專利名稱：一株產(chǎn)阿泊拉霉素的工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗生素制藥領(lǐng)域，涉及一種工程菌及其應(yīng)用，具體地說，本發(fā)明涉及一株產(chǎn)阿泊拉霉素的工程菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黑暗鏈霉菌(Sirepio焊cm是1967年美國禮萊公司研究人員從土壤中分離得到，該菌株能產(chǎn)生一組抗生素，稱之為暗霉素復(fù)合物(Nebramycins)，組分2 :阿泊拉霉素、組分4 :氨甲?？敲顾谺和組分5 :氨甲酰妥布霉素三個(gè)組分為主組分，在對各個(gè)因子進(jìn)行生物學(xué)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)這三個(gè)組分均有良好的抗菌作用，且都是重要的原料藥。其中，阿泊拉霉素是一種對豬痢疾以及沙門氏菌病有效的畜用氨基糖苷類抗生素。阿泊拉霉素含有獨(dú)特的辛二糖結(jié)構(gòu)，對多種氨基糖苷鈍化酶具有滅活作用，對氨基糖環(huán)上不同位置修飾后所得的衍生物，可增加母體的抗菌活性，是黑暗鏈霉菌產(chǎn)生的特色化合物。目前，阿泊拉霉素的生產(chǎn)是從黑暗鏈霉菌發(fā)酵液中層析分離而得。由于暗霉素三個(gè)組分理化性質(zhì)相近，要從發(fā)酵液中對該三種組分進(jìn)行逐一分離，不但層析分離周期長，收率低，料耗大，污染嚴(yán)重，工藝復(fù)雜，而且產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。因此，長期困擾企業(yè)生產(chǎn)，阻礙了企業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)技術(shù)的升級換代，成了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)瓶頸，結(jié)果是生產(chǎn)成本高，環(huán)境污染嚴(yán)重，價(jià)格居高不下。若能獲得主產(chǎn)阿泊拉霉素的穩(wěn)定菌，則以上所有問題將迎刃而解，其所帶來的直接經(jīng)濟(jì)效益，間接社會效益和環(huán)境效益等是極其巨大的，更重要的是給清潔生產(chǎn)，安全用藥，提供了可靠保障。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株主產(chǎn)阿泊拉霉素的工程菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的一株產(chǎn)阿泊拉霉素的工程菌，所述工程菌為黑暗鏈霉菌 (S trep tomyces tenebrarius^) T103,已于2011年11月30日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC No. 5516。所述黑暗鏈霉菌 {.StreptomycesT103是通過滅活妥布霉素生物合成基因簇中'基因功能，且不產(chǎn)生氨甲酰妥布霉素。本發(fā)明還提供了所述工程菌的發(fā)酵方法，具體方法為菌株T103發(fā)酵前先用稀釋平板法分離出產(chǎn)孢豐富的單菌落轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)3—7d，挖塊接種于種子培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)18 h，轉(zhuǎn)速為180-350rpm ;然后按1_10%接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C 搖床培養(yǎng)120 h,轉(zhuǎn)速為250rpm ;所述種子培養(yǎng)基葡萄糖l_5g,玉米淀粉10_20g,黃豆餅粉 5-30g,磷酸二氫鉀O. 5-1. Og,氯化鉀l-5g，氯化鈣O. 25-5. Og,硫酸鎂O. 5-5. Og,加自來水至IL ;發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖10_30g，玉米粉10_30g，黃豆餅粉10_35g，硫酸鎂I. 0_llg，碳酸鈣l_7g，魚粉4-8g，硫酸鋅O. 1-0. 5g，硫酸銨l-7g，玉米淀粉10_50g，淀粉酶O. 01-0. 50g，
