專利名稱：與玉米抗絲黑穗病基因連鎖的SNP位點(diǎn)、基于該位點(diǎn)的分子標(biāo)記LSdCAP3及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種SNP位點(diǎn)及基于其開發(fā)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，特別涉及一種與玉米抗絲黑穗病主效抗病位點(diǎn)連鎖的SNP位點(diǎn)及顯著相關(guān)的分子標(biāo)記及在玉米抗絲黑穗病分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
玉米(Zea mays)是重要的糧食和飼料作物，在我國(guó)玉米種植面積已升至為第一位、單產(chǎn)和總產(chǎn)保持第二位，僅次于水稻(李少昆，2010)。隨著世界經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，物質(zhì)生活水平的提高，人們對(duì)玉米的需求趨勢(shì)呈剛性增長(zhǎng)。玉米生產(chǎn)的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)已上升為世界糧食安全和未來(lái)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的重要影響因子，而玉米病害是主要限制因素之一，提高玉米品種抗病性是實(shí)現(xiàn)穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的基礎(chǔ)。玉米絲黑穗病(Sphacelotheca reiliana(Kuhn)Clint.)是世界春播干旱、冷涼玉米產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的真菌病害，也是我國(guó)玉米生產(chǎn)(北方春玉米區(qū))上的主要病害之一。2002年僅因玉米絲黑穗病，東北三省直接損失玉米1.2億kg，農(nóng)民減收9600萬(wàn)元(以2002玉米單價(jià)，0. 8元/kg)造成相當(dāng)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(王曉鳴等，200 。利用栽培措施和藥物防治玉米絲黑穗病，既增加生產(chǎn)投入，又帶來(lái)了環(huán)境污染。另外，前人研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在玉米種質(zhì)中存抗絲黑穗病材料(王振華，2004; 孫志超，2007 ；郭滿庫(kù)，2007 ；王燕，2010)。因此，加強(qiáng)培育和推廣抗病品種是最為有效的措施，也是農(nóng)業(yè)低碳和可持續(xù)發(fā)展的有效途徑?？共∮N的關(guān)鍵在于對(duì)抗源的把握和對(duì)抗病規(guī)律的認(rèn)識(shí)。前人研究顯示，玉米對(duì)絲黑穗病菌的抗性屬數(shù)量性狀遺傳、同時(shí)受加性和顯性、上位性效應(yīng)控制，其中基因加性效應(yīng)占主導(dǎo)作用(馬秉元等，1983 ;Bemardo等，1992 ;Akhtar等1990 ；王振華等，2006)。利用不同的抗絲黑穗病玉米種質(zhì)構(gòu)建的定位群體(BC，F(xiàn)2 :3等)中已經(jīng)初步定位了至少15 個(gè)相關(guān)抗絲黑穗病的數(shù)量性狀基因位點(diǎn)WTL)，其中位于第2染色體的bin2. 09區(qū)域的主效QTL，能在多個(gè)研究中被重復(fù)檢測(cè)到，平均解釋表型變異率35%左右(LU等，1999 ；Lu等， 1999 ；Li等，2008 ；Chen等，2008 ；Shi等，2010)；同時(shí)，結(jié)合分子生物信息學(xué)和功能基因組學(xué)也挖掘出一系列抗病QTL、抗病基因類似物(RGA，Resistance Gene Analog)和絲黑穗病抗性相關(guān)的候選基因(TUGs，tentative unique genes)(吉海蓮等，2007 ；張書紅等，2007)。 