCC CRL 2254在本發(fā)明的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中的培養(yǎng)生長(zhǎng)情況。圖7是一種胰島素瘤(insolinoma)細(xì)胞株ATCC CRL 11506在一般的二維培養(yǎng)系統(tǒng)和本發(fā)明的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)的比較。其中，圖7A為胰島素瘤(insolinoma)細(xì)胞株 ATCC CRL 11506在二維培養(yǎng)系統(tǒng)中的培養(yǎng)生長(zhǎng)情況；圖7B、圖7C、圖7D分別為胰島素瘤 (insolinoma)細(xì)胞株ATCC CRL 11506在本發(fā)明的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中的培養(yǎng)生長(zhǎng)情況。圖8是正常人骨骼肌肌細(xì)胞在一般的二維培養(yǎng)系統(tǒng)和本發(fā)明的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)的比較。其中，圖8A為肌細(xì)胞在二維培養(yǎng)系統(tǒng)中的培養(yǎng)生長(zhǎng)狀況；圖8B、圖8C、圖8D 為肌細(xì)胞在本發(fā)明的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)生長(zhǎng)狀況。圖9顯示了代表神經(jīng)細(xì)胞的雪旺氏細(xì)胞(來(lái)源于小鼠的坐骨神經(jīng))在一般二維培養(yǎng)系統(tǒng)和本發(fā)明的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中的比較。其中，圖9A為雪旺氏細(xì)胞在二維培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)的照片；圖9B、圖9C、圖9D為雪旺氏細(xì)胞在本發(fā)明的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)的照片。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)一種三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可為細(xì)胞提供一個(gè)近似于體內(nèi)生長(zhǎng)的三維空間的理想環(huán)境，將各種細(xì)胞在所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)， 可使細(xì)胞更好地生長(zhǎng)、分化、成熟，并且有利于一些細(xì)胞形成具有與體內(nèi)組織器官類似的組織結(jié)構(gòu)?；诖送瓿闪吮景l(fā)明。三維細(xì)胞培養(yǎng)裝置(系統(tǒng))
如本發(fā)明所用，“三維空間細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)”，“三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)”，“三維空間培養(yǎng)系統(tǒng)”， “三維空間細(xì)胞培養(yǎng)裝置”、“三維細(xì)胞培養(yǎng)裝置”，“三維空間培養(yǎng)裝置”可互換使用，都是指用于細(xì)胞培養(yǎng)的、可為細(xì)胞提供近似于體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境的三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。在本發(fā)明中，所述三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)包括
(a)容器，在容器內(nèi)裝有液態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)基；以及
(b)位于所述液態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)基中的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元，其中所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元內(nèi)包括用于培養(yǎng)的空腔以及界定所述空腔的空腔壁，所述的空腔壁含有生物可降解的材料，并且所述的空腔壁可透過(guò)以下物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分如氧氣、蛋白質(zhì)、糖、脂肪、維生素、激素等，以及二氧化碳等代謝產(chǎn)物。三維細(xì)胞培養(yǎng)單元
本發(fā)明提供了一種三維細(xì)胞培養(yǎng)單元，所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元由生物可降解的材料制成，其中含有至少一個(gè)空腔(也可稱為管腔、內(nèi)腔、或管道)。細(xì)胞可在所述的空腔中生長(zhǎng)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方式中，所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元為一種可透見的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元，所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元由生物可降解的透明材料制成。本發(fā)明的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元可由多種生物可降解的材料(優(yōu)選的，所述材料為透明或半透明的材料)制成。所述生物可降解的材料是一種在一定的溫度下可形成流體狀、 而在另一種溫度下又可凝固成固體凝膠狀的材料，比如可以是瓊脂、瓊脂糖、水凝膠、膠原， Matrigel等或其組合。在本發(fā)明中，所述的生物可降解的材料是生物可降解物質(zhì)形成的凝膠，其中所述的生物可降解物質(zhì)選自瓊脂、瓊脂糖、水凝膠、膠原，Matrigel、或其組合。所述生物可降解的材料可預(yù)先制備成液體狀，注入到預(yù)先設(shè)計(jì)的預(yù)制模具中，待其凝固后，形成所需的內(nèi)在和外在形狀。應(yīng)理解，任何傳統(tǒng)用于二維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(如細(xì)胞培養(yǎng)平板)培養(yǎng)、且可形成一定的固態(tài)形狀的生物可降解材料(如可凝固成固態(tài)的細(xì)胞培養(yǎng)基)都可用于本發(fā)明制成三維細(xì)胞培養(yǎng)單元。在配制所述生物可降解材料時(shí)，所述的生物可降解的物質(zhì)的溶劑包括但不限于 水、生理鹽水、PBS緩沖液、或細(xì)胞培養(yǎng)液。所述的細(xì)胞培養(yǎng)液可以是一種適合于所需培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、遷移等的液體培養(yǎng)基。在本發(fā)明中，所述的生物可降解的物質(zhì)的濃度為O. l-10g/100ml生物可降解材料 (即O. 1-10%);在另一優(yōu)選方式中，所述的生物可降解的物質(zhì)的濃度為O. l-5g/100ml生物可降解材料(O. 1%-5%);更優(yōu)選的，所述的生物可降解的物質(zhì)的濃度為O. 5-2g/100ml生物可降解材料(O. 5%-2%)。在另一優(yōu)選方式中，所述的物可降解的物質(zhì)為瓊脂或瓊脂糖，濃度為 O. l-10g/100ml生物可降解材料(O. 1-10%);更優(yōu)選的，所述的瓊脂或瓊脂糖的濃度為 O. l-5g/100ml生物可降解材料(O. 1%_5%)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，采用了瓊脂作為生物可降解的物質(zhì)，其濃度為lg/100ml生物可降解材料(1%，用PBS緩沖液作為溶劑)。較佳地，所述的生物可降解的材料可用50-99. 99%以下物質(zhì)溶解水、生理鹽水、 PBS緩沖液、或含有細(xì)胞外基質(zhì)，生長(zhǎng)因子，激素，維生素的細(xì)胞培養(yǎng)液。更優(yōu)選的，所述的生物可降解的材料中含有80-99. 5%的以下物質(zhì)水、生理鹽水、PBS緩沖液、或含有細(xì)胞外基質(zhì)，生長(zhǎng)因子，激素，維生素的細(xì)胞培養(yǎng)液。根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)的需要，所述三維細(xì)胞培養(yǎng)單元可以是多種多樣的形狀。比如長(zhǎng)方體、正方體、圓筒形等；優(yōu)選的，本發(fā)明的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元是一種長(zhǎng)方體或正方體或是一種與哺乳動(dòng)物組織或器官形狀相似的結(jié)構(gòu)。所述三維細(xì)胞培養(yǎng)單元的形狀和大小可根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)的具體需要而定。根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)的需要，所述三維細(xì)胞培養(yǎng)單元內(nèi)的空腔可以是多種多樣的形狀。 比如長(zhǎng)方體(即內(nèi)腔橫截面是方型或長(zhǎng)方形的，或近似于方型或長(zhǎng)方形)、正方體(即內(nèi)腔橫截面是方型或長(zhǎng)方形的，或近似于方型或長(zhǎng)方形(如三角形、梯形))、圓筒形(內(nèi)腔橫截面是圓形或橢圓形的，或近似于圓形或橢圓形(如六邊形))等；優(yōu)選的，本發(fā)明的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元內(nèi)的空腔是一種長(zhǎng)方體或正方體或是一種與哺乳動(dòng)物組織或器官形狀相似的結(jié)構(gòu)，更優(yōu)選的，本發(fā)明的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元內(nèi)的空腔是長(zhǎng)方體結(jié)構(gòu)或是與哺乳動(dòng)物組織或器官形狀相似的結(jié)構(gòu)。