專利名稱：MDRPA中merA基因的檢測(cè)引物及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多藥耐藥銅綠假單胞菌(MDRPA)中耐消毒劑merA基因攜帶情況的檢測(cè)方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
消毒防腐劑在生活中的應(yīng)用和發(fā)展已有幾個(gè)世紀(jì)。從經(jīng)驗(yàn)性地用銅和銀打造的容器來儲(chǔ)存飲用水，用醋和蜂蜜清洗傷口，用香料保存魚和肉，到用碘酒作為傷口消毒劑，在產(chǎn)科中應(yīng)用含氯水溶液，將苯酚作為傷口敷料以及在外科中作為抗菌劑，和將二價(jià)汞離子用作殺芽孢劑，整個(gè)消毒防腐劑都處在不斷的發(fā)展之中。20世紀(jì)初人類又進(jìn)一步開發(fā)了雙胍類(CRAs)和季胺類消毒劑(quateraryammon ium compounds，QACs)。到了 20 世紀(jì) 40 年代，常用的消毒防腐劑已有酚類化合物、有機(jī)汞、雙胍類消毒劑、季胺類消毒劑、碘及其復(fù)合物、乙醇、甲醛、過氧化氫、銀化合物、染料(如吖啶、三苯甲烷)和兩性表面活性劑。直到目前，這些消毒劑中的大多數(shù)仍在廣泛地使用。盡管消毒防腐劑一直在更新?lián)Q代之中，但是在其廣泛的選擇壓力下，細(xì)菌仍然漸漸產(chǎn)生了耐藥性。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌對(duì)季胺類、雙胍類以及重金屬等消毒防腐劑的耐藥與細(xì)菌本身的耐藥基因有關(guān)。merA基因編碼二價(jià)汞離子還原酶，攜帶該基因的細(xì)菌專一性地對(duì)汞離子耐藥。該基因廣泛分布于革蘭陽性和陰性細(xì)菌體內(nèi)，可以在革蘭陽性和陰性菌體之間相互轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且經(jīng)常與抗生素耐藥基因連鎖于同一質(zhì)粒如PSN 2M上。Timg等將從健康兒童口腔中分離得到的革蘭陰性細(xì)菌用100-200mmol的汞離子溶液反復(fù)誘導(dǎo)，然后通過DNA-DNA雜交和PCR 技術(shù)檢測(cè)merA基因的存在，結(jié)果表明，在8個(gè)革蘭陰性菌菌屬中檢測(cè)到merA基因，它們分別是檸檬酸桿菌屬、奈瑟菌屬、不動(dòng)桿菌屬、埃希桿菌屬、腸道細(xì)菌屬、克雷伯菌屬、假單胞菌屬和粘質(zhì)沙雷菌。經(jīng)過對(duì)不動(dòng)桿菌和大腸埃希菌中分離到的IOOObp基因進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)它們與金葡菌的merA基因的同源性高達(dá)95% -96% ；與枯草芽胞桿菌的merA基因的同源性也高達(dá)89% -97% ο目前檢測(cè)merA基因攜帶情況的方法主要有PCR后瓊脂糖凝膠電泳、測(cè)序。凝膠電泳法成本低、易操作，但靈敏度低，容易出現(xiàn)假陰性；測(cè)序是檢測(cè)基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)，但測(cè)序技術(shù)步驟繁瑣、耗時(shí)長、容易污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供多藥耐藥銅綠假單胞菌(MDRPA)中耐消毒劑merA基因攜帶情況的PCR檢測(cè)引物及其檢測(cè)方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一組MDRPA中merA基因的檢測(cè)引物，其特征在于，包括(八).11^八基因正向弓|物5，-0區(qū)8區(qū)088(；(^88081徹(；-3，；(B) .merA 基因反向弓 I物5，_acttgcggatcggtgaac_3，。本發(fā)明還提供了一種MDRPA中merA基因的檢測(cè)方法，其特征在于，采用上述MDRPA中merA基因的檢測(cè)引物，具體步驟為第一步取經(jīng)培養(yǎng)后鑒定為MDRPA陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活，提取樣本 DNA,作為檢測(cè)樣品；取不攜帶merA基因的銅綠假單胞菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為陰性對(duì)照品；人工合成merA序列，構(gòu)建攜帶merA基因的重組質(zhì)粒為陽性對(duì)照品；第二步用無菌水配制濃度為5-15umol/L的merA基因正向引物溶液，濃度為5-15umol/L的merA基因反向引物溶液以及濃度為5-15umol/L的merA基因檢測(cè)探針溶液；merA基因正向引物的序列為5，-cgagcaacccgaacatctac-3，，merA基因反向引物的序列為5’ -acttgcggatcggtgaac-3’，merA基因檢測(cè)探針的序列為 FAM-accggcggcgatg-MGBNFQ ；第三步在每一個(gè)PCR反應(yīng)孔中依次加入PCR Master Mix 10_15ul和第二步得到的merA基因正向引物溶液0. l_lul、merA基因反向引物溶液0. I-Iul、merA基因檢測(cè)探針溶液0. Ι-lul，然后在不同的PCR反應(yīng)孔中分別加入第一步得到的檢測(cè)樣品、陰性對(duì)照品及陽性對(duì)照品0. Ι-lul，用滅菌重蒸餾水補(bǔ)足25ul ；在熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為40-60°C保溫1-3分鐘，80-10(TC保溫1_3分鐘，再運(yùn)行30-50個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括在 80-100°C保溫 10-20 秒，再在 50-70°C保溫 0. 