3加自來水至1L，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0-7. 2。優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)基葡萄糖5g，玉米淀粉10g，黃豆餅粉15g，磷酸二氫鉀
O.5g,氯化鉀Ig,氯化韓O. 25g,硫酸鎂5g,加自來水至IL ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖15g,玉米粉20g，黃豆餅粉35g，硫酸鎂llg，碳酸鈣7g，魚粉6g，硫酸鋅O. lg，硫酸銨7g，玉米淀粉 20g，淀粉酶O. 5g，加自來水至1L，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0-7. 2。本發(fā)明還提供了所述的工程菌在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。菌株T103的篩選，主要包括以下幾個(gè)步驟
A.基因置換質(zhì)粒的構(gòu)建；
B.置換質(zhì)粒轉(zhuǎn)化黑暗鏈霉菌；
C.轉(zhuǎn)化子的篩選；
D.工程菌代謝產(chǎn)物組分的鑒定?；蛑脫Q的方法是，采用PCR法分別獲得'基因上下游長度約IOOObp的片段，作為同源交換臂，將兩者同時(shí)連接到穿梭載體上，如PKC1139等，交換臂外插入紅霉素抗性等基因，如ermE,作為篩選標(biāo)記，便于黑暗鏈霉菌DNA重組后工程菌的篩選，最終得到置換質(zhì)粒PSH6 (圖I)。其中轉(zhuǎn)化是以疋coli ET12657(pUZ8002)介導(dǎo)的結(jié)合轉(zhuǎn)移方法。工程菌篩選過程是首先篩選紅霉素抗性(e/T EK)菌株，獲得單交換突變株(圖1，II，III)，無藥(不含紅霉素) 傳代后再從中篩選紅霉素敏感(ermEs)菌株，進(jìn)一步篩選重組的轉(zhuǎn)化子T103，獲得雙交換突變株(圖1，V)。經(jīng)發(fā)酵，采用薄層層析法(TLC法)對發(fā)酵代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步分析，鎖定目標(biāo)菌株，最后經(jīng)HPLC-MS法對目標(biāo)工程菌代謝產(chǎn)物的組分進(jìn)行精確確認(rèn)。本發(fā)明得到的目標(biāo)菌株為黑暗鏈霉菌tenebrarius) T103菌株, 已于2011年11月30日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，簡稱 CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC No. 5516。本發(fā)明獲得了一株精確阻斷了妥布霉素生物合成，主產(chǎn)阿泊拉霉素的工程菌，大大簡化了阿泊拉霉素的生產(chǎn)工藝，并降低生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染，同時(shí)提高了產(chǎn)品質(zhì)量， 達(dá)到了可大規(guī)模生產(chǎn)阿泊拉霉素的目標(biāo)。


圖I是-C'基因功能同源交換滅活示意圖
I:染色體上基因位置；II:與染色體上的Β2端單交換；III :與染色體上的BI端單交換；IV :染色體上發(fā)生了回復(fù)突變:染色體上發(fā)生了雙交換。圖2pSH6構(gòu)建流程圖。圖3是親株黑暗鏈霉菌Tt49與工程菌黑暗鏈霉菌T103發(fā)酵代謝產(chǎn)物的TLC比較分析結(jié)果