并且，所述的空腔兩端是封閉的或是敞開的。在一種特別優(yōu)選的方式中，當(dāng)所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元內(nèi)的空腔是一種方形結(jié)構(gòu)時(shí)，圓形的細(xì)胞位于方型的空腔中，可為細(xì)胞的黏附提供較大的表面積。因此，相對(duì)于圓形而言，方型的空腔更有利于條索形組織的生長(zhǎng)和形成。所述空腔的形狀和大小可根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)的具體需要而定，優(yōu)選的，所述的空腔的橫截面積為O. I-IOOmm2,長(zhǎng)度為l-1000mm。比如其可以為一種長(zhǎng)方體形狀，長(zhǎng)度可以為 I-IOOOmm,更優(yōu)選的為2-600mm,最優(yōu)選的為5_300mm ;寬度可以為O. I-IOmm,更優(yōu)選的為 O. 2-5mm,最優(yōu)選的為O. 2_2mm ;高度可以為O. I-IOmm,更優(yōu)選的為O. 2_5mm,最優(yōu)選的為 O. 2-2mm。比如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，三維細(xì)胞培養(yǎng)單元中的空腔為一種長(zhǎng)方體形狀， 其尺寸為長(zhǎng)度為100mm，寬度為6. 5mm,高度為3mm，壁厚度為O. 5mm。所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元內(nèi)的空腔的數(shù)量根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)的具體需要而定，比如可以為1-100個(gè)，更優(yōu)選的為2-50個(gè)，最優(yōu)選的為2-10個(gè)。另外，根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的要求不同，本發(fā)明的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元或其中的空腔還可制備成模仿哺乳動(dòng)物體各種組織或器官(比如條索狀組織如神經(jīng)和肌肉，或是實(shí)體器官如肝臟和胰腺等)的形狀，以便于細(xì)胞按照所需的要求進(jìn)行生長(zhǎng)和/或分化。在本發(fā)明的生物可降解材料中可添加一種或多種有利于細(xì)胞黏附的細(xì)胞外基質(zhì)， 或細(xì)胞培養(yǎng)所必須的營(yíng)養(yǎng)成分、生長(zhǎng)因子、激素和/或微量元素，根據(jù)不同的細(xì)胞，所需要的成分也是不同的。比如，對(duì)于肝細(xì)胞，可添加肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，應(yīng)理解，各種細(xì)胞在進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)所需要的不同成分是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。三維細(xì)胞培養(yǎng)單元的制作
本發(fā)明的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元可以通過(guò)手工制作、機(jī)器壓制、模具塑形等各種方式來(lái)進(jìn)行制作。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，采用模具塑形的方式進(jìn)行制作，使用一種外套管，其中放置至少一根細(xì)條索，將生物可降解的材料熔解后灌注于其中，待其凝固后去除外套管和細(xì)條索，即制成本發(fā)明的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元。本發(fā)明的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元的外套管可以根據(jù)需要制成不同的形狀，比如長(zhǎng)方體、正方體、圓筒形、哺乳動(dòng)物體各種組織或器官形狀等；在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述形狀為長(zhǎng)方型。所述外套管的材料可以是任何可塑形的、有一定牢固性、不易變形且不易降解的材料，比如可為金屬，玻璃、陶瓷或塑料等。外套管的形狀和大小可根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)的具體需要而定，比如其可以為一種長(zhǎng)方體形狀，長(zhǎng)度可以為lmm-1200mm,更優(yōu)選的為2mm-300mm,最優(yōu)選的為5_80mm ;寬度可以為 lmm-700mm,更優(yōu)選的為2mm-300mm,最優(yōu)選的為2_50mm ;高度可以為O. 5-600mm,更優(yōu)選的為lmm-200mm,最優(yōu)選的為l_30mm。比如,在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，采用一種長(zhǎng)方體外套管，其尺寸為長(zhǎng)度為100mm,寬度為6. 5mm,高度為3mm,壁厚度為O. 5mm。在外套內(nèi)可預(yù)先置放至少一根細(xì)條索，在注入細(xì)胞培養(yǎng)材料且凝固后，抽出細(xì)條索，留出的管腔內(nèi)用于培養(yǎng)細(xì)胞。所述的細(xì)條索可以是與外套管相對(duì)應(yīng)的各種形狀，比如長(zhǎng)方體、正方體、圓柱形等。所述的細(xì)條索可以是由任何有一定牢固性且不易變形和降解的材料制成，比如可以是金屬、玻璃或塑料等。根據(jù)所需要的空腔的大小來(lái)設(shè)計(jì)細(xì)條索的大小。所述細(xì)條索在外套內(nèi)的數(shù)量根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)的具體需要而定，比如可以為1-100 根，更優(yōu)選的為2-50根，最優(yōu)選的為2-10根。比如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，采用一種方型金屬絲，其長(zhǎng)度為200mm，寬度和高度各為O. 9mm。并且，外套管的兩端可以由與外套管以及細(xì)條索相匹配的蓋套密封。根據(jù)外套管和細(xì)條索設(shè)計(jì)的不同，所述蓋套的形狀和大小也是不同的。
具體的代表性的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元的模具如圖I所示。細(xì)胞培養(yǎng)
利用本發(fā)明的三維空間培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)是細(xì)胞可以在三維空間中長(zhǎng)期生長(zhǎng)、增生、分化、成熟，而區(qū)別于傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)。位于三維細(xì)胞培養(yǎng)單元中細(xì)胞的三維空間生長(zhǎng)是通過(guò)如下方式實(shí)現(xiàn)的通過(guò)三維細(xì)胞培養(yǎng)單元為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供近似于體內(nèi)生長(zhǎng)的空間和結(jié)構(gòu)，同時(shí)也可提供利于細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)的細(xì)胞外基質(zhì)和生長(zhǎng)因子，此外，還可用兩種或多種細(xì)胞的共同培養(yǎng)，促進(jìn)細(xì)胞和細(xì)胞基質(zhì)以及細(xì)胞和細(xì)胞之間的交互作用。前述一種或多種方式的結(jié)合為細(xì)胞提供了理想的生長(zhǎng)環(huán)境。本發(fā)明的三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可用于培養(yǎng)任何種類的細(xì)胞，可在制作所述三維細(xì)胞培養(yǎng)單元時(shí)先將細(xì)胞生長(zhǎng)、增生、分化、遷移所需的營(yíng)養(yǎng)成分添加到所述三維細(xì)胞培養(yǎng)單元中，再在其中引入細(xì)胞，直接進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；或者可選擇地，可在三維細(xì)胞培養(yǎng)單元中將細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)和生長(zhǎng)因子共同引入；或者可選擇地，可在三維細(xì)胞培養(yǎng)單元中先引入細(xì)胞，再將帶有細(xì)胞的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元浸入到含有細(xì)胞培養(yǎng)所需營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中。所述的培養(yǎng)基一般是一種液體培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方式中，在米用本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞之前，將細(xì)胞按照通常的方法培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)滿到80% — 90%時(shí)消化，消化后的細(xì)胞用毛細(xì)管作用引入三維細(xì)胞培養(yǎng)單元的內(nèi)在管腔。根據(jù)不同的應(yīng)用，細(xì)胞也可以和各種細(xì)胞外基質(zhì)，比如各種類型的膠原混合，一起引入管腔，或用其他常用的方法注入管腔。在注入細(xì)胞后，將內(nèi)腔中含有細(xì)胞的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元放入所需的培養(yǎng)液中，放于所需的常規(guī)的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。也可放入生物反應(yīng)器中培養(yǎng)。組織器官的形成和發(fā)育