但是，目前玉米種質(zhì)改良和分子輔助育種中尚未有相關(guān)抗玉米絲黑穗病主效位點(diǎn)的分子標(biāo)記開發(fā)與利用的報(bào)道。因此，分離抗絲黑穗病主效基因(或QTL)，明確其抗病遺傳機(jī)制，開發(fā)功能分子標(biāo)記，已成為下一步研究的目標(biāo)。隨著生物信息學(xué)、比較基因組學(xué)和功能基因組學(xué)的不斷發(fā)展和完善，玉米自交系B73測(cè)序工作的完成與發(fā)布，為玉米重要數(shù)量性狀基因 (或QTL)的挖掘和分子標(biāo)記的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。玉米分子標(biāo)記的研究始于1975年。自從第一張分子標(biāo)記遺傳圖譜RFLP圖譜于 1986年誕生以來(lái)，玉米分子標(biāo)記的發(fā)展經(jīng)歷了 RFLP、SSR到SNP標(biāo)記的發(fā)展歷程。研究結(jié)果表明SNPs (Single nucleotide polymorphisms)在植物基因組中是很豐富的(Drenkardet al.，2000 ；Nasu et al.，2002 ；Batley et al.，2003 ；Hayashi et al. ,2004)。與傳統(tǒng)的分子標(biāo)記比較，SNP有可以容易檢測(cè)一個(gè)小區(qū)段的優(yōu)勢(shì)。目前在植物中植物的抗病基因分子標(biāo)記定位也開始運(yùn)用SNP技術(shù)。在玉米中SNP的頻率更高，這有利于在玉米中發(fā)現(xiàn)和運(yùn)用SNP作為分子標(biāo)記進(jìn)行定位和基因克隆。Ching(2002)等研究了美國(guó)有代表性的36個(gè)玉米優(yōu)良自交系，發(fā)現(xiàn)在基因組的非編碼區(qū)平均每31個(gè)堿基就有一個(gè)SNP差異。在非編碼區(qū)還有高頻率的插入和缺失，平均每85個(gè)堿基就有一個(gè)這樣的差異。Tenaillon和Rafalski 報(bào)道在玉米3’端非翻譯區(qū)和編碼區(qū)分別有每48個(gè)堿基和130個(gè)堿基就有一個(gè)SNP差異 (Tenaillon et al. ,2001；Rafalski, 2002) CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence, CAPS)或 dCAPS(derived CAPS)標(biāo)記是利用SNP位點(diǎn)的常用方式(Michaels and Amasino，1998)。CAPS標(biāo)記是PCR 反應(yīng)和酶切相結(jié)合產(chǎn)生的一種分子標(biāo)記。如果不同的材料間在PCR擴(kuò)增區(qū)域有SNP位點(diǎn)， 且該位點(diǎn)是限制性內(nèi)切酶作用位點(diǎn)，那么不同材料的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)特定的酶切后，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳就會(huì)表現(xiàn)多態(tài)性。所以這種方法也是一種。簡(jiǎn)單的成本較低的方法。但 SNP恰好位于限制性酶切位點(diǎn)這種情況還比較少，于是在CAPS標(biāo)記的基礎(chǔ)上通過(guò)在擴(kuò)增引物中引入錯(cuò)配堿基，則可以結(jié)合SNP位點(diǎn)引入新的限制性內(nèi)切酶作用位點(diǎn)，產(chǎn)生和CAPS標(biāo)記類似的多態(tài)性。這就是dCAPS的方法。用CAPS或dCAPS的方法則可以將幾乎所有的SNP 位點(diǎn)轉(zhuǎn)化成以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記(Michaels and Amasino，1998)。玉米自交系Mol7和齊319是抗病性突出的優(yōu)良抗源。在美國(guó)和其他發(fā)達(dá)國(guó)家，分子標(biāo)記輔助選擇育種加速了玉米產(chǎn)量提高的進(jìn)程，同時(shí)為亞洲玉米種質(zhì)資源的生產(chǎn)及品質(zhì)的提高提供了巨大的潛力。