專利名稱：提高球孢白僵菌幾丁酶基因抗病性以及利用其培育抗病植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。主要涉及利用分子生物學(xué)技術(shù)改造基因，獲得性能更好的新基因，以及利用植物基因工程技術(shù)將獲得的新基因用于制備抗病轉(zhuǎn)基因植物，進(jìn)一步提高植物的抗病性。
背景技術(shù)：
自從人類開始栽培作物以來，由病原菌引起的作物病害一直是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素之一。病害每年可造成全世界作物減產(chǎn)15%以上，直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)300 500億美元 (李潤植等，2001 ；Osusky等，2000)。此外，病害還引起作物產(chǎn)品品質(zhì)下降，病原菌產(chǎn)生的毒素嚴(yán)重危害人體健康。在作物病害綜合防治策略中，培育和推廣應(yīng)用抗病品種是最經(jīng)濟(jì)有效的措施。由于病原菌變異迅速，植物抗性資源有限以及常規(guī)育種方法耗時費(fèi)力，所培育的抗病品種遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)需要。利用現(xiàn)代生物技術(shù)分離、克隆和轉(zhuǎn)化抗性基因，不僅定向性強(qiáng)、基因型來源豐富，而且不受抗源親緣關(guān)系限制、育種周期短、理論上也不存在性狀的負(fù)相關(guān)連鎖，可對單一性狀進(jìn)行根本改良。此外，將某些抗病基因轉(zhuǎn)入植物中，不僅可以提高植物對病原真菌致病因子的解毒能力，而且可以提高植物獲得性系統(tǒng)抗性能力。通過這種方法獲得的抗病植物，具有抗性不易喪失、抗性基因來源廣容易轉(zhuǎn)育等優(yōu)點(diǎn)(Cornelissen 等，1993)。因此，基因工程技術(shù)已成為植物抗病育種的重要途徑。幾丁質(zhì)酶是一種水解酶，廣泛存在于植物和微生物中，具有降解幾丁質(zhì)的作用。植物病原真菌中絕大多數(shù)真菌細(xì)胞壁的主要成分是幾丁質(zhì)，而植物中還未發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶的作用底物。因此，在植物內(nèi)表達(dá)不同來源的幾丁酶基因，其產(chǎn)物不會對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響，而這些表達(dá)的異源幾丁酶卻可作用于侵入植物體內(nèi)病原真菌的細(xì)胞壁。此外，真菌細(xì)胞壁的降解產(chǎn)物還可進(jìn)一步誘導(dǎo)植物的防御反應(yīng)(Grison ei a人，1996; Velazhahan et al.，2000 ；Lorito et al.，1998)。因此，幾丁質(zhì)酶基因在植物抗病基因工程中的應(yīng)用于一直受到人們關(guān)注。幾丁質(zhì)酶在結(jié)構(gòu)上一般具有催化域和幾丁質(zhì)結(jié)合域以及連接它們的鉸鏈區(qū)。研究表明，幾丁質(zhì)結(jié)合域?qū)锥≠|(zhì)酶的作用不一定是必須的，但可以顯著提高幾丁質(zhì)酶結(jié)合幾丁質(zhì)和降解幾丁質(zhì)的能力。球孢白僵菌是一種生防真菌，廣泛應(yīng)用于生物治蟲。研究表明， 球孢白僵菌幾丁酶基因具有一定的抗病性，但是直接利用該基因提高植物的抗病性很不理想，很難獲得抗性顯著提高的轉(zhuǎn)基因植物。因此，該基因在植物抗病基因工程中的應(yīng)用受到很大的限制。序列分析表明，球孢白僵菌幾丁酶基因不具有幾丁質(zhì)結(jié)合域，這是球孢白僵菌幾丁酶基因抗病性不理想的主要原因
發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的是解決球孢白僵菌幾丁酶基因提高植物抗病性的問題，提供一種提高球孢白僵菌幾丁酶基因抗病性的方法。本發(fā)明的另一目的是利用球孢白僵菌幾丁酶基因抗病性培育抗病植物的方法。為解決上述問題，本發(fā)明采用的技術(shù)手段是，一種提高球孢白僵菌幾丁酶基因抗病性的方法，其特征在于，該方法是將球孢白僵菌幾丁酶基因Bbchitl與來自家蠶幾丁酶基因的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列SwChBD融合，獲得抗病性更優(yōu)的新基因SwBbchitl0具體步驟包括
(1)獲得球孢白僵菌幾丁酶基因助以球孢白僵菌基因組DNA為模板，序列1和序列2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pMD18載體，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆獲得助Mi 7基因序列；
(2)獲得家蠶幾丁質(zhì)酶基因的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域SwChBD序列提取家蠶4至5齡蛻皮期的mRNA，然后利用mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，序列3和序列4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pBS載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-blue感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆獲得SwChBD序列；
