專利名稱：一種微生物絮凝劑的兩步發(fā)酵生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境工程中廢水處理技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種微生物絮凝劑的兩步發(fā)酵生產(chǎn)方法，本發(fā)明所選用的微生物絮凝劑生產(chǎn)菌為紅平紅球菌。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)期以來，以鐵鹽、鋁鹽及其聚合物為代表的無機(jī)絮凝劑和以聚丙烯酰胺及其衍生物為代表的有機(jī)高分子絮凝劑，被成功應(yīng)用于工業(yè)廢水處理、飲用水凈化、污泥脫水、食品加工和發(fā)酵工業(yè)中。盡管無機(jī)絮凝劑和有機(jī)絮凝劑具有良好的絮凝效果，而且成本低，但是它們?cè)谑褂眠^程中對(duì)人體和環(huán)境造成了不可忽略的危害和污染。研究表明，鋁鹽不僅可誘發(fā)阿爾茨海默氏病，而且大量使用會(huì)導(dǎo)致污泥機(jī)械脫水困難；鐵鹽不僅具有很強(qiáng)的腐蝕性，而且大量使用會(huì)增加處理水的色度，影響水質(zhì)；聚丙烯酰胺是一種強(qiáng)致癌物，具有強(qiáng)烈的神經(jīng)毒性，而且難以生物降解。這些缺點(diǎn)極大地限制了無機(jī)絮凝劑和有機(jī)絮凝劑在廢水處理中的廣泛應(yīng)用。微生物絮凝劑是微生物在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的可生物降解的代謝產(chǎn)物，具有高效、 無毒、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，有良好的除濁、脫色、降解有機(jī)物的性能。目前，國內(nèi)外對(duì)產(chǎn)絮凝劑微生物和微生物絮凝劑的報(bào)道越來越多，如鄧叔波等采用曲霉寄生菌生產(chǎn)的絮凝劑對(duì)印染廢水具有高效的脫色性能，李忠等采用地衣芽孢桿菌生產(chǎn)的絮凝劑對(duì)低溫飲用水具有較好的除濁降解COD效果，Raichur等采用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的絮凝劑在洗煤廢水處理中取得了較好的效果。在微生物絮凝劑的生產(chǎn)方法和使用方法方面，也有著較多的報(bào)道，如 中國專利CN101948183A公開了醬油曲霉菌利用啤酒廢水、糖蜜廢水和味精廢水等替代培養(yǎng)基生產(chǎn)微生物絮凝劑的方法，該絮凝劑可與PAC復(fù)配使用，對(duì)電鍍廢水中的Cu2+、M2+有一定的去除作用，但是在生產(chǎn)過程中存在以下缺陷種子培養(yǎng)基的碳源用量較大(30g/L)；替代培養(yǎng)基需要外加碳源量也較大(10g/L)；絮凝率只可以達(dá)到73. 9% ；絮凝劑的產(chǎn)量較低， 僅為1.5 2. lg/L。中國專利CN101225405A公開了克雷伯氏菌利用淀粉和復(fù)合氮源生產(chǎn)微生物絮凝劑的方法，該微生物絮凝劑可與金屬離子復(fù)配使用，使絮凝劑用量降低2 4倍， 但在生產(chǎn)過程中存在以下缺陷所述的克雷伯氏菌種子液制備技術(shù)實(shí)施有困難；所復(fù)配的含鈣離子溶液和含鋁離子溶液用量大，一般為2 細(xì)1 15 20g/L的含鈣離子溶液和2 4ml2 4g/L的含鋁離子溶液；生物絮凝劑的產(chǎn)量較低。中國專利CN101327975A公開了戴爾福特食酸菌利用淀粉-硝酸鈉培養(yǎng)基生產(chǎn)微生物絮凝劑的方法，該微生物絮凝劑具有較好的絮凝性能，對(duì)印染廢水的絮凝率可達(dá)到93%，但在生產(chǎn)過程中存在一下缺陷發(fā)酵培養(yǎng)基接種量較大，達(dá)到15% (ν/ν)；絮凝劑的生產(chǎn)過程復(fù)雜，不易操作管理，尤其是絮凝劑的提取和純化過程；沒有公開生物絮凝劑的產(chǎn)量。上述專利公開的微生物絮凝劑生產(chǎn)方法中，均采用一步培養(yǎng)發(fā)酵工藝生產(chǎn)絮凝劑，即微生物菌種的種子培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度和發(fā)酵生產(chǎn)絮凝劑的發(fā)酵溫度相同、種子培養(yǎng)的搖床速度和發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑的搖床速度相同。