組織器官的形成本身就是一個(gè)復(fù)雜的三維過(guò)程，本發(fā)明所提供的三維空間培養(yǎng)系統(tǒng)為組織的形成提供了一個(gè)良好的空間，并引導(dǎo)其結(jié)構(gòu)的發(fā)育形成。在本發(fā)明的三維空間培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞可長(zhǎng)期生長(zhǎng)，增生，保持細(xì)胞的特有功能，更為重要的是，細(xì)胞培養(yǎng)在這一系統(tǒng)中生長(zhǎng)，分化，成熟形成相應(yīng)的再生組織和新生的微型器官，具有多種多樣的特性。在器官移植中，目前對(duì)于提供發(fā)育完整的來(lái)自機(jī)體本身的自然機(jī)體的器官，尚無(wú)法做到離體培養(yǎng)和維持其正常生理功能。本發(fā)明的三維空間培養(yǎng)系統(tǒng)提供了一個(gè)近似于所述條件的環(huán)境，即把相應(yīng)的細(xì)胞以三維的形式細(xì)胞培養(yǎng)在本發(fā)明的三維空間培養(yǎng)系統(tǒng)中， 使其生長(zhǎng)，分化，成熟形成相應(yīng)的再生組織和新生的微型器官。然后再移植入所需要的部位，利用機(jī)體本身的生物學(xué)特性來(lái)生長(zhǎng)。從細(xì)胞到成熟的器官還有大量的工作并需要一定的時(shí)間，本發(fā)明的三維空間培養(yǎng)系統(tǒng)有利于實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞替代治療到組織替代治療乃至器官替代治療的突破。這對(duì)于基礎(chǔ)科學(xué)的研究和臨床醫(yī)學(xué)的應(yīng)用均有重大的意義。從三維細(xì)胞培養(yǎng)單元中獲取培養(yǎng)物
由于在本發(fā)明的三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，三維細(xì)胞培養(yǎng)單元的制備采用了生物可降解的材料，因此所述材料不僅有利于在三維細(xì)胞培養(yǎng)單元的空腔壁內(nèi)外進(jìn)行物質(zhì)交換，而且還有利于獲取細(xì)胞或由細(xì)胞發(fā)展而成的微器官或組織。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可采用多種化學(xué)和物理的方法從所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元中獲取細(xì)胞。比如，可通過(guò)切割工具，將所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元的空腔壁切開，從而獲取所述的培養(yǎng)物。并且，也可以采用生物化學(xué)降解的方法來(lái)獲取所述的培養(yǎng)物，比如，可以用膠原酶消化膠原來(lái)獲取所述的培養(yǎng)物。細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)的動(dòng)態(tài)觀察
在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，本發(fā)明的三維空間培養(yǎng)單元是可透見的，在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中可隨時(shí)動(dòng)態(tài)觀察所述三維空間培養(yǎng)單元中培養(yǎng)的細(xì)胞乃至所發(fā)展形成的組織和器官的整個(gè)過(guò)程。不僅可研究細(xì)胞的黏附，擴(kuò)伸，移行，增生，分化，成熟，衰老，以至死亡的過(guò)程。 而且可在體外進(jìn)一步了解組織和器官的發(fā)展和形成過(guò)程，為從組織和器官這一高級(jí)的層次研究提供了理想的工具和條件。可以在不破壞“標(biāo)本”的條件下，對(duì)所培養(yǎng)的組織細(xì)胞直接進(jìn)行隨時(shí)的動(dòng)態(tài)觀察。細(xì)胞間相互影響的觀察
根據(jù)各種不同的需要和具體的實(shí)驗(yàn)條件，兩種或兩種以上的細(xì)胞可在本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)中共同或分別培養(yǎng)，籍以觀察細(xì)胞與細(xì)胞之間，或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的交互作用和影響，如細(xì)胞間的分化誘導(dǎo)，激活，接觸性和非接觸性誘導(dǎo)，分化抑制和細(xì)胞外物質(zhì)的介導(dǎo)作用，如近距離介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)和黏附分子，和遠(yuǎn)距離介導(dǎo)的激素，細(xì)胞因子。還可以從細(xì)胞水平和分子水平來(lái)觀察細(xì)胞之間的交互影響，例如不同細(xì)胞所分泌的激素，生長(zhǎng)因子， 受體，免疫球蛋白，細(xì)胞因子等的交互影響，并可研究激素的旁分泌，自分泌，細(xì)胞因子，神經(jīng)肽，神經(jīng)遞質(zhì)等共同組成的復(fù)雜的細(xì)胞間信號(hào)分子系統(tǒng)。多種細(xì)胞的復(fù)合培養(yǎng)技術(shù)還可改善細(xì)胞的存活和完善其功能。種子細(xì)胞的培養(yǎng)
種子細(xì)胞一直是組織工程研究的核心問(wèn)題之一，理想的種子細(xì)胞應(yīng)是容易獲取，易于體外培養(yǎng)增殖，長(zhǎng)期傳代并保持其生物學(xué)特征，組織修復(fù)能力強(qiáng)，攜帶患者自體全部基因組型的抗原性小的細(xì)胞，目前所用的自體細(xì)胞來(lái)源有限，易老化，有創(chuàng)傷性修復(fù)等特點(diǎn)，已成為組織工程發(fā)展的瓶頸。本發(fā)明的三維空間培養(yǎng)系統(tǒng)可用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)大量細(xì)胞。一些從培養(yǎng)基質(zhì)上脫落的細(xì)胞常常在懸浮狀態(tài)下不能生長(zhǎng)，短期內(nèi)很快變性死亡。而在本發(fā)明的三維空間培養(yǎng)系統(tǒng)中，所述細(xì)胞可長(zhǎng)期生長(zhǎng)，增生，產(chǎn)生大量的細(xì)胞，所述細(xì)胞在三維空間這一類似于體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)，保持其特有的功能和特性，因此不僅可產(chǎn)生大量可供進(jìn)一步研究或應(yīng)用的細(xì)胞，滿足體內(nèi)移植所需的細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)也可獲得大量的細(xì)胞活性產(chǎn)物。形成再生組織和微型器官
細(xì)胞在本發(fā)明的三維系統(tǒng)中聚集，組合，可在短期內(nèi)形成再生組織和微型器官。所形成的細(xì)胞，組織和器官不但可以在不損傷標(biāo)本的狀態(tài)下隨時(shí)觀察和動(dòng)態(tài)追蹤，而且可在對(duì)細(xì)胞組織器官無(wú)任何化學(xué)傷害的條件下收獲產(chǎn)品供移植或植入治療。另外所培養(yǎng)的組織和器官很容易與所用三維空間的細(xì)胞支架分離，臨床應(yīng)用不用擔(dān)心生物材料的組織相容性和生物降解性。本發(fā)明的系統(tǒng)培養(yǎng)所獲得的小器官不僅可用于移植治療，還可在移植后觀察整體的組織和器官對(duì)移植物的系統(tǒng)支持。組織工程學(xué)是綜合應(yīng)用工程學(xué)和生命科學(xué)的基本原理，基本理論，基本技術(shù)和基本方法。其方法是在體外預(yù)先構(gòu)建一個(gè)有生物活性的種植體，然后植入體內(nèi)，修復(fù)組織缺損，替代組織和器官的一部分或全部功能?；蜃鳛轶w外裝置，暫時(shí)替代器官部分功能，達(dá)到提高生存，生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生命活動(dòng)的目的。本發(fā)明的三維系統(tǒng)所采用的材料很容易塑形為類似于體內(nèi)自然形成的組織和器官的各種構(gòu)型，包括條索狀組織如神經(jīng)和肌肉，或是實(shí)體器官如肝臟和胰腺等。輔之以允許細(xì)胞培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)自由進(jìn)入，代謝產(chǎn)物的自由排出，可為組織工程提供各種可選擇的細(xì)胞移植，組織移植和器官移植。盡管現(xiàn)有的新型的生物材料已被用來(lái)生長(zhǎng)類似于肝臟的組織，但在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中僅可恢復(fù)單一的肝臟化學(xué)功能，并不能體現(xiàn)整個(gè)器官的肝臟功能。移植有結(jié)構(gòu)，有功能的器官，即把合適的細(xì)胞以三維空間生長(zhǎng)的形式植入所需要的部位，利用機(jī)體本身的生物特性來(lái)生長(zhǎng)，將有利于改善臨床療效。生理狀態(tài)和病理情況的體外研究
由于本發(fā)明的系統(tǒng)所培養(yǎng)的細(xì)胞可長(zhǎng)期生長(zhǎng)并保持細(xì)胞特有的功能使其可作為體外研究細(xì)胞在不同生理狀態(tài)和病理情況的模型。并且，其也可作為代謝的轉(zhuǎn)換系統(tǒng)和待試器官來(lái)篩選細(xì)胞毒性物質(zhì)，各種藥物和生理活性分子，致畸或致瘤物質(zhì)，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子。創(chuàng)造單純的組織器官環(huán)境也可供研究組織器官所特有的功能。這在藥物研究中具有廣泛的用途。如研究藥物代謝的改變，例如細(xì)胞色素的P-450的活性。本發(fā)明的系統(tǒng)具有能在各種可以任意調(diào)控的環(huán)境條件下觀察細(xì)胞和組織，乃至新生器官的形態(tài)學(xué)。可用于觀察激素，生長(zhǎng)因子，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，代謝產(chǎn)物和藥理活性因子對(duì)其生長(zhǎng)的影響，如可用于在細(xì)胞水平對(duì)藥物的藥理藥效，毒理等進(jìn)行研究和用于觀察內(nèi)在基因程序的調(diào)控?；蚬こ填I(lǐng)域的研究