(3)構(gòu)建家蠶幾丁酶基因的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域與球孢白僵菌幾丁酶基因的融合基因 SwBbchitl 用KpnI與)(ba I雙酶切pMD18_Bbchitl質(zhì)粒，回收助基因片段，然后克隆入用Spe I與EcoRI消化的pBS_SwChBD質(zhì)粒，得到pBS_SwBbchitl載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后篩選陽性克隆即獲得抗病性提高的新基因SwBbchitl序列。本發(fā)明提供的利用基因提高植物抗病性的方法，是利用基因工程技術(shù)炮會SwBbchitl基因的植物表達(dá)載體p5-35S-SwBbchitl，然后將該載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌 LBA4404獲得轉(zhuǎn)化子。利用轉(zhuǎn)化子將SwBbchitl基因轉(zhuǎn)入棉花或番茄，經(jīng)組織培養(yǎng)和抗生素抗性篩選獲得再生的轉(zhuǎn)基因植株，再經(jīng)抗病鑒定后獲得抗病效果更好的轉(zhuǎn)基因植物新資源。本發(fā)明提供的一種利用抗病性提高的幾丁酶基因培育抗病植物的方法，其特征在于，構(gòu)建該基因的植物表達(dá)載體后，利用基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)入植物，獲得抗病性更好的轉(zhuǎn)基因植物。進(jìn)一步，利用球孢白僵菌幾丁酶基因抗病性培育抗病植物的方法，其特征在于包括以下步驟
(1)利用基因工程技術(shù)將獲得的新基因序列SwBbchitl可操作地插入表達(dá)載體中，構(gòu)建植物表達(dá)載體，獲得組成型表達(dá)基因的植物表達(dá)載體，該載體具有圖2所示的 p5-35S-SwBbchitl 的特征；
(2)將上述步驟(1)獲得的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得轉(zhuǎn)化子；
(3)將上述步驟(2)獲得的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化棉花或番茄，經(jīng)組織培養(yǎng)和抗生素抗性篩選獲得轉(zhuǎn)基因棉花或番茄。(4)將上述步驟(3)獲得的轉(zhuǎn)基因棉花和番茄進(jìn)行抗病鑒定和比較，獲得較球孢子白僵菌幾丁酶基因抗性更好的轉(zhuǎn)基因棉花和番茄。進(jìn)一步，將上述基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入棉花或番茄基因組，實現(xiàn)該基因的組成型表達(dá)，進(jìn)一步提高棉花或番茄的抗病能力。一種利用球孢白僵菌幾丁酶基因抗病性培育抗病植物的方法，所述基
4因的植物表達(dá)載體在制備轉(zhuǎn)基因抗病植物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于，利用分子生物學(xué)和基因工程相關(guān)技術(shù)，首先構(gòu)建了來自家蠶幾丁酶的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域SwChBD與球孢白僵菌幾丁酶基因的融合基因，獲得了抗病性較球孢白僵菌幾丁酶基因助Mi 7顯著提高的新基因5k助；然后構(gòu)建該基因的植物表達(dá)載體，并將該基因轉(zhuǎn)入棉花和番茄內(nèi)，再生植株經(jīng)嚴(yán)格的分子驗證后，利用離體葉片接種法進(jìn)行抗病鑒定。轉(zhuǎn)基因番茄Ttl代植株離體葉片噴施濃度為IO8個孢子/mL的早疫病病原菌菌液 5d，野生型對照植株葉片全部發(fā)病，病情指數(shù)達(dá)到100 ·，Π今SwBbchitl轉(zhuǎn)基因株系中有3 個株系的病情指數(shù)低于20，有4個株系的病情指數(shù)為30-40 ；而11今Bbchitl轉(zhuǎn)基因株系中沒有病情指數(shù)低于20的，病情指數(shù)20-40的僅有2個株系。轉(zhuǎn)基因棉花Ttl代植株離體葉片于101°個孢子/mL的落葉型黃萎病菌液中浸染過夜，接種7d，野生型對照病情指數(shù)達(dá)到100 {I今SwBbchitl轉(zhuǎn)基因株系中有2個株系的病情指數(shù)低于20，7今Bbchitl轉(zhuǎn)基因株系中有1個株系的病情指數(shù)為24. 3，其余株系都高于 40，沒有病情指數(shù)低于是20的株系。定量PCR檢測結(jié)果顯示，抗性更好的SwBbchitl轉(zhuǎn)基因植株與Bbchitl轉(zhuǎn)基因植株相比，前者助Mi^基因的表達(dá)量反而更低。病情指數(shù)或病級基本一致的轉(zhuǎn)基因株系相比，SwBbchitl轉(zhuǎn)基因株系中助基因的表達(dá)量較助轉(zhuǎn)基因株系內(nèi)的表達(dá)量更低。結(jié)果表明-.Bbchitl幾丁酶基因添加家蠶幾丁酶基因的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域后可有效提高助4#7基因的抗病性，進(jìn)一步有效提高了轉(zhuǎn)基因棉花和番茄對不同病害的抗性。本發(fā)明利用來自家蠶幾丁酶基因的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合球孢白僵菌幾丁酶基因，獲得了一個抗病性顯著提高的新的幾丁酶基因。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)實現(xiàn)該基因在棉花和番茄內(nèi)的組成型表達(dá)，進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)基因植株對不同病害的抗性。本發(fā)明方法簡便易行，效果顯著，獲得的抗病材料可為植物抗病育種提供新的資源，服務(wù)于生產(chǎn)，并產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)和社會效益。本發(fā)明方法不僅適用于培育抗病的棉花和番茄，同樣也適用于其它植物抗病材料的培育。
附圖表說明