當(dāng)溫度較高時(shí)，微生物生長(zhǎng)快，大量消耗營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致絮凝劑的產(chǎn)量下降；而較低的溫度有利于微生物代謝產(chǎn)物的積累，使得微生物絮凝劑產(chǎn)量較高，但絮凝劑生產(chǎn)周期較長(zhǎng)。較高的搖床速度可以及時(shí)補(bǔ)充培養(yǎng)基中的溶解氧，有利于微生物的生長(zhǎng)繁殖，快速生長(zhǎng)的微生物消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致微生物絮凝劑產(chǎn)量低；而較低的搖床速度有利于微生物代謝產(chǎn)物的積累，使得微生物絮凝劑產(chǎn)量較高，但絮凝劑生產(chǎn)周期較長(zhǎng)。因此，采用上述專利公開的生產(chǎn)微生物絮凝劑的方法，一方面會(huì)導(dǎo)致微生物絮凝劑產(chǎn)量低，絮凝能力低，另一方面會(huì)延長(zhǎng)微生物絮凝劑的生產(chǎn)周期，即微生物絮凝劑產(chǎn)量達(dá)到最大時(shí)的所需要的發(fā)酵時(shí)間。雖然許多微生物絮凝劑已逐漸替代無機(jī)絮凝劑和有機(jī)絮凝劑應(yīng)用于水處理領(lǐng)域， 但絮凝能力低和絮凝劑產(chǎn)量低依然是限制微生物絮凝劑在實(shí)際水處理中廣泛應(yīng)用的最大因素。因此，優(yōu)化微生物發(fā)酵條件和絮凝劑生產(chǎn)方法，仍然是提高生物絮凝劑絮凝性能和微生物絮凝劑產(chǎn)量的必然選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在于提供一種采用紅平紅球菌生產(chǎn)微生物絮凝劑的兩步發(fā)酵生產(chǎn)方法。兩步發(fā)酵生產(chǎn)微生物絮凝劑，即在發(fā)酵初期采用較高發(fā)酵溫度和搖床速度的發(fā)酵條件，縮短菌體生長(zhǎng)的停滯期，使發(fā)酵液中菌體濃度在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高水平；發(fā)酵后期采用較低發(fā)酵溫度和搖床速度的發(fā)酵條件，最大限度利用營養(yǎng)物質(zhì)生產(chǎn)絮凝劑。在提高絮凝效率和絮凝劑產(chǎn)量的同時(shí)，縮短生產(chǎn)絮凝劑的周期。本發(fā)明所述的微生物絮凝劑生產(chǎn)菌為紅平紅球菌。本發(fā)明公開的微生物絮凝劑的生產(chǎn)方法如下1、選用紅平紅球菌作為微生物絮凝劑生產(chǎn)菌；2、種子液的培養(yǎng)將菌株從斜面保藏培養(yǎng)基接種到種子培養(yǎng)基中，于觀 32°C、 110 130rpm的條件下培養(yǎng)M 30h，獲得種子液；3、發(fā)酵培養(yǎng)基的確定將種子液按1 2%的接種量接種到碳源測(cè)試培養(yǎng)基和氮源測(cè)試培養(yǎng)基，于觀 32°C、110 130rpm的條件下發(fā)酵60 72h，通過檢測(cè)菌體濃度和發(fā)酵液絮凝率，確定發(fā)酵培養(yǎng)基的成分(碳源、氮源、C/N、無機(jī)鹽、pH等)；4、兩步發(fā)酵生產(chǎn)微生物絮凝劑將種子液按1 2%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基， 采用兩步發(fā)酵生產(chǎn)方法生產(chǎn)微生物絮凝劑第一步，33 36°C、140 160rpm的條件下發(fā)酵Mh ；第二步，觀 32°C、110 130rpm的條件下發(fā)酵30 48h，得到發(fā)酵液；5、微生物絮凝劑的提取分析得知，本發(fā)明所生產(chǎn)的微生物絮凝劑絮凝成分主要分布在上清液中，微生物菌體的絮凝活性較低。因此將兩步發(fā)酵工藝所得到的發(fā)酵液在 5000 6000rpm條件下離心20 30min，去菌體后即為液體微生物絮凝劑；在液體微生物絮凝劑中加入一定比例的預(yù)冷乙醇，得到沉淀物，將沉淀物真空干燥即可獲得所述微生物絮凝劑。6、養(yǎng)殖廢水的處理將發(fā)酵液、(w/v)的CaCl2溶液與養(yǎng)殖廢水按照 1 2. 5 150 200的體積比例混合攪拌，20 40min后，過濾，去除殘?jiān)?。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.由于菌株生長(zhǎng)代謝快，生產(chǎn)絮凝劑周期短，微生物絮凝劑產(chǎn)量高，60h內(nèi)即可達(dá)到8. 9g/L的絮凝劑產(chǎn)量，因此可用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；2.高效，兩步發(fā)酵工藝生產(chǎn)的微生物絮凝劑，其絮凝率高達(dá)91. 7% ；