目前常用的基因治療技術(shù)雖然能通過(guò)把正常編碼序列導(dǎo)入突變細(xì)胞，從而使突變的功能得到糾正，但導(dǎo)入基因的整合的表達(dá)難以精確控制，特別是使基因植入后對(duì)其他細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)尚無(wú)法預(yù)知。本發(fā)明的系統(tǒng)有利于細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)。產(chǎn)生的細(xì)胞可用于基因工程研究來(lái)表達(dá)基因產(chǎn)物，長(zhǎng)期表達(dá)外源性基因，引入基因治療或基因產(chǎn)物用于基因治療，達(dá)到控制和治療疾病的目的。也可導(dǎo)入外源性基因，把在特定發(fā)育階段中起決定作用的基因?qū)爰?xì)胞的基因組中，使其準(zhǔn)確地分化為某一特定類型的細(xì)胞?；蚩筛淖兗?xì)胞基因的表達(dá)，用于移植和回植，減少排異，改善移植治療，作為輔助或根治措施。本發(fā)明的三維培養(yǎng)系統(tǒng)的用途還包括研究各種基因在不同時(shí)限和空間環(huán)境的關(guān)閉和開啟，以及各種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)上調(diào)或下降。作為治療性基因的載體細(xì)胞，對(duì)損傷或病變部位施行基因治療，移植后達(dá)到準(zhǔn)確定位，高效表達(dá)?？朔蚋淖兊募?xì)胞在體外不易穩(wěn)定地被傳染和增殖傳代，以及在細(xì)胞更新中可能丟失治療基因的問(wèn)題。本發(fā)明的三維培養(yǎng)系統(tǒng)還可用于研究免疫系統(tǒng)的組織、細(xì)胞之間的交互影響，了解細(xì)胞如何參與免疫防御，免疫自穩(wěn)和免疫監(jiān)視，以執(zhí)行識(shí)別自身和非己抗原物質(zhì)。肝臟細(xì)胞的培養(yǎng)
肝臟是人體的重要器官，人體的肝臟至少含有6種以上不同的細(xì)胞，它們可有規(guī)律地形成顯微鏡下可觀察到的小葉結(jié)構(gòu)。各種不同的細(xì)胞有其不同的功能，而且一種細(xì)胞的功能常依賴于它和其他細(xì)胞之間的交互影響。肝臟具有許多代謝和儲(chǔ)存功能，如調(diào)節(jié)和合成蛋白質(zhì)，凝血因子，脂蛋白等，并參與內(nèi)源性和外源性化學(xué)物質(zhì)的解毒和純化。肝炎，肝硬化和肝癌等肝臟疾病是臨床上的常見病。如何有效地治療肝炎，肝硬化和肝癌等肝臟疾病一直是臨床上的難題，目前有希望的治療方法有原位肝移植，生物人工肝等，但這些方法都面臨著肝源或肝細(xì)胞短缺的問(wèn)題。為了形成可供移植用的器官，研究者必須更好地了解如何在近似于體內(nèi)的環(huán)境下培養(yǎng)肝細(xì)胞，并提供其發(fā)揮它們的正常的生理功能的環(huán)境。人的肝臟細(xì)胞培養(yǎng)有相當(dāng)?shù)睦щy，因?yàn)檫@些細(xì)胞有分化的類型，所以限制了細(xì)胞的增殖的能力，此外，通常的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)并不能使分化的細(xì)胞長(zhǎng)期保留其功能。另外，在活體內(nèi)研究肝臟的某一特有的功能是比較困難的，因?yàn)檫@些生理功能常常受到其他臟器的影響，例如腎臟，腸道和肺臟等。目前已有一些生物可降解材料被用于生長(zhǎng)類似于肝臟的組織，但所獲得的新生組織在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中僅可恢復(fù)單一的肝臟的化學(xué)功能，或在不同程度上延長(zhǎng)了肝細(xì)胞的功能， 尚未能獲得重復(fù)作為整個(gè)器官的肝臟的功能。在本發(fā)明的三維空間培養(yǎng)系統(tǒng)中肝細(xì)胞可長(zhǎng)期生長(zhǎng)，增生，保持細(xì)胞的特有功能， 更為重要的是，細(xì)胞培養(yǎng)在這一系統(tǒng)中生長(zhǎng)，分化，成熟形成新生的微型器官。這對(duì)研究肝細(xì)胞生長(zhǎng)和功能，對(duì)研究肝臟的DNA的合成，激素的轉(zhuǎn)錄，翻譯過(guò)程，代謝調(diào)節(jié)，膽汁的形成，分泌過(guò)程，肝細(xì)胞的代謝作用，包括致癌和致畸都是理想的工具。同時(shí)可用于基因治療代謝性疾病，以及替代在肝病或肝細(xì)胞損傷中所損失的肝細(xì)胞，進(jìn)而恢復(fù)其組織結(jié)構(gòu)和正常功能，同時(shí)由于新生的微型器官具有包膜和分支管結(jié)構(gòu)，可植入體內(nèi)以供移植治療。胰島細(xì)胞的培養(yǎng)
因胰島素分泌缺乏而導(dǎo)致的糖尿病是危害人類健康的常見病。據(jù)統(tǒng)計(jì)世界上大約有 150，000, 000名患者。到目前為止對(duì)糖尿病的病因治療尚無(wú)有效的方法。糖尿病的基本病理生理為絕對(duì)或相對(duì)胰島素分泌不足，病理檢查顯示胰島數(shù)量、 大小和β細(xì)胞減少。在胰島素依賴型糖尿病患者中，進(jìn)行性的自身免疫反應(yīng)不斷摧毀正常的胰島β細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體胰島β細(xì)胞減少，不能合成，儲(chǔ)存和釋放足夠的胰島素。胰島素分泌缺乏的糖尿病患者對(duì)體內(nèi)的葡萄糖水平不能進(jìn)行正常的代謝和調(diào)節(jié)，引起體內(nèi)葡萄糖增多和脂肪、蛋白質(zhì)、電解質(zhì)等代謝紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致一系列并發(fā)癥。嚴(yán)重時(shí)發(fā)生糖尿病性昏迷而威脅生命.
胰島β細(xì)胞屬于高度分化的細(xì)胞，其再生能力有限。因此，由于體內(nèi)胰島β細(xì)胞減少而導(dǎo)致的胰島素依賴型糖尿病患者通常需要終身每天接受胰島素治療。近十多年來(lái)，人們對(duì)胰島移植進(jìn)行了廣泛的研究，希望通過(guò)胰島移植的方法為糖尿病患者提供更理想的治療。但由于目前很難得到相當(dāng)大量的胰島β細(xì)胞，胰島移植治療方法的臨床應(yīng)用受到了很大的限制。本發(fā)明的三維空間培養(yǎng)系統(tǒng)可用來(lái)培養(yǎng)生產(chǎn)大量細(xì)胞。在所述的三維空間培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞可長(zhǎng)期生長(zhǎng)，增生，產(chǎn)生大量的細(xì)胞，這不僅可產(chǎn)生大量可供進(jìn)一步研究或應(yīng)用的細(xì)胞，滿足體內(nèi)移植所需的細(xì)胞的數(shù)量。由于全胰腺移植所面臨的許多問(wèn)題，移植胰腺胰島代表了糖尿病病人內(nèi)分泌功能的最有希望的途徑。胰腺細(xì)胞的體外擴(kuò)增并使其成為真正的成熟的胰島β細(xì)胞不僅是重要的生物學(xué)研究的工具，而且是重要的用于治療的組織來(lái)源。本發(fā)明的三維空間培養(yǎng)系統(tǒng)所擴(kuò)增的大量胰島細(xì)胞可植入血管部位如大網(wǎng)膜和腸系膜以期改善臨床療效。神經(jīng)和肌肉細(xì)胞的培養(yǎng)
臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)都很重視神經(jīng)修復(fù)的問(wèn)題，中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)的損害和病變常導(dǎo)致感覺和/或運(yùn)動(dòng)功能的部分或全部喪失。盡管過(guò)去的30年來(lái)人類對(duì)神經(jīng)損傷再生，生長(zhǎng)的生物學(xué)機(jī)制有了較為深入的了解，衍生了各種不同的治療方法，但是很少能夠獲得功能性的恢復(fù)。與其他部位的組織損傷不同，神經(jīng)損傷通常伴有隨之而來(lái)的功能性的障礙，通常表現(xiàn)為感覺異常和/或功能障礙。目前對(duì)周圍神經(jīng)損傷的治療方法，為取自體神經(jīng)作為移植物，這需要獲取和犧牲一段正常的神經(jīng)，同時(shí)還有許多不利之處，如供應(yīng)部位的功能損失，手術(shù)伴隨的危險(xiǎn)性，供應(yīng)部位形成神經(jīng)瘤，可供選擇的部位很有限，手術(shù)獲取時(shí)損傷神經(jīng)。神經(jīng)再生的兩個(gè)重要因素是軸突的生長(zhǎng)的速度和質(zhì)量，以及再生軸突的生長(zhǎng)方向和特性，此外雪旺氏細(xì)胞在支持神經(jīng)生長(zhǎng)中起到幾方面的關(guān)鍵性的作用，雪旺氏細(xì)胞可合成許多營(yíng)養(yǎng)因子來(lái)支持神經(jīng)的生存和和為軸突提供軸突生長(zhǎng)的引導(dǎo)方向。一些研究者在一定程度上成功地應(yīng)用了其他可供選擇的方法來(lái)解決神經(jīng)損傷修復(fù)的問(wèn)題，包括生物的和合成的神經(jīng)定向支架，不幸的是，這些方法尚未在臨床上證實(shí)其有效性?？缮锝到獾睦w維也被用來(lái)引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)，由于絕大多數(shù)聚合物是不透明的，因此在移植前或移植治療后均不能很直接觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，況且，所觀察到的神經(jīng)再生和功能恢復(fù)的效果也是有限的。