但在玉米抗病分子標(biāo)記的應(yīng)用報(bào)道較少。利用傳統(tǒng)的表型鑒定選擇，需要足夠大的群體、多世代的自交或回交、適宜大小的選擇強(qiáng)度和多環(huán)境條件的鑒定表現(xiàn)。尋找與目的抗病位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記，對(duì)于分子標(biāo)記輔助抗病育種研究意義重大。所以，加快玉米抗病功能性分子標(biāo)記開發(fā)，是目前研究的重點(diǎn)，對(duì)將來(lái)分子輔助抗病回交育種、分子輔助多個(gè)抗病基因聚合育種及主效抗病基因分離都具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種與玉米抗絲黑穗病基因連鎖的SNP(單核苷酸序列多態(tài)性)位點(diǎn)。本發(fā)明的目的之二在于提供一種基于SNP位點(diǎn)開發(fā)dCAPS分子標(biāo)記的方法。本發(fā)明的目的之三在于提供一種與玉米抗絲黑穗病主效抗病位點(diǎn)顯著相關(guān)的分子標(biāo)記以及用于擴(kuò)增該分子標(biāo)記的弓I物對(duì)。本發(fā)明目的之四在于提供了以上所述的SNP位點(diǎn)以及基于SNP位點(diǎn)開發(fā)dCAPS分子標(biāo)記及其擴(kuò)增引物對(duì)在玉米抗絲黑穗病分子標(biāo)記輔助育種中的用途。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的一種與玉米抗絲黑穗病基因連鎖的SNP位點(diǎn)，命名為SNP-3，其特征在于，所述的SNP位點(diǎn)位于如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列中，所述的SNP位點(diǎn)為T51G，其中核苷酸位置的編號(hào)基于SEQ ID N0. 4所示的核苷酸序列。其中，“T51G”為SNP位點(diǎn)的一種表示方法，意在指明該SNP位點(diǎn)在SEQ IDN0. 4所示的核苷酸序列中的位置，并說(shuō)明該位置的單核苷酸的多態(tài)性，“T51G”具體表示為該SNP位點(diǎn)位于SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的第51位，并且該位置處的核苷酸為胸腺嘧啶核苷酸(T)或?yàn)轼B嘌呤核苷酸(G)。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種基于SNP位點(diǎn)開發(fā)dCAPS分子標(biāo)記的方法，其特征在于以含有與玉米抗絲黑穗病顯著相關(guān)的SNP-3位點(diǎn)的核苷酸序列為基礎(chǔ)序列，設(shè)計(jì) dCAPS引物對(duì)，以玉米總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使SNP-3位點(diǎn)有效的轉(zhuǎn)化為dCAPs標(biāo)記； 其中所述的含有與玉米抗絲黑穗病顯著相關(guān)的SNP-3位點(diǎn)的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所
7J\ ο在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述的dCAPS引物對(duì)序列如下所示LSCAP3 上游(F) GGCTGCGCCGTGAGATACT (SEQ ID NO. 2 所示)下游(R)GCTCTCGATCTGTCCTTGTCACCA (SEQ ID NO. 3 所示)本發(fā)明還提供了按照以上所述的方法制備得到的與玉米抗絲黑穗病基因緊密連鎖的dCAPS分子標(biāo)記，命名為L(zhǎng)SdCAP3，其特征在于，所述的分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。本發(fā)明的分子標(biāo)記是由玉米基因組主效抗絲黑穗病位點(diǎn)bin2. 