3.無毒，兩步發(fā)酵工藝生產(chǎn)的微生物絮凝劑，經(jīng)鑒定其絮凝成分為蛋白質(zhì)和多糖， 含量分別為66. 4%和18. 2%，絮凝成分可生物降解，無二次環(huán)境污染；4.微生物絮凝劑處理養(yǎng)殖廢水，除濁降解COD效果較好，較低的用量即可達(dá)到較好的處理效果。下面結(jié)合附表和附圖詳述本發(fā)明。附1 一步發(fā)酵和兩步發(fā)酵對(duì)菌體濃度和絮凝率的影響其中a、發(fā)酵溫度33 36°C，搖床速度140 160rpm的一步發(fā)酵對(duì)菌體濃度和絮凝率的影響b、發(fā)酵溫度28 32°C，搖床速度110 130rpm的一步發(fā)酵對(duì)菌體濃度和絮凝率的影響C、兩步發(fā)酵對(duì)菌體濃度和絮凝率的影響圖2 —步發(fā)酵和兩步發(fā)酵對(duì)微生物絮凝劑產(chǎn)量的影響圖3 兩步發(fā)酵生產(chǎn)微生物絮凝劑工藝流程

圖1、微生物絮凝劑的生產(chǎn)及提取(1)種子培養(yǎng)基及種子液種子培養(yǎng)基成分蛋白胨8. 0 10. Og/L，酵母粉4. 0 5. Og/L，牛肉粉1. 5 2. Og/L, NaCl 8. 0 10. Og/L, pH = 7. 0。105 121°C滅菌 30min。從新鮮的紅平紅球菌斜面保藏培養(yǎng)基上挑取少許菌落至種子培養(yǎng)基中，于觀 32°C、110 130rpm的條件下培養(yǎng)24 30h，獲得種子液。將此種子液作為生產(chǎn)微生物絮凝劑時(shí)的接種液。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源測(cè)試培養(yǎng)基成分碳源20. Og/L、K2HPO4 5. 0g/L、KH2PO4 2. 0g/L、NaCl 1. Og/ L、脲0. 5g/L、酵母粉5. 0g/L、MgS04 0. 2g/L，pH = 7. 0。氮源測(cè)試培養(yǎng)基成分葡萄糖20. Og/ L、K2HPO4 5. 0g/L、ΚΗ2Ρ042· 0g/L、NaCl 1. 0g/L、氮源 5. 0g/L、MgSO4 0. 2g/L, pH = 7. 0。將種子液按1 2%的接種量接種到碳源測(cè)試培養(yǎng)基和氮源測(cè)試培養(yǎng)基，于觀 32°C、110 130rpm的條件下發(fā)酵60 72h，通過檢測(cè)菌體濃度和發(fā)酵液絮凝率，確定發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為蔗糖 16 20g/L、酵母粉 3. 0 4. 0g/L、脲 0. 5 1. 0/L、NaCl 0. 2 1. 0g/L,MgSO4 0. 1 0. 2g/L、K2HPO4 3. 0 5. 0g/L、KH2PO4 1. 0 2. 0/L,發(fā)酵培養(yǎng)基初始 pH 為 8. 0 10. 0。(3)兩步發(fā)酵生產(chǎn)微生物絮凝劑如圖1所示，在發(fā)酵溫度為33 36°C和搖床速度為140 160rpm的一步發(fā)酵條件下，發(fā)酵60h，菌體濃度最大(0D_，4. 6)，絮凝率達(dá)到最高，為87. 5% ；在發(fā)酵溫度為28 32°C和搖床速度為110 130rpm的一步發(fā)酵條件下，發(fā)酵66h，菌體濃度最大(0D_，4. 1)， 絮凝率達(dá)到最高，為90. 4% ；兩步發(fā)酵條件下，發(fā)酵60h，菌體濃度最大(0D_，4. 9)，絮凝率達(dá)到最高，為91. 7%，均高于一步發(fā)酵工藝。如圖2所示，在發(fā)酵溫度為33 36°C和搖床速度為140 160rpm的一步發(fā)酵條件下，發(fā)酵60h，絮凝劑產(chǎn)量為3. 