近來(lái)所用的支架技術(shù)是基于用神經(jīng)細(xì)胞或組織，以及細(xì)胞外基質(zhì)加上生物可降解材料來(lái)提供一個(gè)包容性的細(xì)胞支架來(lái)促進(jìn)軸突生長(zhǎng)跨越病變部位，這一生物可降解材料的引導(dǎo)加上雪旺氏細(xì)胞，可用來(lái)移植入周圍神經(jīng)或背髓橫貫型損傷，以促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損傷的軸突的再生和修復(fù)。但其制造過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜，費(fèi)時(shí)過(guò)長(zhǎng)。要用對(duì)細(xì)胞有毒的試劑。以及引入細(xì)胞多，需要特殊設(shè)備，且耗時(shí)數(shù)小時(shí)。同時(shí)所用材料為不可透見，不利于隨時(shí)動(dòng)態(tài)觀察和隨訪細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。因此需要一個(gè)改進(jìn)的神經(jīng)支架，具有以下的特點(diǎn)1.物理上包容性引導(dǎo)結(jié)構(gòu)(多通道)；2.有利的化學(xué)物質(zhì)(細(xì)胞外基質(zhì))；3.有活性的細(xì)胞成分(雪旺氏細(xì)胞)。來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的黏附和延伸，以幫助周圍和中樞神經(jīng)再生。本發(fā)明系統(tǒng)為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了一個(gè)支架，細(xì)胞可在支架中生長(zhǎng)，由于支架是透明的，細(xì)胞在其內(nèi)的生長(zhǎng)和形態(tài)學(xué)可被直接觀察，由于支架的主體是由多個(gè)管道構(gòu)成，本支架可用于生長(zhǎng)細(xì)胞供組織工程的應(yīng)用，如肌肉，血管，神經(jīng)的延伸或再生。本發(fā)明的系統(tǒng)可提供雪旺氏細(xì)胞的黏附，在數(shù)小時(shí)之內(nèi)就延伸和形成條索狀的具有細(xì)胞活性的結(jié)構(gòu)，由于準(zhǔn)備這一系統(tǒng)的整個(gè)步驟簡(jiǎn)單，可在短時(shí)間內(nèi)完成，使其可促進(jìn)神經(jīng)的早期再生，以利神經(jīng)的再生和功能的恢復(fù)。在管道內(nèi)的黏附性細(xì)胞外基質(zhì)可支持雪旺氏細(xì)胞的生長(zhǎng)，雪旺氏細(xì)胞的生長(zhǎng)對(duì)軸突的初生，伸展，分支，和長(zhǎng)期生存和分化起到重要的支持作用，本系統(tǒng)所能早期形成的雪旺氏細(xì)胞支架可用于周圍神經(jīng)損傷，背髓損傷，和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害。在神經(jīng)損傷后盡快地提供雪旺氏細(xì)胞支架，使之在本發(fā)明的三維培養(yǎng)系統(tǒng)的管道中生長(zhǎng)。本發(fā)明的三維培養(yǎng)系統(tǒng)不僅可作為物理性的支架以促進(jìn)移植物和宿主組織的整合，而且可促進(jìn)受損的軸突的再生和/或可縮短通常伴隨與神經(jīng)損傷的早期的神經(jīng)再生過(guò)程，以達(dá)到加速神經(jīng)再生，增加可修復(fù)神經(jīng)的缺損區(qū)域，縮短神經(jīng)和靶組織連接時(shí)間，于是改進(jìn)功能的恢復(fù)。腫瘤的研究
腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的生物學(xué)特征之一，是腫瘤細(xì)胞粘連、酶降解、移動(dòng)、基質(zhì)內(nèi)增殖等一系列過(guò)程的表現(xiàn)，是腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)在宿主多種因素調(diào)節(jié)下相互作用的結(jié)果。臨床腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生率相當(dāng)高，有人統(tǒng)計(jì)60%以上的惡性腫瘤患者于初次診斷時(shí)已發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移。腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤發(fā)生和演進(jìn)過(guò)程中最危險(xiǎn)階段。據(jù)統(tǒng)計(jì)腫瘤患者約有80%以上死于侵襲和轉(zhuǎn)移。因此腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)十分令人關(guān)注的臨床治療的難題。從腫瘤侵襲到轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的腫瘤發(fā)病學(xué)問(wèn)題。一般認(rèn)為腫瘤浸潤(rùn)的機(jī)理與多種因素有關(guān)，包括腫瘤細(xì)胞本身的生物學(xué)特性、周圍間質(zhì)的作用以及局部免疫等。癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移是多階段、多步驟、多因素、多基因等綜合作用和發(fā)展過(guò)程。其涉及的面很廣，包括正常細(xì)胞經(jīng)致癌因素啟動(dòng)，促癌因子作用，生長(zhǎng)失去控制、惡性變、侵襲到轉(zhuǎn)移；轉(zhuǎn)移灶形成后又可再侵襲和再轉(zhuǎn)移直至宿主死亡。有關(guān)腫瘤的侵襲、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移已有許多研究，但迄今尚未完全了解和解決這一問(wèn)題。腫瘤轉(zhuǎn)移包含脫離、轉(zhuǎn)運(yùn)和生長(zhǎng)3個(gè)主要環(huán)節(jié)，然而這是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其步驟至少有在各種條件具備的情況下，腫瘤細(xì)胞的移動(dòng)和阿米巴運(yùn)動(dòng)有助于其本身突破基底膜，進(jìn)入周圍組織間隙。腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)瘤群體后，粘連侵襲基底膜并在周圍間質(zhì)中浸潤(rùn)生長(zhǎng)；腫瘤細(xì)胞進(jìn)入間質(zhì)以后，需要依靠間質(zhì)中給予的信息、營(yíng)養(yǎng)和其他支持，同時(shí)也不斷向間質(zhì)分泌排放各種代謝物質(zhì)，構(gòu)成腫瘤細(xì)胞和周圍間質(zhì)的密切的關(guān)系，使腫瘤繼續(xù)增生發(fā)展。腫瘤細(xì)胞侵入周圍間質(zhì)后，一般都在基質(zhì)中壓力最小處增殖生長(zhǎng)，即所謂“直接播散”或“直接蔓延”形成很不規(guī)則的腫塊。浸潤(rùn)的腫瘤細(xì)胞可進(jìn)而侵襲鄰近的淋巴管和血管。經(jīng)過(guò)一個(gè)階段以后，腫瘤可能形成新的包膜或假包膜，也可能腫瘤細(xì)胞進(jìn)而侵襲局部淋巴管或小血管，并與局部毛細(xì)血管或毛細(xì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞密切接觸并穿透其管壁，在血管、 淋巴管內(nèi)繼續(xù)存活并被轉(zhuǎn)運(yùn)；同時(shí)啟動(dòng)血小板聚集,形成小瘤栓.到達(dá)靶組織的腫瘤細(xì)胞與血管或淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜粘連，穿透毛細(xì)血管或毛細(xì)淋巴管壁，向周圍間質(zhì)浸潤(rùn)， 在基質(zhì)中不斷增生，形成新的繼發(fā)瘤。腫瘤還可或落入或突入腔道(如漿膜腔)，通過(guò)漿膜或粘膜下間隙在漿膜或粘膜面生長(zhǎng)形成腫瘤轉(zhuǎn)移。惡性瘤細(xì)胞能在繼發(fā)部位存活和生長(zhǎng)，依賴于瘤細(xì)胞的特性和宿主體內(nèi)多種因素的作用。這些特性和因素為轉(zhuǎn)移形成提供合適的基質(zhì)和細(xì)胞存活、增長(zhǎng)的環(huán)境。自癌細(xì)胞從瘤母體脫離到轉(zhuǎn)移灶形成要經(jīng)過(guò)各種細(xì)胞與細(xì)胞及細(xì)胞與基質(zhì)相互作用、逃逸機(jī)體免疫機(jī)制、適應(yīng)新的環(huán)境等復(fù)雜過(guò)程和機(jī)制，方能形成轉(zhuǎn)移。因而最終僅有少數(shù)具有高轉(zhuǎn)移能力的瘤細(xì)胞形成轉(zhuǎn)移灶。在腫瘤實(shí)體內(nèi)存在異質(zhì)性已被證實(shí)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明在腫瘤細(xì)胞群體中有高轉(zhuǎn)移性潛能的細(xì)胞亞系的存在。從轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞中可篩選出轉(zhuǎn)移性潛能高低不同的細(xì)胞，這種轉(zhuǎn)移潛能高低不同的細(xì)胞可能遺傳密碼、細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)、抗原特性、代謝特性、受體種類和分布、侵襲力、與血管內(nèi)皮細(xì)胞等的粘連力、產(chǎn)生局部血凝因子或腫瘤血管形成因子的能力，以及對(duì)免疫反應(yīng)的應(yīng)答力等都不相同，以致侵襲、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的能力也不同。這些變化也可稱為相關(guān)的生物學(xué)特性，或稱為與侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的特性。目前研究最多的是瘤細(xì)胞的粘附性、運(yùn)動(dòng)性和降解酶分泌等。以往在人體上很難觀察到浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的全過(guò)程。動(dòng)物的自發(fā)性腫瘤在短期內(nèi)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的也不多。