I為阿泊拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品AM ；2為野生型菌株黑暗鏈霉菌Tt49的發(fā)酵代謝產(chǎn)物；3為突變株黑暗鏈霉菌T103發(fā)酵代謝產(chǎn)物；4為氨甲酰妥布霉素標(biāo)準(zhǔn)品Τ0Β。圖4是親株黑暗鏈霉菌Tt49代謝產(chǎn)物的HPLC-MS分析圖譜
峰2對應(yīng)分子量540. 2,是阿泊拉霉素；峰4對應(yīng)分子量為511. 2,是氨甲酰妥布霉素。圖5是工程菌黑暗鏈霉菌T103代謝產(chǎn)物的HPLC-MS分析圖譜。
峰2對應(yīng)的分子量540. 2，是阿泊拉霉素。未見分子量511. 2的氨甲酰妥布霉素。圖6是提取精制得到的阿泊拉霉素產(chǎn)品。峰3為阿泊拉霉素，分子量為540. 3。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例I :試劑來源pMD19-T和限制性內(nèi)切酶等購自TaKaRa公司，質(zhì)粒pAGe (含抗性基因ermE)由上海醫(yī)藥工業(yè)研究所邵雷博士惠贈，質(zhì)粒pBR322 (含有四環(huán)素抗性基因)為本實(shí)驗(yàn)室保存。本發(fā)明主要包括以下主要步驟
I.構(gòu)建基因置換質(zhì)粒
以Piepersberg等公布的妥布霉素生物合成基因族序列(GenBank Accession Number AJ810851)作為參考，確認(rèn)出發(fā)菌株黑暗鏈霉菌Tt49(林玉雙，洪文榮，林燁等.氨甲酰妥布霉素高產(chǎn)菌株選育及其發(fā)酵特性研究[J].中國抗生素雜志，2008,33 (7) :442-445)染色體DNA上妥布霉素生物合成基因簇的相似性。然后分別在'基因上下游設(shè)計(jì)兩對引物P1/P2和P3/P4，以黑暗鏈霉菌Tt49的總DNA(DNA提取方法見白林泉.鏈霉菌基因組中DNA大片段的基因置換與克隆[D].武漢華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，1998.)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 獲得兩個(gè)片段BI和B2，其長度分別為1165 bp ( ο站/基因上游DNA序列)和1200 bp {tobC 基因下游DNA序列)，擴(kuò)增產(chǎn)物依次克隆至pMD19-T上，得重組質(zhì)粒pSHl和pSH2。以質(zhì)粒pAGe為模板，P5和P6為引物，擴(kuò)增得到紅霉素抗性基因克隆到 PMD19-T上，得到重組質(zhì)粒，命名為pSH3。pSHlHindIII/XbaI 雙酶切，回收交換臂BI片段，與pKC1139經(jīng)歷雙酶切回收的大片段進(jìn)行連接，篩選得到陽性克隆子，命名為PSH4。pSH2經(jīng)油雙酶切，回收交換臂B2片段，與pSH4皆abal/B_m雙酶切回收的大片段進(jìn)行連接，篩選得到陽性克隆子，命名為PSH5。pSH3經(jīng)&oRI單酶切后回收紅霉素抗性基因(erfX 1748bp)，插入pSH5的&oRI 位點(diǎn)，篩選得到目標(biāo)重組陽性克隆子，命名為PSH6。構(gòu)建策略見圖2。
表I實(shí)施例所涉及的引物XtmeSexjutncegmzsmtPf'AAGCTTGGAGCTGGTCGOC'AAGGT- ^H:nmiP:f-JTCTAGA TCGGTCGTGATCTCCTCWΜηΛP 5TCIAGATGCTCATCGTGGACGGCCA~ 'Λ ΙP-5 OGATCC TTGAGGCAGACGGGGICG-3.3^··ΜΙPf-5,GAAfTC CCTAGGCCTAUAATATTCC^. ￡raRlP6 P胃 PS5 .GAATTC ATAGTIC TA GA GG TA CC A GC5 二: OAGCGCCTAC TAC TTCTCCGG^。
《,TTCGG AG AAGGCGTCCU ·%· :· 柄 T : ilcoFA1 Restrictionenzyme site are indicated by singleunderlines.