4g/L，絮凝劑產(chǎn)量較低，這是因?yàn)榫w生長(zhǎng)消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)所造成的；在發(fā)酵溫度為觀 32°C和搖床速度為110 130rpm的一步發(fā)酵條件下，絮凝劑產(chǎn)量為8. 7g/L，但生產(chǎn)絮凝劑周期較長(zhǎng)，為66h，這是因?yàn)榫暝诘蜏睾偷腿芙庋跛较律L(zhǎng)代謝慢，發(fā)酵液中菌體濃度低，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)。兩步發(fā)酵條件下，絮凝劑產(chǎn)量高達(dá)8. 9g/ L，同時(shí)生產(chǎn)絮凝劑周期縮短到60h。(4)微生物絮凝劑的提取將兩步發(fā)酵獲得的發(fā)酵液經(jīng)5000 6000rpm離心20 30min，收集上清液。在上清液中添加0.5 1.0%三氯甲烷和正丁醇(體積比4 1)，靜置6 12h，虹吸上清液，即為液體絮凝劑。在液體絮凝劑中添加1 2倍體積的預(yù)冷乙醇，靜置30 48h，經(jīng)5000 BOOOrpm離心20 30min，得到微生物絮凝劑粗制品。采用透析法進(jìn)行絮凝劑粗產(chǎn)品的純化。微生物絮凝劑粗品溶于蒸餾水后，置于由半透膜組成的透析袋內(nèi)進(jìn)行透析，4°C條件下透析M 30h后，真空干燥獲得絮凝劑純品。2、處理養(yǎng)殖廢水將發(fā)酵液、(w/v)的CaCl2溶液與養(yǎng)殖廢水按照1 2. 5 150 200的體積比例混合攪拌，20 40min后，過濾，去除殘?jiān)瑱z測(cè)化學(xué)需氧量(COD)和濁度的去除效果。
具體實(shí)施例方式1、微生物絮凝劑的生產(chǎn)從新鮮的紅平紅球菌斜面保藏培養(yǎng)基挑取少許菌落至裝有150ml種子培養(yǎng)基的 250ml搖瓶?jī)?nèi)，于30°C、120rpm的搖條件下培養(yǎng)Mh。將此種子液作為生產(chǎn)絮凝劑時(shí)的接種液。配制發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖 20g/L、酵母粉 4. Og/L、脲 1. 0/L、NaCl 1. Og/L、MgSO4 0. 2g/L、 K2HPO4 5. 0g/L,KH2PO4 2. 0/L。發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為8. 0 10. 0。按2%的接種量將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基。在發(fā)酵初期的24h內(nèi)采用發(fā)酵溫度35°C、搖床速度150rpm的發(fā)酵條件；發(fā)酵后期的36h內(nèi)采用發(fā)酵溫度30°C、搖床速度120rpm的發(fā)酵條件。將兩步發(fā)酵獲得的發(fā)酵液經(jīng)5000rpm離心30min，收集上清液。在上清液中添加 0.5%三氯甲烷和正丁醇(體積比4 1)，靜置他，虹吸上清液，在上清液中添加2倍體積的預(yù)冷乙醇，4°C條件下靜置48h，經(jīng)5000rpm離心30min，得到微生物絮凝劑粗制品。采用透析法進(jìn)行絮凝劑粗產(chǎn)品的純化。微生物絮凝劑粗品溶于蒸餾水后，置于由半透膜組成的透析袋內(nèi)進(jìn)行透析，4°C條件下透析24h后，真空干燥獲得絮凝劑純品。2、微生物絮凝劑沉降高嶺土懸濁液將發(fā)酵液、(w/v)的CaCl2溶液與4g/L的高嶺土懸濁液按1 2. 5 50的體積比混合，300rpm攪拌lmin, 180rpm攪拌4min。靜置IOmin后，檢測(cè)絮凝率，達(dá)到91. 7%0 說明紅平紅球菌生產(chǎn)的絮凝劑是一種高效的生物絮凝劑，較低的用量即可達(dá)到較高的處理效果。3、微生物絮凝劑處理養(yǎng)殖廢水養(yǎng)殖廢水中不添加任何絮凝劑或化學(xué)物質(zhì)時(shí)，沉降速度很慢，靜置15min后， IOOrnl養(yǎng)殖廢水中懸浮顆粒沉降至89ml，40min后，沉降至61ml ；當(dāng)廢水中加入一定量的發(fā)酵液后，廢水中出現(xiàn)微小絮體，沉降速度加快，靜置20min后，沉降至31ml ；當(dāng)一定量的發(fā)酵液和(w/v)的CaCl2溶液同時(shí)加入廢水中后，廢水中出現(xiàn)大而密的絮體，沉降速度更快， 靜置15min后，沉降至6ml。說明紅平紅球菌生產(chǎn)的絮凝劑對(duì)養(yǎng)殖廢水具有較好的沉降效^ ο將發(fā)酵液、(w/v)的CaCl2溶液與養(yǎng)殖廢水按1 2. 5 200的體積比混合，300rpm攪拌lmin，180rpm攪拌9min。靜置35min后，過濾，去除殘?jiān)?。所得處理水的化學(xué)需氧量(COD)由1431mg/L降至425mg/L，氨氮由1165mg/L降至411mg/L，濁度由159NTU降到43NTU?？梢?，本發(fā)明所生產(chǎn)的微生物絮凝劑具有較好的降解有機(jī)物和除濁作用。