因此在研究腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)理時(shí)，常需用復(fù)制動(dòng)物模型的方法來(lái)進(jìn)行。在復(fù)制動(dòng)物轉(zhuǎn)移模型時(shí)，往往需要反復(fù)多次靜脈注入萬(wàn)余個(gè)瘤細(xì)胞后才能成功。而且由于測(cè)定血循環(huán)中瘤細(xì)胞數(shù)量的技術(shù)較復(fù)雜，靈敏的測(cè)定方法尚有待建立，形態(tài)學(xué)鑒定瘤細(xì)胞的方法很不可靠。本發(fā)明的三維空間培養(yǎng)系統(tǒng)可在體外系統(tǒng)研究腫瘤細(xì)胞的原位運(yùn)動(dòng)和異位運(yùn)動(dòng)， 腫瘤細(xì)胞的分離與細(xì)胞接觸抑制的喪失，間質(zhì)對(duì)腫瘤浸潤(rùn)的作用以及腫瘤細(xì)胞產(chǎn)物及其他有關(guān)成分的作用。將有助于弄清腫瘤細(xì)胞特異的運(yùn)動(dòng)性，粘附性、侵襲、轉(zhuǎn)移和器官來(lái)源的可溶性因子的調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制。在癌癥治療方面可通過(guò)抑制特異的細(xì)胞粘附作用來(lái)阻斷轉(zhuǎn)移形成，或可用干擾器官來(lái)源的刺激因子作用或用抑制這些因子的方法達(dá)到治療轉(zhuǎn)移的目的。本發(fā)明的三維空間培養(yǎng)系統(tǒng)還可用于分離鑒定在腫瘤細(xì)胞群體中的高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞亞系，篩選出轉(zhuǎn)移性潛能高低不同的細(xì)胞。并對(duì)這些細(xì)胞與侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)特性如遺傳密碼、細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)、受體種類和分布、抗原特性、代謝特性、侵襲力、與血管內(nèi)皮細(xì)胞等的粘連力、產(chǎn)生局部血凝因子或腫瘤血管形成因子的能力，以及對(duì)免疫反應(yīng)的應(yīng)答力等進(jìn)行研究。本發(fā)明的三維空間細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)還可用于腫瘤干細(xì)胞的分離鑒定。實(shí)體腫瘤異質(zhì)性的另一方面是只有少數(shù)細(xì)胞在培養(yǎng)中或體內(nèi)呈“克隆優(yōu)勢(shì)”生長(zhǎng)現(xiàn)象。這些腫瘤細(xì)胞可能是腫瘤干細(xì)胞。由于絕大多數(shù)具有克隆的起源的腫瘤產(chǎn)生腫瘤的癌細(xì)胞一定會(huì)產(chǎn)生具有不同基因表型的細(xì)胞，包括只具有有限再生能力或無(wú)再生能力的腫瘤細(xì)胞，或是具有無(wú)限增生能力的癌細(xì)胞，這提示產(chǎn)生腫瘤病的癌細(xì)胞經(jīng)歷的生長(zhǎng)過(guò)程是和正常干細(xì)胞自我增生和分化的過(guò)程是相似的。如果實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)是由癌干細(xì)胞驅(qū)使的，那么將對(duì)癌癥的治療帶來(lái)深遠(yuǎn)的影響。目前所有的基因表型癌細(xì)胞都被當(dāng)作他們有無(wú)限的增生能力，而且可以轉(zhuǎn)移。然而多年以來(lái)，人們已發(fā)現(xiàn)在遠(yuǎn)離原發(fā)腫瘤的部位可檢測(cè)到癌細(xì)胞，但從不表現(xiàn)轉(zhuǎn)移性病變?？赡艿脑蛑皇墙^大多數(shù)的癌細(xì)胞缺乏形成新的腫瘤的能力，只是少量的癌干細(xì)胞才有能力導(dǎo)致轉(zhuǎn)移，因此治療的根本目的應(yīng)為發(fā)現(xiàn)和殺死這些腫瘤干細(xì)胞，本發(fā)明的三維空間培養(yǎng)系統(tǒng)可在體外觀查腫瘤細(xì)胞的“克隆優(yōu)勢(shì)”生長(zhǎng)現(xiàn)象和繼發(fā)性腫瘤的形成。這將有助于腫瘤干細(xì)胞的分離和鑒定，針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的治療藥物和方法將會(huì)取得更持久的療效，甚至達(dá)到治愈轉(zhuǎn)移性腫瘤的效果。盡管人類對(duì)于惡性腫瘤進(jìn)行了大量的研究，但對(duì)于其病因進(jìn)展以及對(duì)治療的反應(yīng)和規(guī)律了解甚少。本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)的特點(diǎn)之一是肝癌細(xì)胞在本發(fā)明的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)大約48-72小時(shí)后形成大小不等的腫瘤。其后瘤組織細(xì)胞向外界環(huán)境伸出細(xì)胞偽足突起，還可觀察到細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和/或脫落至腫瘤周圍。在大約一周的時(shí)間內(nèi)，腫瘤細(xì)胞大量增生，形成多發(fā)性腫瘤，包括繼發(fā)性腫瘤。這種類似于體內(nèi)環(huán)境的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，增生和發(fā)展過(guò)程可用于體外實(shí)體腫瘤模型的研究(具體見后續(xù)的實(shí)施例)。體外三維腫瘤模型對(duì)腫瘤生物學(xué)的研究提供了非常寶貴的作用，與單層細(xì)胞相比，三維腫瘤模型的組織結(jié)構(gòu)更現(xiàn)實(shí)地體現(xiàn)了腫瘤的結(jié)構(gòu)支架的細(xì)胞分化功能。因此可用于研究腫瘤的病因?qū)W。腫瘤的形成和發(fā)展，侵犯，轉(zhuǎn)移，血管形成，組織構(gòu)建，和腫瘤干細(xì)胞學(xué)的研究，腫瘤基因的表達(dá)，允許對(duì)放療，化療，或免疫治療的敏感性的研究，并允許治療個(gè)體化的研究。這一模型為腫瘤的生物學(xué)研究提供了一個(gè)獨(dú)特的體外環(huán)境，可幫助腫瘤診斷， 觀察腫瘤侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移以及判斷預(yù)后。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。應(yīng)理解，在實(shí)施例或?qū)嶒?yàn)材料和方法中所顯示的成分用量、反應(yīng)條件等數(shù)字或是本申請(qǐng)說(shuō)明書內(nèi)容所使用的數(shù)字均為大約數(shù)值。因此，除非文中特別注明，本說(shuō)明書的上述數(shù)字參數(shù)均為近似值，其可根據(jù)欲求得的本發(fā)明結(jié)果而加以變化。并且，這些參數(shù)并非用來(lái)限定與本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍均等的原理，而是應(yīng)用正常操作技術(shù)下所得到的較佳數(shù)據(jù)。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例I可透見的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元的結(jié)構(gòu)
在本實(shí)施例中，選擇瓊脂作為可透見的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元的制作材料。可透見的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元的制作模具如圖I和圖2所示，首先設(shè)計(jì)一個(gè)長(zhǎng)方體的金屬外套，在外套內(nèi)放置3根方型金屬絲。本實(shí)施例中，將長(zhǎng)方型的外套尺寸設(shè)計(jì)為長(zhǎng)度為10mm，寬度為6. 5mm，高度為 3mm,壁厚度為O. 5mm。所述的方型金屬絲長(zhǎng)度為20mm,寬度和高度各為O. 9mm。外套管的兩端由可移動(dòng)的與外套管相匹配的蓋套密封。將1%的瓊脂溶解于pH7. 4的PBS溶液中，消毒溶解后注入的外套內(nèi)。注入瓊脂的外套管在室溫下放置15分鐘后，瓊脂凝聚成膠狀，再?gòu)哪痰沫傊腥〕鼋饘俳z，形成多個(gè)預(yù)制的內(nèi)在管腔。所用的細(xì)胞按照通常的方法培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)滿到80% — 90%時(shí)消化，消化后的細(xì)胞用毛細(xì)管作用引入三維細(xì)胞培養(yǎng)單元的內(nèi)在管腔中。根據(jù)不同的應(yīng)用，細(xì)胞也可以和其他種類的細(xì)胞或各種細(xì)胞外基質(zhì)混合，一起引入管腔或用其他常用的方法注入管腔。最后將內(nèi)腔中含有細(xì)胞的瓊脂凝膠制成的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元放入所需的培養(yǎng)液中，放于所需的常規(guī)的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。也可放入生物反應(yīng)器中培養(yǎng)。實(shí)施例2細(xì)胞種植入本發(fā)明的不同的三維空間細(xì)胞培養(yǎng)單元的比較