2.置換質(zhì)粒pSH6轉(zhuǎn)化黑暗鏈霉菌Tt-49
將置換質(zhì)粒PSH6導(dǎo)入萬· co7i ET12567 (pUZ8002)中，得到供體菌萬· co7i ET12567 (PUZ8002，pSH6)。然后通過結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)化黑暗鏈霉菌Tt49 (林玉雙，洪文榮，林燁，等.氨甲酰妥布霉素高產(chǎn)菌株選育及其發(fā)酵特性研究[J].中國抗生素雜志，2008，33
(7):442-445)孢子，37°C培養(yǎng)18h后，用含紅霉素和萘啶酸(終濃度分別為50 μ g / mL和 25 μ g / mL)的水溶液覆蓋，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4_5天長出轉(zhuǎn)化子，將所獲得的卿於轉(zhuǎn)化子在含有紅霉素(50 μ g / mL)的斜面培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)，篩選紅霉素抗性轉(zhuǎn)化子，挑取一株命名為黑暗鏈霉菌TE49 (::pSH6)。3.雙交換菌株篩選與發(fā)酵代謝產(chǎn)物變化的定性檢測
將黑暗鏈霉菌TE49 ( pSH6)在不含抗生素的平板上連續(xù)傳三代后，挑取單菌落分別點(diǎn)種到無藥平板和含藥(紅霉素50μ g/mL)平板，篩選到28個(gè)紅霉素敏感ari菌株。分別提取其染色體，以該染色體作為模板，設(shè)計(jì)雙交換驗(yàn)證引物(P7/P8)進(jìn)行PCR驗(yàn)證后，得到I株雙交換菌株，命名為黑暗鏈霉菌T103 (Δ tobSIC、。對該菌株進(jìn)行發(fā)酵，過濾收集發(fā)酵液，濾液通過硅膠GF254薄層層析發(fā)現(xiàn)，該菌株能正常產(chǎn)生阿泊拉霉素，但未檢測到氨甲酰妥布霉素(圖3)。該濾液通過HPLC-MS定性檢測，其HPLC-MS圖譜見圖5，峰2為阿泊拉霉素，分子量為540. 2，同樣未檢測到氨甲酰妥布霉素、氨甲?？敲顾谺組分；親株黑暗鏈霉菌Tt49代謝產(chǎn)物的HPLC-MS圖譜見圖4，峰2是阿泊拉霉素，分子量為540. 2 ;峰3和峰4 是氨甲酰妥布霉素，分子量為511.2。比較圖4和圖5可以看出，工程菌T103不再產(chǎn)生氨甲酰妥布霉素，主要產(chǎn)生阿泊拉霉素。實(shí)施例2 :黑暗鏈霉菌T103代謝產(chǎn)物阿泊拉霉素的制備
本發(fā)明提供的工程菌T103可直接用于生產(chǎn)阿泊拉霉素，工程菌經(jīng)發(fā)酵后提取代謝產(chǎn)物，制備阿泊拉霉素，作為抗菌藥物。I.黑暗鏈霉菌T103工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)種子培養(yǎng)基葡萄糖5g，玉米淀粉10g，黃豆餅粉15g，磷酸二氫鉀O. 5g，氯化鉀lg，氯化鈣O. 5g，硫酸鎂5g，加自來水至1L。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖15g，玉米粉20g，黃豆餅粉35g，硫酸鎂llg，碳酸鈣7g，魚粉 6g,硫酸鋅O. lg，硫酸銨7g,玉米淀粉20g,淀粉酶O. 5g,加自來水至1L,用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH 至 7. 0-7. 2。將實(shí)例I中步驟3獲得的基因工程菌黑暗鏈霉菌T103進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。發(fā)酵前先用稀釋平板法分離出產(chǎn)孢豐富的單菌落轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)5天，挖塊接種于種子培養(yǎng)基(裝量為30mL / 250mL三角瓶)，37°C搖床培養(yǎng)18 h(轉(zhuǎn)速為250rpm)。按10%接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基(裝量為50mL/250mL三角瓶)，37°C搖床培養(yǎng)120 h(轉(zhuǎn)速為250rpm)。2.代謝產(chǎn)物提取精制 A、粗提
將上述發(fā)酵液加10%自來水稀釋，再加入鹽酸，酸化至ρΗ2. (Γ3. O,充分?jǐn)嚢?小時(shí)；然后用氫氧化鈉溶液回調(diào)至PH5. (Γ6. 5，投入732NH4+樹脂靜態(tài)吸附6 8小時(shí)。樹脂投放量按 5萬u/mL左右計(jì)算。收集吸附飽和樹脂，用自來水漂洗干凈(無漂浮菌絲體為止)。飽和樹脂裝柱，用兩倍飽和樹脂體積的O. 5M HCl溶液酸洗飽和樹脂，再用無離子水洗滌至中性，然后改用O. 01%氨水進(jìn)行堿洗，當(dāng)流出液達(dá)pH 9. O左右時(shí)，串聯(lián)到等體積的711樹脂柱上，改用4%的氨水進(jìn)行洗脫，氨水用量為飽和樹脂體積的8 10倍，洗脫時(shí)間控制在8 10小時(shí)，收集洗脫液，濃縮到原體積的1/10，然后于100°C水解4小時(shí)，過濾，得水解液。B、精制與結(jié)晶