09區(qū)域的SNP-3ID 序列轉(zhuǎn)化得到的，是一個(gè)dCAPS分子標(biāo)記，名稱為L(zhǎng)SdCAP3，來(lái)源于存在主效抗絲黑穗病位點(diǎn)的玉米自交系Mol7和齊319，是由對(duì)應(yīng)的SNP位點(diǎn)SNP-3轉(zhuǎn)化而來(lái)的，具有序列表中SEQ ID NO. 1中119個(gè)核苷酸序列，對(duì)應(yīng)的SNP位點(diǎn)位于序列表中SEQ ID NO. 4所示的101個(gè)核苷酸序列中。獲得以上所述的與玉米抗絲黑穗病基因緊密連鎖的dCAPS分子標(biāo)記的引物對(duì)，優(yōu)選的，所述的dCAPS引物對(duì)序列如下所示LSCAP3 上游(F) GGCTGCGCCGTGAGATACT (SEQ ID Ν0· 2 所示)下游(R)GCTCTCGATCTGTCCTTGTCACCA (SEQ ID NO. 3 所示)進(jìn)一步的，本發(fā)明提出了所述的與玉米抗絲黑穗病基因連鎖的SNP基因位點(diǎn)在玉米抗絲黑穗病分子標(biāo)記輔助育種中的用途。再進(jìn)一步的，本發(fā)明提出了所述的與玉米抗絲黑穗病基因緊密連鎖的dCAPS分子標(biāo)記在玉米抗絲黑穗病分子標(biāo)記輔助育種中的用途。更進(jìn)一步的，本發(fā)明提出了所述的引物對(duì)在玉米抗絲黑穗病分子標(biāo)記輔助育種中的用途。在存在主效抗絲黑穗病位點(diǎn)的玉米自交系Mol7和齊319為抗性供體的回交世代中，篩選到和玉米抗絲黑穗病主效抗病位點(diǎn)顯著相關(guān)的分子標(biāo)記，為進(jìn)一步分離和克隆抗絲黑穗病基因奠定基礎(chǔ)。同時(shí)該分子標(biāo)記可用于玉米分子標(biāo)記輔助育種工作中，用以鑒定含有主效抗絲黑穗病位點(diǎn)的單株材料。由于玉米對(duì)絲黑穗病的抗性屬數(shù)量性狀遺傳，采用前期人工菌土接種、乳熟期進(jìn)行病株率調(diào)查的傳統(tǒng)抗病性鑒定方法，耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，本發(fā)明的dCAPS標(biāo)記在玉米種子期間或子葉長(zhǎng)出的早期階段就可鑒定，省時(shí)而且準(zhǔn)確，因此可用于玉米抗絲黑穗病分子標(biāo)記輔助育種，加速玉米抗病品種選育進(jìn)程。本發(fā)明的目的是提供一個(gè)和玉米抗絲黑穗病主效抗病位點(diǎn)顯著相關(guān)的分子標(biāo)記。


圖1是標(biāo)記LSdCAP3對(duì)植株DNAPCR后的電泳條帶；1-5 孔為標(biāo)記 LSdCAP3 的 PCR 產(chǎn)物 3 ;M 為 Marker 2000圖2是LSdCAP3在齊319供體創(chuàng)建近等基因系的抗感病BSA池中的單株驗(yàn)證電泳圖；由左至右，第1孔為MARKERPBR322 ；2_13孔為齊319供體近等基因系；14-25孔為齊319供體BC4F2感病家系單株圖3是LSdCAP3標(biāo)記在10條染色體上的檢索分布圖；圖4是LSdCAP3標(biāo)記在第2染色體上的檢索分布圖；圖5是LSdCAP3標(biāo)記在第2染色體上檢索的堿基區(qū)間分布圖；圖6為L(zhǎng)SdCAP3標(biāo)記PCR產(chǎn)物BLAST后檢索結(jié)果的詳細(xì)參數(shù)及序列比對(duì)分析。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1.與玉米抗絲黑穗病主效抗病位點(diǎn)顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)的獲得一、含主效抗絲黑穗病位點(diǎn)玉米近等基因系的創(chuàng)建1親本材料Mol7是由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所，于1974年從美國(guó)引入，系 187-2XC103的二環(huán)系。