權(quán)利要求
1.一種微生物絮凝劑的兩步發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括微生物絮凝劑生產(chǎn)菌的選取、種子液的培養(yǎng)、微生物絮凝劑的兩步發(fā)酵生產(chǎn)及微生物絮凝劑的提取。
2.根據(jù)權(quán)利1所要求的微生物絮凝劑的兩步發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于(1)種子液的培養(yǎng)將菌種接種到種子培養(yǎng)基中，于觀 32°C、110 130rpm的條件下培養(yǎng)M 30h，得到種子液；(2)微生物絮凝劑的生產(chǎn)采用兩步發(fā)酵生產(chǎn)方法生產(chǎn)絮凝劑第一步，33 36°C、 140 160rpm的條件下發(fā)酵Mh，第二步，28 32°C、110 130rpm的條件下發(fā)酵30 48h ；(3)微生物絮凝劑的提取將兩步發(fā)酵生產(chǎn)得到發(fā)酵液在5000 6000rpm條件下離心 20 30min，收集上清液；在上清液中加入1 2倍體積的預(yù)冷乙醇，得到沉淀物；將沉淀物真空干燥獲得微生物絮凝劑。
3.根據(jù)權(quán)利1所要求的微生物絮凝劑的兩步發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于種子培養(yǎng)基成分蛋白胨8.0 10. Og/L，酵母粉4. 0 5. Og/L，牛肉粉1.5 2. Og/L，NaCl 8. 0 10. 0g/L, pH = 7. 0。
4.根據(jù)權(quán)利1所要求的微生物絮凝劑的兩步發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基成分蔗糖 16 20g/L、酵母粉 3. 0 4. 0g/L、脲 0. 5 1. 0/L、NaCl 0. 2 1. 0g/L,MgSO4 0. 1 0. 2g/L、K2HPO4 3. 0 5. 0g/L、KH2PO4 1. 0 2. 0/L,發(fā)酵培養(yǎng)基初始 pH 為 8. 0 10. 0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物絮凝劑的兩步發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括微生物絮凝劑生產(chǎn)菌的選取、種子液的培養(yǎng)、微生物絮凝劑的兩步發(fā)酵生產(chǎn)及提取。所述微生產(chǎn)菌為紅平紅球菌。將菌種接種到種子培養(yǎng)基中，于28～32℃、110～130rpm的條件下培養(yǎng)24～30h，得到種子液；接種1～2％的種子液至發(fā)酵培養(yǎng)基，采用兩步發(fā)酵法生產(chǎn)微生物絮凝劑，第一步，33～36℃、140～160rpm的條件下發(fā)酵24h，第二步，28～32℃、110～130rpm的條件下發(fā)酵30～48h。兩步發(fā)酵法可使菌株在較短時(shí)間內(nèi)最大限度地利用營養(yǎng)物質(zhì)生產(chǎn)絮凝劑，在60h內(nèi)達(dá)到8.9g/L的絮凝劑產(chǎn)量。本發(fā)明公開的生產(chǎn)方法簡(jiǎn)便易行，生產(chǎn)的微生物絮凝劑具有較高的絮凝效率，對(duì)廢水的有機(jī)物降解和濁度去除具有較好的效果。
文檔編號(hào)C12P1/04GK102559768SQ20121002727
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月9日
發(fā)明者何慧軍, 吳婷, 曾光明, 李新平, 楊春平, 謝更新, 邱國良, 郭俊元 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)