水解液用硫酸調(diào)至PH5. 5飛.O (濃度控制在25 30萬單位/mL)，活性炭脫色至透光度達(dá)92%以上，在攪拌下，緩慢向濃縮液中滴加入95%以上乙醇，進(jìn)行結(jié)晶，時(shí)間3 4小時(shí)，之后經(jīng)固液分離，85%乙醇溶液淋洗干凈，即得濕成品。濕成品經(jīng)真空干燥(真空度500mmHg以上，溫度600°C，干燥6小時(shí))，即得硫酸阿泊拉霉素成品，收率80%以上。經(jīng)HPLC-MS分析， 與阿泊拉霉素同質(zhì)，其結(jié)果見圖6。
權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)阿泊拉霉素的工程菌,其特征在于,所述工程菌為黑暗鏈霉菌QStreptomyces tenebrarius)T103,已于2011年11月30日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC No. 5516。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一株產(chǎn)阿泊拉霉素的工程菌，其特征在于，所述黑暗鏈霉菌 {.StreptomycesT103是通過滅活妥布霉素生物合成基因簇中基因功能，且不產(chǎn)生氨甲酰妥布霉素。
3.—種如權(quán)利要求I所述的工程菌的發(fā)酵方法，其特征在于，菌株T103發(fā)酵前先用稀釋平板法分離出產(chǎn)孢豐富的單菌落轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)3 — 7d，挖塊接種于種子培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)18 h，轉(zhuǎn)速為180-350rpm ;然后按1_10%接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)120 h，轉(zhuǎn)速為250rpm ;所述種子培養(yǎng)基葡萄糖l_5g，玉米淀粉10_20g， 黃豆餅粉5-30g，磷酸二氫鉀0. 5-1. Og,氯化鉀l-5g，氯化鈣0. 5-5. Og,硫酸鎂0. 5-5. Og, 加自來水至IL ;發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖10_30g，玉米粉10_30g，黃豆餅粉10_35g，硫酸鎂 I. 0-1 lg，碳酸鈣l_7g，魚粉4-8g，硫酸鋅0. 1-0. 5g，硫酸銨l_7g，玉米淀粉10-50g，淀粉酶 0. 01-0. 50g，加自來水至1L，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0-7. 2。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的工程菌的發(fā)酵方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基葡萄糖 5g，玉米淀粉10g，黃豆餅粉15g，磷酸二氫鉀0. 5g，氯化鉀lg，氯化鈣0. 5g，硫酸鎂5g，加自來水至IL ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖15g，玉米粉20g，黃豆餅粉35g，硫酸鎂llg，碳酸鈣 7g，魚粉6g,硫酸鋅0. Ig,硫酸銨7g,玉米淀粉20g,淀粉酶0. 5g,加自來水至1L,用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0-7.2。
5.如權(quán)利要求I所述的工程菌在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種滅活tobS1-C基因功能的產(chǎn)阿泊拉霉素的工程菌及其應(yīng)用，所述工程菌為黑暗鏈霉菌(Streptomycestenebrarius)T103，已于2011年11月30日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCCNo.5516，所述的工程菌用于制備抗菌藥物。本發(fā)明獲得了主產(chǎn)阿泊拉霉素，不再產(chǎn)生氨甲酰妥布霉素的工程菌，簡化了生產(chǎn)工藝、降低了生產(chǎn)成本，同時(shí)還方便了產(chǎn)品的質(zhì)量控制。
文檔編號C12N1/21GK102586165SQ201210036210
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月17日
發(fā)明者林玉雙, 洪文榮 申請人:福州大學(xué)