該系具有遺傳基礎(chǔ)豐富、配合力高、適應(yīng)性廣、稈強(qiáng)不倒、出籽率高和抗絲黑穗病等突出優(yōu)點(diǎn)，是Lan雜優(yōu)類群的代表系和測(cè)驗(yàn)種，其與塘四平頭群、改良Reid 群和旅大紅骨子都具有較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)。因Mol7抗絲黑穗病與其組配的雜交種(Fl)也具有優(yōu)良的抗病性，所以在北方春玉米生產(chǎn)上發(fā)揮了巨大的作用。齊319是1990年由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所以外引雜交種78599為基礎(chǔ)材料，通過(guò)二環(huán)系選育而成的優(yōu)良PN類群種質(zhì)，含有豐富的熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)，配合力高，多抗性強(qiáng)，綜合性狀優(yōu)良，是PB雜種優(yōu)勢(shì)類群的優(yōu)良代表系和測(cè)驗(yàn)種。齊319高抗玉米絲黑穗病，對(duì)玉米南方銹病表現(xiàn)免疫，同時(shí)抗玉米大斑病、小斑病、青枯病、粗縮病、黑粉病等，是兼抗多種病害的優(yōu)良玉米自交系。黃早四為1975年由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所與北京市農(nóng)林科學(xué)院作物研究所在我國(guó)地方種質(zhì)“塘四平頭類群”中共同選擇育成。該系具有配合力高、適應(yīng)性廣、 耐旱性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是“塘四平頭類群”的代表系和測(cè)驗(yàn)種，同時(shí)具有株型緊湊、花粉量多、抗大斑病和矮花葉病毒病，使在我國(guó)玉米育種中應(yīng)用十分廣泛。該系高感絲黑穗病，一直成為北方春玉米區(qū)直接應(yīng)用的限制因素，加強(qiáng)對(duì)該種質(zhì)的絲黑穗病抗性改良和利用意義十分重大。2.近等基因系的基礎(chǔ)群體及創(chuàng)建過(guò)程以Mol7和齊319為抗性供體，黃早四為感病輪回親本，在田間人工接種壓力的選擇下，選擇極端抗病回交家系進(jìn)行下一輪回交和自交鑒定。對(duì)Mol7(或齊319)抗源的抗絲黑穗病回交群體構(gòu)建，主要通過(guò)選擇Mol7 (或齊319)群體中抗性家系的抗性單株進(jìn)行下一輪回交。具體創(chuàng)建過(guò)程為，首先，在授粉前對(duì)Mol7(或齊319)群體中各個(gè)家系進(jìn)行長(zhǎng)勢(shì)(株高、穗位和葉片)正常和性器官發(fā)育(抽雄、散粉和雌穗)正常評(píng)估，推測(cè)各家系對(duì)玉米抗絲黑穗病的抗性，經(jīng)3次重復(fù)的綜合評(píng)價(jià)，初步篩選出Mol7(或齊319)群體中的抗性家系及行號(hào)。第二，選擇Mol7(或齊319)抗性家系中的4-5個(gè)正常單株，單獨(dú)取花粉，一一對(duì)應(yīng)與黃早四進(jìn)行授粉雜交，同時(shí)自交，并掛牌標(biāo)示好自交單株、回交單株來(lái)源。第三，乳熟期調(diào)查Mol7(或齊319)群體中家系的發(fā)病率，依據(jù)各個(gè)家系發(fā)病率在群體中的分布情況，選擇位于波峰單側(cè)極端抗性的3-5個(gè)家系的抗性自交單株及其回交單株，并進(jìn)行保存，以備下一年種植。以此類推，創(chuàng)建出了 BC4F2 (2009年，哈爾濱)世代的基礎(chǔ)近等基因系群體。3. Mol7供體近等基因系創(chuàng)建方法以BC4F2抗性家系為材料，通過(guò)田間人工接種選擇抗性的單株，再通過(guò)SSR標(biāo)記的連鎖標(biāo)記篩選、全基因組SSR標(biāo)記背景檢測(cè)和可能抗病區(qū)域的SSR標(biāo)記檢測(cè)分析，最終篩選出僅含主效抗絲黑穗病位點(diǎn)的抗性單株。具體操作為，首先，以主效抗絲黑穗病位點(diǎn)的連鎖SSR標(biāo)記SSR148152為工具，篩選含有純合Mol7供體主效抗病位點(diǎn)的抗性單株；第二，在玉米全基因組平均隨機(jī)選取3M對(duì)SSR標(biāo)記，利用Mol7和黃早四親本間存在多態(tài)性的SSR 標(biāo)記對(duì)入選的抗性單株進(jìn)行背景恢復(fù)檢測(cè)分析。