圖1為SwBbchitl基因獲得的流程圖2為p5-35S-SwBbchitl載體構(gòu)建流程圖3為pBI121載體改造為p5載體流程圖4為轉(zhuǎn)基因番茄根和葉片GUS組織化學(xué)染色結(jié)果；
圖5為接種早疫病菌5d，SwBbchitl轉(zhuǎn)基因番茄的病情指數(shù)；
WT 野生型對照；Sw-I、Sw-3、Sw-5、Sw-7、Sw-10、Sw-IU Sw_12、Sw_13、Sw_14、Sw_15、 Sw-17、Sw-20和Sw-21 :SwBbchitl轉(zhuǎn)基因番茄不同株系。Transgenic lines 轉(zhuǎn)基因株系； Disease index 病情指數(shù)。圖6為接種早疫病菌HBbchitl轉(zhuǎn)基因番茄的病情指數(shù)；
WT 野生型對照；Bb-I、Bb-2、Bb_3、Bb_5、Bb_6、Bb_7、Bb_8、Bb_9、Bb_10、Bb-13 和 Bb-15 :Bbchitl轉(zhuǎn)基因番茄不同株系。Transgenic lines 轉(zhuǎn)基因株系；Disease index 病情指數(shù)。圖7為接種早疫病菌Bbchitl轉(zhuǎn)基因番茄不同病情指數(shù)株系的百分比分布； 圖8為接種早疫病菌5d，SwBbchitl轉(zhuǎn)基因番茄不同病情指數(shù)株系的百分比分布；
圖9為轉(zhuǎn)基因棉花莖和葉片⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果；
圖10為離體葉片接種落葉型黃萎病菌7d, SwBbchitl轉(zhuǎn)基因棉花的病情指數(shù)； 圖11為離體葉片接種落葉型黃萎病菌HBbchitl轉(zhuǎn)基因棉花的病情指數(shù)； 圖12為接種黃萎病病菌7d, SwBbchitl轉(zhuǎn)基因棉花不同病情指數(shù)株系的百分比分布； 圖13為接種黃萎病病菌IlBbchitl轉(zhuǎn)基因棉花不同病情指數(shù)株系的百分比分布； 圖14為接種早疫病菌5d，SwBbchitl轉(zhuǎn)基因番茄葉片的表型； 圖15接種落葉型黃萎病菌7d，5M^dii7轉(zhuǎn)基因棉花葉片的表型。表1為轉(zhuǎn)基因番茄株系的病情指數(shù)以及助MiU基因的相對表達(dá)量。表2為轉(zhuǎn)基因棉花株系的病情指數(shù)以及助基因的相對表達(dá)量。
具體實施實例
下面結(jié)合具體實施例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但以下說明并不對本發(fā)明進(jìn)行限定，任何對本發(fā)明的變形和改變，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求所定義的范圍。本發(fā)明實施實例中的藥品試劑未進(jìn)行具體說明的均為國產(chǎn)常規(guī)化學(xué)試劑，材料方法未進(jìn)行具體說明的均參考《分子克隆實驗指南》(Sambrook和Russell，2001)。實施例1:DNA的提取 1.1 DNA提取緩沖液
(1)真菌DNA提取緩沖液
Tris-HCKpH 7.5) 0.2 mol/L, NaCl 0.5 mol/L, EDTA 0. 01 mol/L, SDS 1% (w/v)。(2)植物DNA提取緩沖液
CTAB 提取液100 mmol/L Tris-HCl (pH8. 0)，20 mmol/L EDTA (pH8. 0)，1. 5 mol/ L NaCl，2% CTAB (w/v), 4% PVP40 (w/v)和2%巰基乙醇(ν/ν)，PVP和巰基乙醇使用前加入。(3)堿裂解法質(zhì)粒提取緩沖液
STE 0. 1 mol/L NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),1 mmol/L EDTA (pH 8.0)。溶液I :50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),10 mmol/L EDTA (ρΗ8· 0)。溶液II :0. 2 mol/L NaOH, 1% (w/v) SDS。溶液III 50 mL 5 mol/L 乙酸鉀，11. 5 mL 冰醋酸，28. 5 mL 水。1.2球孢白僵菌基因組DNA的提取方法
1.5 ml離心管收集球孢白僵菌菌液，10000 rpm離心5 min，棄上清液，加入真菌DNA提取液500 ？ 1，于渦旋器充分混勻，65°C水浴30 min后加入等體積的酚(pH8. 0)氯仿，然后 10000 rpm離心10 min，取上清液，加入等體積氯仿抽提1_2次，取上清液，加入2倍體積的無水乙醇，-20°C沉淀30 min。10000 rpm離心5 min,棄上清液，75%乙醇洗滌沉淀2次，然后風(fēng)干。沉淀50-100 1雙蒸水溶解后加入2-5U的RNA酶A，37°C靜置3 h，10000 rpm離心5 min,取其上清液即為球孢白僵菌基因組DNA溶液。1. 3 質(zhì)粒DNA的提取
(1)根癌農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA的提取按盧圣棟方法(1993)略作修改。取根癌農(nóng)桿菌菌液1 mL，10 000 rpm離心1 min收集菌體；用200 mL STE重懸菌體后，離心(10000 rpm, 1 min)收集菌體；加入200 mL溶液I和50 mL溶菌酶重懸菌體， 37° C溫浴30 min，加入400 mL溶液II，上下顛倒多次，冰浴不超過3 min;再加入300 mL 冰預(yù)冷的溶液III，上下顛倒多次，冰浴3 min。12 000 r/min、4° C離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中；加入上清液相同體積的酚、氯仿和異戊醇混和液(酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1)抽提一次，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中；再加入上清液相同體積的氯仿和異戊醇混和液(氯仿和異戊醇的體積比為1)抽提一次；再將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管， 加入上清液2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫靜置2 min ；12 OOOrpm,4° C離心10 min收集沉淀DNA，然后用75%的乙醇洗滌沉淀一次；室溫干燥，50 mL TE溶解沉淀即得到根癌農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA。(2 )大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取