在本實(shí)施例中，利用實(shí)施例I中所描述的方法制備的橫截面圓形且內(nèi)腔橫截面也為圓形的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元。橫截面圓形的模具的外套尺寸為外徑約6_，內(nèi)徑約5_，壁厚約 O. 5-lmm,長(zhǎng)度為200mm,所述圓形金屬絲的直徑為O. 2mm,長(zhǎng)度為300mm。所述模具中可放置 5-8根金屬絲，在模具中加入瓊脂凝膠，制備出內(nèi)腔橫截面為圓形的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元。細(xì)胞種植入如上制備的橫截面為方形和圓形的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元的結(jié)果如圖3 所示。從圖3中可見，內(nèi)腔為方形的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元(圖3A，IOX )比內(nèi)腔為圓形的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元(圖3B，IOX )為種植的細(xì)胞提供了更大的表面黏附面積。實(shí)施例3肝癌細(xì)胞株SMMC 7721的培養(yǎng)在本實(shí)施例中，利用實(shí)施例2的方法所制備的橫截面圓形的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元所培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株SMMC 7721。所用細(xì)胞培養(yǎng)液為RPMI 1640 (Sigma R 6504) 1000ml, 100倍青霉素+鏈霉素(GIBC0 15140-122) IOml,胎牛血清100ml。培養(yǎng)條件為5% 二氧化碳，溫度 37。。。并且，本發(fā)明人還在一般的二維培養(yǎng)系統(tǒng)(普通細(xì)胞培養(yǎng)皿)中，在同樣的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度等條件下培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株SMMC 7721作為對(duì)照。肝癌細(xì)胞株SMMC 7721在二維和本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)中的生長(zhǎng)的情況如圖4所示， 其中圖4A(10X)為在傳統(tǒng)二維培養(yǎng)系統(tǒng)中肝癌細(xì)胞株SMMC 7721的培養(yǎng)生長(zhǎng)情況，可觀察到肝癌細(xì)胞株SSMC 7721在二維空間中呈平面生長(zhǎng)狀態(tài)，不能形成任何腫瘤。圖4B (IOX)是在本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)中肝癌細(xì)胞株SMMC 7721的培養(yǎng)生長(zhǎng)情況，大約到48-72小時(shí)后可觀察到肝癌細(xì)胞株SMMC 7721在三維空間中生長(zhǎng)，形成大小不等的腫瘤。其后瘤組織細(xì)胞向外界環(huán)境伸出細(xì)胞偽足突起，還可觀察到腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和/或脫落至腫瘤周圍(圖4C 20X)。在大約一周的時(shí)間內(nèi)，腫瘤細(xì)胞大量增生，形成多發(fā)性腫瘤，包括繼發(fā)性腫瘤(圖 4D 20X)。綜合圖4中各圖。肝癌細(xì)胞株SMMC 7721在二維空間中培養(yǎng)呈平面生長(zhǎng)狀態(tài)，不能形成任何腫瘤。而在本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)中肝癌細(xì)胞株培養(yǎng)大約到48-72小時(shí)后即可觀察到肝癌細(xì)胞株在三維空間中生長(zhǎng)，形成大小不等的腫瘤。其后瘤組織細(xì)胞向外界環(huán)境伸出細(xì)胞偽足突起，運(yùn)動(dòng)和/或脫落至腫瘤周圍。在大約一周的時(shí)間內(nèi)，腫瘤細(xì)胞大量增生，形成多發(fā)性腫瘤,包括繼發(fā)性腫瘤。實(shí)施例4胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞ΜΙΝ6的培養(yǎng)
在本實(shí)施例中，利用實(shí)施例2的方法所制備的橫截面圓形的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元培養(yǎng)胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞ΜΙΝ6。所用細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM (GIBC0 12800-017) 1000ml, 100倍青霉素 +鏈霉素(GIBC0 15140-122) IOml,胎牛血清150ml。培養(yǎng)條件為5% 二氧化碳，溫度37°C。并且，本發(fā)明人還在一般的二維培養(yǎng)系統(tǒng)(普通細(xì)胞培養(yǎng)皿)中，在同樣的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度等條件下培養(yǎng)胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞ΜΙΝ6作為對(duì)照。胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞ΜΙΝ6在二維和本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)中的生長(zhǎng)的情況如圖5所示，其中圖5Α(10Χ)為在傳統(tǒng)二維培養(yǎng)系統(tǒng)中腫瘤細(xì)胞ΜΙΝ6的培養(yǎng)生長(zhǎng)情況，可觀察到 ΜΙΝ6細(xì)胞在二維空間中生長(zhǎng)，部分細(xì)胞成團(tuán)簇狀生長(zhǎng)(腫瘤)。圖5Β(20Χ)是在本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)中腫瘤細(xì)胞ΜΙΝ6的培養(yǎng)生長(zhǎng)情況，可觀察到 ΜΙΝ6細(xì)胞株在三維空間中生長(zhǎng)，腫瘤體積明顯增大，脫落細(xì)胞呈現(xiàn)出原位運(yùn)動(dòng)，瘤組織外層的瘤細(xì)胞向周圍環(huán)境伸出細(xì)胞突起，如絲狀偽足和葉狀偽足等。圖5C(20X)可觀察到繼發(fā)性腫瘤從原發(fā)性腫瘤發(fā)展形成，并向管壁侵襲。圖OT(20X)可觀察到繼發(fā)性腫瘤從原發(fā)性腫瘤上脫離，向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。綜合圖5中各圖，胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞ΜΙΝ6在二維系統(tǒng)中生長(zhǎng)時(shí)，盡管可獲得一定程度的細(xì)胞的增生，但細(xì)胞的增生受到一定的限制。而當(dāng)胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞ΜΙΝ6在本發(fā)明的三維系統(tǒng)中生長(zhǎng)時(shí)，腫瘤體積明顯增大，部分細(xì)胞呈現(xiàn)出原位運(yùn)動(dòng)，向周圍環(huán)境伸出細(xì)胞突起，如絲狀偽足和葉狀偽足等。還可觀察到繼發(fā)性腫瘤從原發(fā)性腫瘤發(fā)展形成，并向管壁侵襲，以及繼發(fā)性腫瘤從原發(fā)性腫瘤上脫離，向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。實(shí)施例5肝細(xì)胞株ATCC CRL 2254的培養(yǎng)
在本實(shí)施例中，利用實(shí)施例2的原理所制備的橫截面圓形的三維空間細(xì)胞培養(yǎng)單元培養(yǎng)肝細(xì)胞株ATCC CRL 2254。所用細(xì)胞培養(yǎng)液為 DMEM/F12 (GIBC0 12400-016) 1000ml, 100 倍青霉素 + 鏈霉素(GIBC0 15140-122) IOml, 100 倍 ITS (Sigma I 1884) 10ml,地塞米松 (Sigma D 8893) 1ml,胎牛血清100ml。培養(yǎng)條件為5% 二氧化碳，溫度37°C。并且，本發(fā)明人還在一般的二維培養(yǎng)系統(tǒng)(普通細(xì)胞培養(yǎng)皿)中，在同樣的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度等條件下培養(yǎng)肝細(xì)胞株ATCC CRL 2254作為對(duì)照。肝細(xì)胞株ATCC CRL 2254在二維和三維培養(yǎng)系統(tǒng)中的生長(zhǎng)情況見圖6。其中圖 6A (20X)為肝細(xì)胞ATCC CRL 2254在二維環(huán)境中培養(yǎng)生長(zhǎng)的照片，可觀察到肝細(xì)胞株ATCC CRL 2254的生長(zhǎng)呈平面狀態(tài)，細(xì)胞之間易于發(fā)生接觸抑制，細(xì)胞的生長(zhǎng)減慢以至停頓。圖6B (IOX)為肝細(xì)胞ATCC CRL 2254在本發(fā)明的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)生長(zhǎng)的照片，可觀察到在三維生長(zhǎng)環(huán)境下，肝細(xì)胞ATCC CRL 2254聚集生長(zhǎng)，在大約12小時(shí)即可形成類似于肝臟外形的微型肝臟器官。圖6C (20X)可觀察到微型肝臟器官周圍的肝細(xì)胞向外伸展生長(zhǎng)。圖6D(10X)可觀察到伸展生長(zhǎng)的肝臟細(xì)胞形成清晰可見的管道狀結(jié)構(gòu)，并可見包膜的形成。因此可見，肝細(xì)胞株ATCC CRL 2254在二維培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)時(shí)，只能獲得有限的細(xì)胞增殖，無(wú)法生長(zhǎng)和分化而形成微型器官；但是，肝細(xì)胞株ATCC CRL 2254在本發(fā)明的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)時(shí)，在大約12小時(shí)即可形成類似于肝臟外形的微型肝臟器官。其后細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟，形成了有包膜和管道狀結(jié)構(gòu)的的類似于肝臟的微型肝臟器官。實(shí)施例6胰島素瘤(insolinoma)細(xì)胞株ATCC CRL 11506的培養(yǎng)