5-1. 5 分鐘；第四步用軟件SDS2. 2進(jìn)行結(jié)果分析，PCR結(jié)果呈S形曲線即為攜帶merA基因。本發(fā)明是對(duì)多藥耐藥銅綠假單胞菌中是否還有耐消毒劑merA基因的檢測(cè)，細(xì)菌一旦獲得此基因即可對(duì)現(xiàn)用的消毒劑耐受，使消毒劑失效，通過檢測(cè)了解細(xì)菌中merA基因的攜帶情況，有利于對(duì)含有耐消毒劑基因的菌株的監(jiān)控，防止菌株繼續(xù)流行，同時(shí)從科研角度對(duì)其耐藥機(jī)理的進(jìn)一步了解還有利于新的滅菌制劑的研制開發(fā)。本發(fā)明基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，應(yīng)用具有分辨率更高、雜交特異性更強(qiáng)、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)的Taqman-MGB探針，不僅檢測(cè)率高、可重復(fù)性強(qiáng)，檢測(cè)速度快，全部反應(yīng)在封閉的反應(yīng)管中完成，有效避免了交叉污染，且自動(dòng)化程度高，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控，提供質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品， 使結(jié)果判讀更直觀。


圖1為攜帶merA基因的陽性對(duì)照品的Realtime PCR曲線圖；圖2為Realtime PCR陰性對(duì)照品的Realtime PCR曲線圖；圖3為攜帶merA基因檢測(cè)樣品的Realtime PCR曲線圖；圖4為merA基因檢測(cè)樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5為merA基因檢測(cè)樣品的測(cè)序圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1、采用固相亞磷酰胺三酯法制備一組用于檢測(cè)MDRPA中merA基因攜帶情況的引物，包括merA 基因正向弓I物5，-cgagcaacccgaacatctac-3‘；merA 基因反向弓I物5，-acttgcggatcggtgaac-3'
2、檢測(cè)方法(1)取經(jīng)培養(yǎng)后鑒定為多藥耐藥銅綠假單胞菌陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活， 用商品化的細(xì)菌基因組DNA磁珠提取試劑盒(深圳易瑞生物技術(shù)有限公司，YP030(^)提取樣本DNA，稀釋至30ul (濃度lOng/ul)，置-20°C保存，待用；將標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌株(保藏單位中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)ATCC Number :27853)，高溫滅活， 用商品化的細(xì)菌基因組DNA磁珠提取試劑盒(深圳易瑞生物技術(shù)有限公司，YP030(^)提取樣本DNA，稀釋至30ul (濃度lOng/ul)，作為陰性對(duì)照品；人工合成merA序列(由上海生工合成)，構(gòu)建攜帶merA基因的重組質(zhì)粒，稀釋至30ul (濃度lOng/ul)，為陽性對(duì)照品。(2)根據(jù)merA基因的保守區(qū)域，采用ABI Primer Express 3.0實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)合成引物及Taqman探針，探針序列一端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料，另一端標(biāo)記有淬滅熒光染料(由上海生工合成)，用無菌水配制濃度為lOumol/L的merA基因正向引物溶液，濃度為lOumol/L的merA基因反向引物溶液以及濃度為lOumol/L的merA基因檢測(cè)探針溶液，其中，引物和檢測(cè)探針序列如下merA 基因正向弓I物5，-cgagcaacccgaacatctac-3，；merA 基因反向弓I物5，_acttgcggatcggtgaac_3，；merA 基因檢測(cè)探針FAM_accggcggcgatg-MGBNFQ。(3)在每一個(gè) PCR 反應(yīng)孔中加入 PCR Master Mix (Applied Biosystems 公司生產(chǎn)的 iTaqman Universal PCR Master Mix 2X，包括 10XPCR 緩沖液、MgC12、dNTP、DNA 聚合酶)12. 5ul，merA基因正向引物溶液0. 5ul，merA基因反向引物溶液0. 5ul，merA基因檢測(cè)探針溶液0. 5ul。然后在不同的PCR反應(yīng)孔中分別加入步驟(1)得到的檢測(cè)樣品、陰性對(duì)照品或陽性對(duì)照品0. 5ul，最后用滅菌重蒸餾水補(bǔ)足25ul。