大腸桿菌質(zhì)粒的提取采用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行。試劑盒購自Promega公司，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。實施例2: RNA的提取 2.1 RNA提取緩沖液
CTAB 提取緩沖液2%CTAB (w/v)，2% 聚乙烯吡咯烷酮 PVP40 (w/v)，1 OOmmo 1/ L Tris-HCl (pH8. 0，DEPC 處理的水配制)，25mmol/L EDTA，0. 5g/L 亞精胺 Spermidine, 2. Omol/L恥(1，^)巰基乙醇(￥八，使用前加入)。SSTE溶解液lmol/L NaCl，0. 5%SDS(w/v), lOmmol/L Tris_HCl(pH8. 0)，1. Ommo 1/ L EDTA02.2植物RNA提取方法
用CTAB法提取棉花或番茄組織的總RNA。取約3g棉花或番茄組織新鮮材料，在液氮中迅速研成粉末，裝入DEPC水處理的50ml離心管，然后加入15ml 65°C預(yù)熱的RNA提取液，顛倒混勻后65°C水浴3min，8，000 rpm,4° C離心10 min,將上清液轉(zhuǎn)入一新的DEPC水處理的50ml離心管，用等體積的氯仿異戊醇(24:1)抽提兩次。10，OOOrpmm，室溫離心5min后取上清液，加入1/4體積10 mol/L LiCl溶液，4°C放置6h以上，10，000rpm，4° C離心10 min，棄上清液，沉淀用500 μ L SSTE溶解。然后加入500 μ L酚、氯仿和異戊醇混和液(酚、 氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1)抽提一次，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中；再加入上清液相同體積的氯仿和異戊醇混和液(氯仿和異戊醇的體積比為24:1)抽提一次，10，OOOrpm, 室溫離心5min，上清液加入2倍體積-70° C預(yù)冷的無水乙醇，-70° C沉淀30min以上。 12，OOOrpm，4° C離心10 min,棄上清液，沉淀用200 μ L的DEPC處理水溶解，非變性凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA質(zhì)量后，-80° C保存?zhèn)溆谩?. 3家蠶RNA提取方法
CTAB提取緩沖液于65° C水浴鍋中預(yù)熱，離心管中加入ME (巰基乙醇，10 ml體系中加入300yL)。取約2g蠶體(去內(nèi)臟)，在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末，裝入50 mL離心管，加入16mL預(yù)熱的RNA提取液，顛倒混勻；65°C水浴3min，8，000 rpm、4° C離心10 min,將上清液轉(zhuǎn)入一新的DEPC水處理的50mL離心管，用上清液相同體積的氯仿和異戊醇混和液(氯仿和異戊醇的體積比為Μ: 1)抽提兩次。10，OOOrpmm，室溫離心5min后取上清液，加入1/4 體積10 mol/L LiCl溶液，4°C放置6h以上，10，000rpm，4° C離心10 min，棄上清液，沉淀用500 μ L SSTE溶解。然后加入500 μ L酚、氯仿和異戊醇混和液(酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1)抽提一次，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中；再加入上清液相同體積的氯仿和異戊醇混和液(氯仿和異戊醇的體積比為24:1)抽提一次，10，OOOrpm,室溫離心5min，上清液加入2倍體積-70° C預(yù)冷的無水乙醇，-70° C沉淀30min以上。12，000rpm，4° C離心 10 min,棄上清液，沉淀用200 μ L的DEPC處理水溶解，非變性凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA質(zhì)量后，-80 ° C保存?zhèn)溆?。實施?家蠶幾丁質(zhì)酶基因幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SwChBD)的獲得
提取家蠶(Bombyx mori)4至5齡蛻皮期的RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA (TaKaRa公司產(chǎn)品)。根據(jù)家蠶幾丁酶基因的cDNA序列(Genebank登錄號 AF273695)，設(shè)計引物序列3和序列4，擴(kuò)增家蠶幾丁質(zhì)酶基因的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在其 N-端引入Spe I酶切位點(diǎn)，C端引入EcoRl酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增反應(yīng)的組分10XDNA聚合酶Buffer (鼎國公司產(chǎn)品》.5 μ L, 10mmol/L dNTP 0.5“1^，5 4 11101/1上下游引物各14 1^，0嫩聚合酶0.7仏00嫩14 1^，加水至25 4 1^。循環(huán)條件:95°C,5min ；94°C，lmin ；55°C, Imin ；72°C，lmin，32 個循環(huán)；72°C，20min，瓊脂糖凝膠電泳檢測?；厥諗U(kuò)增片段克隆入PBS載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-blue感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆獲得SwChBD序列(序列11)，并測序驗證。實施例4球孢白僵菌幾丁酶基因助的獲得