在本實(shí)施例中，利用實(shí)施例2的方法所制備的橫截面圓形的三維空間細(xì)胞培養(yǎng)單元培養(yǎng)胰島素瘤(insolinoma)細(xì)胞株ATCC CRL 11506。所用細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM (GIBC0 12800-017) 1000ml, 100 倍青霉素 + 鏈霉素(GIBC0 15140-122) IOml,胎牛血清 100ml。培養(yǎng)條件為5% 二氧化碳，溫度37 °C。并且，本發(fā)明人還在一般的二維培養(yǎng)系統(tǒng)(普通細(xì)胞培養(yǎng)皿)中，在同樣的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度等條件下培養(yǎng)胰島素瘤(insolinoma)細(xì)胞株ATCC CRL 11506作為對(duì)照。胰島素瘤(insolinoma)細(xì)胞株ATCC CRL 11506在二維和三維培養(yǎng)系統(tǒng)中的生長(zhǎng)情況見圖7。其中，圖7A (10X)為胰島素瘤(insolinoma)細(xì)胞株ATCC CRL 11506在二維培養(yǎng)系統(tǒng)中的培養(yǎng)生長(zhǎng)情況，可觀察到胰島素瘤(insolinoma)細(xì)胞株ATCC CRL 11506在二維環(huán)境中生長(zhǎng)，細(xì)胞呈島狀生長(zhǎng)，部分細(xì)胞形成腫瘤，脫落的細(xì)胞不能繼續(xù)生長(zhǎng)，最終死亡。圖7B (20X)為胰島素瘤(insolinoma)細(xì)胞株ATCC CRL 11506在本發(fā)明的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中的培養(yǎng)生長(zhǎng)情況，可觀察到胰島素瘤(insolinoma)細(xì)胞株ATCC CRL 11506在三維環(huán)境中生長(zhǎng)，體積明顯增大。圖7C (10X)和圖7D (10X)可觀察到胰島素瘤(insolinoma)細(xì)胞株ATCC CRL 11506在三維空間中長(zhǎng)期大量增殖生長(zhǎng)，以至長(zhǎng)滿整個(gè)管腔，最終突出管腔外。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程可達(dá)3個(gè)月或更久。實(shí)施例7肌肉細(xì)胞的培養(yǎng)在本實(shí)施例中，利用實(shí)施例I和2的方法所制備的三維空間細(xì)胞培養(yǎng)單元(空腔橫截面為方型或圓形)培養(yǎng)來(lái)源于正常人骨骼肌活檢的肌細(xì)胞(采用常規(guī)的方法，將肌肉組織切成小碎片，通過(guò)外植法(explant)進(jìn)行培養(yǎng)，并分離得到肌細(xì)胞)，所用細(xì)胞培養(yǎng)液為 DMEM (GIBC0 12800-017) 1000ml, 100 倍青霉素 + 鏈霉素(GIBC0 15140-122) IOml,馬血清2%，胰島素lOPg/ml，地塞米松O. 39μδ/πι1。培養(yǎng)條件為5% 二氧化碳，溫度37°C。并且，本發(fā)明人還在一般的二維培養(yǎng)系統(tǒng)(普通細(xì)胞培養(yǎng)皿)中，在同樣的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度等條件下培養(yǎng)肌肉細(xì)胞作為對(duì)照。圖8A (20X)為肌細(xì)胞在二維培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)狀況?？捎^察到在二維培養(yǎng)中，部份肌細(xì)胞融合。圖8B (細(xì)胞培養(yǎng)單元的空腔橫截面圓形，10X)、圖8C (細(xì)胞培養(yǎng)單元的空腔橫截面圓形，10X)、圖8D (細(xì)胞培養(yǎng)單元的空腔橫截面方型，20X)為肌細(xì)胞在本發(fā)明的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)生長(zhǎng)狀況，圖8B可觀察到在三維培養(yǎng)系統(tǒng)中，肌細(xì)胞可生長(zhǎng)形成條索狀的組織。圖SC和圖8D可觀察到在三維培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)所形成的明顯延長(zhǎng)和增寬的肌肉組織。實(shí)施例8雪旺氏細(xì)胞的培養(yǎng)
在本實(shí)施例中，利用實(shí)施例I和2的方法所制備的三維空間細(xì)胞培養(yǎng)單元(空腔橫截面為方型或圓形)培養(yǎng)來(lái)源于小鼠坐骨神經(jīng)組織的雪旺氏細(xì)胞(采用常規(guī)的方法，將小鼠坐骨神經(jīng)組織切成小碎片，通過(guò)外植法(explant)進(jìn)行培養(yǎng)，并分離得到雪旺氏細(xì)胞)，所用細(xì)胞培養(yǎng)液為CDM培養(yǎng)液+10%胎牛血清，培養(yǎng)條件為5% 二氧化碳，溫度37°C。并且，本發(fā)明人還在一般的二維培養(yǎng)系統(tǒng)(普通細(xì)胞培養(yǎng)皿)中，在同樣的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度等條件下培養(yǎng)雪旺氏細(xì)胞作為對(duì)照。代表神經(jīng)細(xì)胞的雪旺氏細(xì)胞在二維和三維培養(yǎng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)情況見圖9。其中，圖 9A (IOX)為雪旺氏細(xì)胞在二維培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)的照片，可觀察到細(xì)胞成平面狀態(tài)生長(zhǎng)分布，無(wú)法形成條索狀組織。圖9B (細(xì)胞培養(yǎng)單元的空腔橫截面圓形，10X)、圖9C (細(xì)胞培養(yǎng)單元的空腔橫截面圓形，20X)、圖9D (細(xì)胞培養(yǎng)單元的空腔橫截面方形，20X)為雪旺氏細(xì)胞在本發(fā)明的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)的照片。從圖9B和圖9C觀察到，在三維管道的環(huán)境中，雪旺氏細(xì)胞可在數(shù)小時(shí)內(nèi)形成條索狀組織。從圖9D觀察到，本發(fā)明優(yōu)選的方形管道中，雪旺氏在細(xì)胞的粘附表面積明顯增加，更有利于神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞條索的寬度顯著增寬。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種三維空間細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)制備方法，其特征在于，在外套管中放置細(xì)條索，將生物可降解材料熔解后灌注于所述外套管中，待生物可降解材料凝固定型后除去外套管和細(xì)條索，即制成三維細(xì)胞培養(yǎng)單元。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述外套管長(zhǎng)度為lmnTl200mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的制備方法，其特征在于，所述外套管為長(zhǎng)方體，寬度為Imm 700mm,高度為 O. 5mm 600mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述外套管中放置有Γ100根細(xì)條索。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或4所述的制備方法，其特征在于，所述細(xì)條索為長(zhǎng)方體、正方體或圓柱形。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述生物可降解材料為在5(T10(TC 熔解且在25 37°C凝固的生物可降解材料、或在4°C呈液態(tài)且在的25 37°C凝固的生物可降解材料。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述生物可降解材料是由生物可降解物質(zhì)形成的凝膠，其中生物可降解物質(zhì)選用瓊脂、和/或瓊脂糖、和/或水凝膠、和/或膠原，和/或Matrigel ;和/或所述生物可降解的材料是可透見的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述生物可降解材料中生物可降解物質(zhì)的濃度為O. I 10g/100ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述生物可降解材料中生物可降解物質(zhì)的濃度為8(Tl00wt%。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述生物可降解材料中還有添加細(xì)胞外基質(zhì)或營(yíng)養(yǎng)成分。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述外套管的內(nèi)腔為長(zhǎng)方體、或正方體、或圓筒體、或哺乳動(dòng)物體各種組織或器官形狀。
全文摘要
本發(fā)明提供一種三維空間細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)制備方法，在外套管中放置細(xì)條索，將生物可降解材料熔解后灌注于所述外套管中，待生物可降解材料凝固定型后除去外套管和細(xì)條索，即制成三維細(xì)胞培養(yǎng)單元。本發(fā)明提供方法制作的三維細(xì)胞培養(yǎng)單元可以應(yīng)用在長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞和生產(chǎn)大量細(xì)胞作為組織工程的種子細(xì)胞中，還可在應(yīng)用在短期內(nèi)形成再生組織和微器官的移植治療中。
文檔編號(hào)C12M3/00GK102586106SQ20121002713
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2006年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月23日
發(fā)明者劉華, 楊煒 申請(qǐng)人:劉華, 楊煒