第三，在玉米染色體binl.02、bin1.03、 bin2. 08等10個(gè)可能存在玉米抗絲黑穗病的區(qū)域內(nèi)選取113個(gè)SSR標(biāo)記，利用親本Mol7 與黃早四之間存在多態(tài)性的可能抗絲黑穗病區(qū)域標(biāo)記SSRj^ 12份含主效抗絲黑穗病位點(diǎn)的高恢復(fù)率單株進(jìn)行其他可能抗絲黑穗病的位點(diǎn)檢測(cè)分析。對(duì)于無(wú)其他可能導(dǎo)入抗絲黑穗病位點(diǎn)的單株進(jìn)行自交，從而初步獲得Mol7主效抗絲黑穗病導(dǎo)入基因的純合個(gè)體，即獲得 Mol7供體近等基因系。4.齊319供體近等基因系創(chuàng)建方法以BC4F2抗性家系為材料，通過(guò)田間人工接種選擇抗性的單株，再通過(guò)SSR標(biāo)記的連鎖標(biāo)記篩選、全基因組SSR標(biāo)記背景檢測(cè)和可能抗病區(qū)域的SSR標(biāo)記檢測(cè)分析，最終篩選出僅含主效抗絲黑穗病位點(diǎn)的抗性單株。具體操作為，首先，用主效抗絲黑穗病位點(diǎn)的連鎖SSR標(biāo)記umC2077、bnlgl893和umcl525，篩選含有齊319供體純合主效抗病位點(diǎn)的抗性單株；第二，在玉米全基因組平均隨機(jī)選取324對(duì)SSR標(biāo)記，利用齊319和黃早四親本間存在多態(tài)性的SSR標(biāo)記對(duì)入選的抗性單株進(jìn)行背景恢復(fù)檢測(cè)分析。第三，在玉米染色體 binl. 02、binl. 03、bin2. 08等10個(gè)可能存在玉米抗絲黑穗病的區(qū)域內(nèi)選取113個(gè)SSR標(biāo)記，利用親本齊319與黃早四之間存在多態(tài)性SSR的標(biāo)記，對(duì)12份含主效抗絲黑穗病位點(diǎn)的高恢復(fù)率單株進(jìn)行其他可能抗絲黑穗病的位點(diǎn)檢測(cè)分析。對(duì)于無(wú)其他可能導(dǎo)入抗絲黑穗病位點(diǎn)的單株進(jìn)行自交，從而初步獲得齊319主效抗絲黑穗病導(dǎo)入基因的純合個(gè)體，即獲得齊319供體近等基因系。二、玉米抗絲黑穗病主效區(qū)域染色體2. 09內(nèi)的SNP分析本研究以抗性高且穩(wěn)定的近等基因系L35(平均發(fā)病率為2.33%，Mol7抗源， BC4F4)、L271 (平均發(fā)病率為2. 9%，齊319抗源，BC4F4)、親本Mol7、齊319、黃早四(感病輪回親本)及已知抗、感的16份自交系材料進(jìn)行基因芯片分析，最終獲得主效抗絲黑穗病位點(diǎn)(染色體2. 09區(qū)域內(nèi))的抗病相關(guān)SNP信息，其中16份自交系材料的2. 09區(qū)域基因芯片分析數(shù)據(jù)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所玉米研究室提供。而16份自交系的材料選擇，參考于玉米抗絲黑穗病主效位點(diǎn)的供體親本Mol7 (R)和齊319 (HR)，二者分別來(lái)自于LAN血緣和PB血緣材料，感病輪回親本為黃早四(HS)，源于感絲黑穗病的SPT血緣材料。為此，選擇了 LAN血緣4份、PB血緣3份和其他血緣1份，共計(jì)8份抗性自交系，田間接種發(fā)病率在0-2. 25%之間，抗病級(jí)別分別屬于HR和R ；選擇了 SPT血緣5份、PB血緣1份和其他血緣2 份，共計(jì)8份的高感病自交系，其田間接種發(fā)病率在53. 15%-89. 之間，抗病級(jí)別分別屬于HS (見表1)。在bin2. 09區(qū)域檢索到抗性差異的SNP信息(自交系的芯片數(shù)據(jù)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所玉米育種研究室和東北農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究中心共同合作完成，見表2)。表1 16份自交系芯片材料的抗病和感病分類表