以球孢白僵菌基因組DNA為模板，序列1和序列2為引物引入式OTl和損<31酶切位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pMD18載體，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆得到助基因序列(序列12)，并測序驗證。實旋例5 5k助融合基因的獲得
用幻7/ 1禾PifeiI雙酶切pMD18-Bbchitl質(zhì)粒，回收助基因片段，同時用和 EcoRl雙酶切pBS-SwChBD質(zhì)粒，回收SwChBD片段，然后同時將回收片段連接入經(jīng)和 Kpnl雙酶切的pBS載體，得到pBS-Bbchitl-SwChBD載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-blue感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆獲得Bbchitl-SwChBD融合基因，命名為SwBbchitl，并測序驗證。獲得的流程圖見圖1。實施例6 SwBbchitl植物表達(dá)載體的構(gòu)建
6. 1 組成型表達(dá)5k助基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建
W鴻NPTII篩選標(biāo)記基因和Gtt？報告基因的植物表達(dá)載體p5為基本骨架，用EcoRI 和KpnI雙酶切p5載體質(zhì)粒，回收大片段，同時用EcoRI和KpnI雙酶切pBS_SwBbchitl載體質(zhì)粒，回收小片段，然后利用DNA連接酶連接回收的片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆即獲得p5-SwBbchitl載體。然后再用KpnI和Mil雙酶切p5-SwBbchitl 載體質(zhì)粒，回收大片段，同時用KpnI和Mil雙酶切pUC-CaM35S載體質(zhì)粒，回收小片段，再利用DNA連接酶連接回收的片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆即獲得組成型表達(dá)SwBbchitl基因的植物表達(dá)載體，命名為p5-35S-SwBbchitl。p5-;35S-SwBbchitl
8植物表達(dá)載體構(gòu)建流程圖見圖2。所有限制性內(nèi)切酶均購自Roche公司，按照使用說明書操作完成。p5植物表達(dá)載體為改造常用的PBI121載體而得，改造的流程圖見圖3。6.2植物表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404
參考Bio-RAD MicroPulser用戶說明書，將構(gòu)建的組成型表達(dá)5k助基因的植物表達(dá)載體P5-35S-SwBbchitl通過電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404。實施例7 番茄的遺傳轉(zhuǎn)化 7.1番茄遺傳轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)基
基本培養(yǎng)基MSBO (MS無機(jī)+B5有機(jī)+30g/L蔗糖，pH5. 8)。固體培養(yǎng)基加入6g/L的瓊脂(Murashige 和 Skoog，1962 ；Gamborg 等，1968)；
共培養(yǎng)培養(yǎng)基MSBl MSBO+2. Omg/L 6-BA (6-芐氨基嘌呤)+0. ang/L IAA (吲哚乙酸) +IOOuM AS (乙酰丁香酮)+6g/L 瓊脂，ρΗ5· 4 ；
篩選培養(yǎng)基MSB2: MSBl+500mg/L cb (羧芐青霉素)+ 100mg/L Km (卡那霉素)+6g/L 瓊脂，pH5. 8 ；
繼代培養(yǎng)基 MSB3: MSB0+200mg/Lcb+ 100mg/L Km+6g/L 瓊脂，pH5. 8 ；
生根培養(yǎng)基 MSB4: MSBO+O. 5mg/L IAA+200mg/L Cef +50mg/L Km+6g/L 瓊脂，pH6. O。7. 2番茄的遺傳轉(zhuǎn)化 (1)轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌浸染液的制備
挑取含P5-35S-SwBbchitl載體的根癌農(nóng)桿菌單菌落，接種入附加50mg/L Km (卡那霉素)和125mg/L Sm (鏈霉素)IOmL液體YEB (5g/L蔗糖，lg/L細(xì)菌用酵母抽提物，10g/L細(xì)菌用胰化蛋白胨，0. 5g/L MgSO4 · 7H20，pH7. 0)，、200rpm培養(yǎng)過夜，然后按5%的比例將菌液接種入20mL不含抗生素的液體YEB，28°C>200rpm培養(yǎng)至0D600約為0. 8。取5mL菌液 6000rpm離心5min，傾去上清液，用IOmL MSBO液體培養(yǎng)基重懸菌體，重懸菌液即為浸染外植體的農(nóng)桿菌浸染液。(2)番茄遺傳轉(zhuǎn)化