在ABI7300型熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C保溫2分鐘，95°C保溫2分鐘，再運(yùn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括在95°C保溫15秒，再在60°C保溫1分鐘。(4)用軟件SDS2. 2進(jìn)行結(jié)果分析，如圖1所示，為陽性對(duì)照品的Realtime PCR曲線，呈S形。如圖2所示，為陰性對(duì)照品的Realtime PCR曲線，為非S形。如圖3所示，為檢測(cè)樣品的Realtime PCR曲線，呈S形。得出判斷，該樣品為攜帶merA基因菌株。利用本發(fā)明對(duì)超過100例MDRPA樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示，根據(jù)上述方法進(jìn)行的merA 基因攜帶情況檢出率可達(dá)99%以上，可重復(fù)性達(dá)到100%。而瓊脂糖凝膠電泳法的檢出率約80%，如圖4所示，為merA基因檢測(cè)樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖；本發(fā)明與直接測(cè)序法相比，結(jié)果一致性可達(dá)到99. 5%以上，如圖5所示，為merA基因檢測(cè)樣品的測(cè)序圖。
權(quán)利要求
1.MDRPA中merA基因的檢測(cè)引物，其特征在于，包括(A)· merA 基因正向弓I物5，-cgagcaacccgaacatctac-3，；(B).merA 基因反向弓I物5，-acttgcggatcggtgaac-3，。
2.—種MDRPA中merA基因的檢測(cè)方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1所述的MDRPA中 merA基因的檢測(cè)引物，具體步驟為第一步取經(jīng)培養(yǎng)后鑒定為MDRPA陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為檢測(cè)樣品；取不攜帶merA基因的銅綠假單胞菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為陰性對(duì)照品；人工合成merA序列，構(gòu)建攜帶merA基因的重組質(zhì)粒為陽性對(duì)照品；第二步用無菌水配制濃度為5-15umol/L的merA基因正向引物溶液，濃度為5-15umol/L的merA基因反向引物溶液以及濃度為5-15umol/L的merA基因檢測(cè)探針溶液；merA基因正向引物的序列為5，-cgagcaacccgaacatctac-3', merA基因反向引物的序列為5’ -acttgcggatcggtgaac-3’，merA基因檢測(cè)探針的序列為 FAM-accggcggcgatg-MGBNFQ ；第三步在每一個(gè)PCR反應(yīng)孔中依次加入PCR Master Mix 10_15ul和第二步得到的 merA基因正向引物溶液0. l_lul、merA基因反向引物溶液0. I-Iul、merA基因檢測(cè)探針溶液0. Ι-lul，然后在不同的PCR反應(yīng)孔中分別加入第一步得到的檢測(cè)樣品、陰性對(duì)照品及陽性對(duì)照品0. Ι-lul，用滅菌重蒸餾水補(bǔ)足25ul ；在熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為40-60°C保溫1-3分鐘，80-10(TC保溫1_3分鐘，再運(yùn)行30-50個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括在 80-100°C保溫 10-20 秒，再在 50-70°C保溫 0. 5-1. 5 分鐘；第四步用軟件SDS2. 2進(jìn)行結(jié)果分析，PCR結(jié)果呈S形曲線即為攜帶merA基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一組MDRPA中merA基因的檢測(cè)引物及使用該引物的檢測(cè)方法。所述的MDRPA中merA基因的檢測(cè)引物其特征在于，包括merA基因正向引物5’-cgagcaacccgaacatctac-3’；merA基因反向引物5’-acttgcggatcggtgaac-3’。檢測(cè)方法為取經(jīng)培養(yǎng)后鑒定為MDRPA陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為檢測(cè)樣品；取不攜帶merA基因的銅綠假單胞菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為陰性對(duì)照品；人工合成merA序列，構(gòu)建攜帶merA基因的重組質(zhì)粒為陽性對(duì)照品；分別進(jìn)行PCR反應(yīng)。本發(fā)明檢測(cè)率高、可重復(fù)性強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12R1/385GK102534028SQ201210032899
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月14日
發(fā)明者傅詠南, 張奕, 王校 申請(qǐng)人:上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司