權(quán)利要求
1.一種與玉米抗絲黑穗病基因連鎖的SNP位點(diǎn)，命名為SNP-3，其特征在于，所述的SNP 位點(diǎn)位于如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列中，所述的SNP位點(diǎn)為T51G，其中核苷酸位置的編號(hào)基于SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列。
2.一種基于SNP位點(diǎn)開發(fā)dCAPS分子標(biāo)記的方法，其特征在于以含有與玉米抗絲黑穗病顯著相關(guān)的SNP-3位點(diǎn)的核苷酸序列為基礎(chǔ)序列，設(shè)計(jì)dCAPS引物對(duì)，以玉米總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使SNP-3位點(diǎn)有效的轉(zhuǎn)化為dCAPs標(biāo)記；其中所述的含有與玉米抗絲黑穗病顯著相關(guān)的SNP-3位點(diǎn)的核苷酸序列如SEQ IDN0. 4所示。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的dCAPS引物對(duì)序列如下所示 LSCAP3 上游(F) GGCTGCGCCGTGAGATACT下游( GCTCTCGATCTGTCCTTGTCACCA。
4.按照權(quán)利要求2或3所述的方法得到的與玉米抗絲黑穗病基因緊密連鎖的dCAPS分子標(biāo)記，命名為L(zhǎng)SdCAP3，其特征在于，所述的分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
5.獲得權(quán)利要求4所述的與玉米抗絲黑穗病基因緊密連鎖的dCAPS分子標(biāo)記的引物對(duì)。
6.如權(quán)利要求5所述的引物對(duì)，其特征在于，所述的dCAPS引物對(duì)序列如下所示 LSCAP3 上游(F) GGCTGCGCCGTGAGATACT下游( GCTCTCGATCTGTCCTTGTCACCA。
7.權(quán)利要求1所述的與玉米抗絲黑穗病基因連鎖的SNP基因位點(diǎn)在玉米抗絲黑穗病分子標(biāo)記輔助育種中的用途。
8.權(quán)利要求4所述的與玉米抗絲黑穗病基因緊密連鎖的dCAPS分子標(biāo)記在玉米抗絲黑穗病分子標(biāo)記輔助育種中的用途。
9.權(quán)利要求5或6所述的引物對(duì)在玉米抗絲黑穗病分子標(biāo)記輔助育種中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與玉米抗絲黑穗病基因連鎖的SNP位點(diǎn)、基于該位點(diǎn)的分子標(biāo)記LSdCAP3及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的一種與玉米抗絲黑穗病基因連鎖的SNP-3位點(diǎn)，位于如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列中，基于該SNP位點(diǎn)本發(fā)明建立了與玉米抗絲黑穗病主效抗病位點(diǎn)顯著相關(guān)的分子標(biāo)記，具有序列表中SEQ ID NO.1中136個(gè)核苷酸序列。它是由主效抗病位點(diǎn)玉米基因組bin2.09區(qū)域的SNP ID序列轉(zhuǎn)化得到的，該SNP-3ID序列具有序列表中SEQ ID NO.4中的101個(gè)核苷酸序列。本發(fā)明可用于玉米抗絲黑穗病分子標(biāo)記輔助育種，加速玉米抗病品種選育進(jìn)程。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102559668SQ20121003121
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月13日
發(fā)明者于滔, 劉顯君, 張 林, 曾興, 李新海, 王振華, 翁建鋒, 邸宏, 闞帥帥 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)