參考Cortina等(Plant Cell,Tissue and Organ Culture, 2004, 76 (3) : 269 - 275) 的方法，以生長約IOd無菌苗的子葉為外植體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。具體操作為番茄種子1%次氯酸鈉溶液滅菌10-15min，無菌自來水沖洗5_6次， 25°C、l^i光照/8h黑暗的光周期于固體MSBO萌發(fā)約10d，生長健壯的無菌幼苗子葉作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的外植體。農(nóng)桿菌浸染液浸染外植體IOmin后傾去菌液，無菌吸水紙吸去外植體表面多余菌液，然后接種入鋪有一層無菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基MSB1，25°C暗共培養(yǎng)2d。共培養(yǎng)完成后，將外植體接種入篩選培養(yǎng)基MSB2中進(jìn)行分化培養(yǎng)，25°C、1 光照 /8h黑暗的光周期培養(yǎng)2周，然后將外植體繼代入MSB3培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷生成，每2周繼代一次。產(chǎn)生Km抗性幼芽后，將幼芽切下接種入MSB4生根培養(yǎng)基，獲得Km抗性再生植株。根長3-5cm的再生幼苗，移栽入溫室生長成苗。實施例8 轉(zhuǎn)基因番茄的分子生物學(xué)鑒定 8. 1⑶S組織化學(xué)染色
參照J(rèn)efferson等(1987)的方法，取再生植株幼嫩的根或葉片少許置GUS染色液 (500mg/L X-Gluc,0. lmol/L K3Fe (CN) 6,0. lmol/L K4Fe(CN)6,1% Triton X-100 (v/v),0. lmol/L 磷酸緩沖液(pH7. 0))中，37° C 保溫 2 h。染色后，75% 乙醇脫色，每2 h更換一次脫色液，直至未著色部分的顏色完全褪去。根或葉片都沒有藍(lán)色出現(xiàn)的再生材料為非轉(zhuǎn)基因植株，染出藍(lán)色的為轉(zhuǎn)基因植株(圖4)。8. 2 Real-time PCR 檢測
以轉(zhuǎn)基因番茄幼嫩葉片為材料提取RNA，然后利用cDNA —鏈合成試劑盒合成一鏈 cDNA，再以cDNA為模板擴(kuò)增助基因片段，以檢測助的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。Real-time PCR分析參照《分子克隆實驗指南》(Sambrook等，1995 ；Sambrook an Russel，2001)和試劑盒說明書(Bio-Rad公司產(chǎn)品)進(jìn)行。反應(yīng)體系20 mL。包括IOmL Mixture buffer (包括PCR緩沖液、DNA聚合酶、 dNIPs和MgCl2, Quantitative real-time PCR試劑盒提供，Bio-Rad公司產(chǎn)品)，上下游引物序列5和序列6各5mmol/L和1 mL cDNA 一鏈產(chǎn)物。用番茄Tubulin基因LeTUB作內(nèi)標(biāo)， 擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)基因的引物為序列7和序列8。Real-time PCR 擴(kuò)增程序為95°C，3min ;94°C，30s，55°C，30s，72°C，60s。40 個循環(huán)。Real-time PCR擴(kuò)增結(jié)果(表1)顯示，所有GUS染色陽性植株內(nèi)都能檢測到 Bbchitl基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。說明助私SwBbchitl基因已經(jīng)整合入番茄基因組。實施例9 SwBbchitlMBbchitl轉(zhuǎn)基因番茄對早疫病的抗性 9. 1抗病鑒定方法
采用離體葉片接種法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因番茄的抗病鑒定。株系植株擴(kuò)大繁殖后，每個植株取 5片生長基本一致且完全生長的葉片，每個株系共取20片葉用于離體接種。葉片向光面朝上平放，均勻噴施IO8個孢子/mL的早疫病菌孢子懸浮液，以菌液均勻濕潤葉片表面為宜， 葉柄包裹添加無菌水的脫脂棉用于保濕。接種后置22-26°C，每天16hr光照的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。接種5d，按0-4級的5級標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計葉片的發(fā)病病級并計算病情指數(shù)?？共¤b定以野生型植株為對照。0-4級的5級病級標(biāo)準(zhǔn)為
O級無病癥；
1級病斑面積占葉片面積的25%以下； 2級病斑面積占葉片面積的25-50% ； 3級病斑面積占葉片面積的50-75% ； 4級病斑面積占葉片面積的75%以上； 病情指數(shù)計算公式
病情指數(shù)=Σ(病綴栽*襪數(shù))/(4*總襪數(shù))*100
9. 2 SwBbchitl MBbchitl轉(zhuǎn)基因番茄對早疫病的抗病性比較按9. 1的抗病簽定接種方法接種病原菌5d，野生型對照植株葉片全部發(fā)病，病情指數(shù)達(dá)到100。SwBbchitl轉(zhuǎn)基因13個株系中，Sw-14, Sw-15和Sw-17等3個株系的病情指數(shù)都低于20，Sw-U Sw-3、Sw-13和Sw_21等4個株系的病情指數(shù)在30-40 (圖5)，其余株系的病情指數(shù)都為50左右。Bbchitl轉(zhuǎn)基因株系共11個，沒有病情指數(shù)低于20的轉(zhuǎn)基因株系，僅有一個株系的病情指數(shù)在20-30，1個株系的病情指數(shù)在30-40，其余多數(shù)株系的病情指數(shù)都超過了 50 (圖6)。
10
將不同病情指數(shù)的轉(zhuǎn)基因番茄株系所占百分比制作分布圖，結(jié)果顯示，助轉(zhuǎn)基因株系中64%的病情指數(shù)超過了 50，沒有病情指數(shù)低于20的株系，病情指數(shù)20-50的株系占36% (圖7)。相比較，SwBbchitl轉(zhuǎn)基因番茄中，病情指數(shù)低于20的株系占23%，病情指數(shù)20-50的株系占，超過50的僅占23% (圖8)。上述不同病情指數(shù)株系所占百分比表明，SwBbchitl基因的抗病性遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于 Bbchitl纖。因此，助幾丁酶基因添加家蠶幾丁酶基因的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域后可有效提高其抗病性。同時實現(xiàn)基因在番茄內(nèi)的組成型表達(dá)可更有效提高番茄的抗病性，培育抗病轉(zhuǎn)基因新材料。9.3 SwBbchitl和助轉(zhuǎn)基因番茄的抗病性與助基因表達(dá)量的關(guān)系以轉(zhuǎn)基因番茄幼嫩葉片為材料提取RNA，然后利用cDNA —鏈合成試劑盒合成一鏈
cDNA，再以cDNA為模板擴(kuò)增助Mi 7片段，以檢測助Mi 7的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，部分株系的檢測結(jié)果見表1。\XMBbchitl基因的相對表達(dá)水平和離體葉片接種病原菌5d后的病情指數(shù)，結(jié)果表明
a ) Bbchitl表達(dá)量接近的株系相比較(如Bb-2、Bb-6、Sw-U Sw-3和Sw_13等五個株 Bbchitl基因的相對表達(dá)量都在1-1. 1 SwBbchitl基因轉(zhuǎn)基因番茄的病情指數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于助基因的轉(zhuǎn)基因番茄，即基因表達(dá)量基本一致時，5k助轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更好的抗病性；
(2)病情指數(shù)基本一致的株系相比較(如m3-13、SW-5、SW-10和Sw-11，其病情指數(shù)都在 50左右)，SwBbchitl轉(zhuǎn)基因株系內(nèi)助基因的相對表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于助轉(zhuǎn)基因株系，即要達(dá)到相同的抗病效果，SwBbchitl轉(zhuǎn)基因植株需要的基因表達(dá)量更低；
(3)抗病性較好的株系相比較，如轉(zhuǎn)基因株系病情指數(shù)低于20的株系 (Sw-14、Sw-15)與Bbchitl病情指數(shù)30左右的株系(Bb_3、Bb_7)相比，SwBbchitl轉(zhuǎn)基因株系內(nèi)助Mi 7基因的表達(dá)量約為m^chitl轉(zhuǎn)基因株系的三分之一，即轉(zhuǎn)基因番茄要達(dá)到一個較好的抗病水平，相對而言SwBbchitl需要基因的表達(dá)量更低。綜合上述結(jié)果表明，在助基因內(nèi)融合家蠶幾丁酶的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域能有效提高助基因的抗病性。利用5k助新基因能更有效地提高轉(zhuǎn)基因番茄對早疫病的抗病效果，培育抗病植物資源。實施例10 棉花遺傳轉(zhuǎn)化
以無菌下胚軸為受體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行棉花的遺傳轉(zhuǎn)化，將 p5-35S-SwBbchitl植物表達(dá)載體整合入棉花基因組。10. 1根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化常用培養(yǎng)基
基本培養(yǎng)基MSB (MS 無機(jī)鹽+B5 有機(jī))(Τ· Murashige, 1962 ；0. L. Gamborg, 1968)； 種子萌發(fā)培養(yǎng)基1/2 MSB+20g/L蔗糖+6g/L瓊脂，自來水配制，自然pH; 共培養(yǎng)培養(yǎng)基MSB+0. 5mg/L IAA (吲哚乙酸)+0. lmg/L KT (6-糠氨基嘌呤)+30g/L 葡萄糖+100ymol/L 乙酰丁香酮+2.0g/L Gelrite (Sigma)，ρΗ5· 4 ；
篩選脫菌培養(yǎng)基MSB+0. 5mg/L IAA+0. lmg/L KT+75mg/L Km(卡那霉素)+500mg/L cef (頭孢霉素)+30g/L 葡萄糖 +2. Og/L Gelrite, pH5. 8 ；
愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB+0. 5mg/L IAA+0. lmg/L KT+30g/L 葡萄糖 +2. Og/L Gelrite, pH5. 8 ；胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB+0. lmg/L KT+30g/L 葡萄糖 +2. Og/L Gelrite，ρΗ5· 8 ； 液體懸浮培養(yǎng)基:MSB+1. 91g/L硝酸鉀+0. lmg/L KT+30g/L葡萄糖，ρΗ5· 8 ； 體胚成熟培養(yǎng)基MSB +15g/L 蔗糖+15g/L 葡萄糖 +0. lmg/L KT+2. 5g/L Gelrite, pH6. 0 ；
成苗培養(yǎng)基:SH +0. 4g/L活性碳+20g/L 蔗糖，pH6. 0。(Schenk & Hildebrandt, 1972) 10.2棉花遺傳轉(zhuǎn)化具體操作方法 (1)轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
挑取含p5-35S-SwBbchitl表達(dá)載體的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落，接種入5ml附加50mg/ L卡那霉素(Km)和125mg/L鏈霉素(Sm)的YEB液體培養(yǎng)基，28°C，180rpm振蕩培養(yǎng)至0D_ 約為1. 0，取100 μ L菌液接種入IOOmL不附加抗生素的YEB液體培養(yǎng)基，28°C、180rpm振蕩培養(yǎng)過夜，至培養(yǎng)液0D_約為1. 0，菌液室溫SOOOrpm離心5min，無菌條件下棄上清液，以原菌液體積并附加ΙΟΟμπιοΙ/L乙酰丁香酮(AS)的無菌MSB液體培養(yǎng)基(共培養(yǎng)培養(yǎng)基不附加Gelrite固化劑)重懸菌體，備用。(2)轉(zhuǎn)化外植體的獲得
棉花種子去殼，籽仁0. 1%升汞滅菌lOmin，無菌水漂洗5_6次后，接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)5-7d。無菌下胚軸切成3-5mm長的切段，作為轉(zhuǎn)化外植體。(3)下胚軸的遺傳轉(zhuǎn)化和胚性愈傷的誘導(dǎo)
農(nóng)桿菌浸染液浸染3-5mm下胚軸切段20min，傾去菌液，再用無菌濾紙吸去外植體表面多余的菌液，浸染后的下胚軸切段接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基，26°C暗培養(yǎng)2d，將下胚軸接種至篩選脫菌培養(yǎng)基，20d后繼代入附加卡那霉素(Km)和頭孢霉素(cef)的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷的誘導(dǎo)，間隔20d繼代一次，60d后繼代入胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，獲得胚性愈傷后進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)，以獲得大量生長一致的胚性愈傷。(4)體胚的誘導(dǎo)和成苗培養(yǎng)
液體懸浮培養(yǎng)的胚性愈傷，30目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，篩下的胚性愈傷均勻分散地接種入體胚成熟培養(yǎng)基，約15d大量的體胚產(chǎn)生后，將體胚繼代入SH培養(yǎng)基，促進(jìn)體胚成苗。3-4 片真葉的再生體胚苗移栽入溫室，然后于溫室內(nèi)生長繁殖。實施例11:助MiU轉(zhuǎn)基因棉花的分子生物學(xué)鑒定 11.1轉(zhuǎn)基因植株的⑶S組織化學(xué)檢測
參照J(rèn)efferson (1987)的方法，切取少許再生轉(zhuǎn)基因植株幼嫩的莖和葉片組織放入擴(kuò)增管內(nèi)，加入少許⑶S組織化學(xué)染色液，37°C暗處理lh，再用75%乙醇脫色，脫色后的莖和葉片組織體視鏡下觀察著色情況。以野生型植株為對照。組織染成藍(lán)色為陽性轉(zhuǎn)基因植株， 否則為陰性非轉(zhuǎn)基因植株(圖9)。11. 2轉(zhuǎn)基因棉花植株內(nèi)助基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的Real-time PCR檢測以轉(zhuǎn)基因棉花幼嫩葉片為材料提取RNA，然后利用cDNA —鏈合成試劑盒合成一鏈
cDNA，再以cDNA為模板擴(kuò)增助基因片段，以檢測助的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。Real-time PCR分析參照《分子克隆實驗指南》(Sambrook等，1995 ；Sambrook an Russel，2001)和試劑盒說明書(Bio-Rad公司產(chǎn)品)進(jìn)行。反應(yīng)體系20mL，包括 IOmL MIXTURE buffer(包括 PCR緩沖液、DNA聚合酶、dNIPs 和MgCl2, Quantitative real-time PCR試劑盒提供，Bio-fcid公司產(chǎn)品)，上下游引物各5mmol/L (序列5和序列6)和1 mL cDNA—鏈產(chǎn)物。用棉花基因作內(nèi)標(biāo)，擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)基因的引物為序列9和序列10。Real-time PCR擴(kuò)增程序為95°C，3min ；94°C，30s，55°C，30s， 72°C,60sο 40 個循環(huán)。Real-time PCR擴(kuò)增結(jié)果(表2)顯示，所有⑶S染色陽性植株內(nèi)都能檢測到 Bbchitl基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。說明SwBbchitl MBbchitl基因已經(jīng)成功整合入棉花基因組。實施例12 SwBbchitl ^Bbchitl轉(zhuǎn)基因棉花的抗病性 12. 1轉(zhuǎn)基因棉花抗病鑒定
利用離體葉片接種法對轉(zhuǎn)基因棉花進(jìn)行抗病鑒定。轉(zhuǎn)基因棉花Ttl代植株離體葉片于 101°個孢子/mL的落葉型黃萎病菌液中浸染過夜，然后置22-26°C，每天16hr光照的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行水培養(yǎng)。接種7d,按0-4級的5級病級標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計轉(zhuǎn)基因棉花葉片的病級，并計算病情指數(shù)。0-4級的5級病級標(biāo)準(zhǔn)為 0級葉片無病癥；
1級病斑面積占葉片面積的25%以下； 2級病斑面積占葉片面積的25-50% ； 3級病斑面積占葉片面積的50-75% ； 4級病斑面積占葉片面積的75%以上； 病情指數(shù)計算公式
病情指數(shù)=Σ(病級數(shù)*抹數(shù))/ *總抹數(shù))*100
12. 2 SwBbchitl MBbchitl轉(zhuǎn)基因棉花對黃萎病的抗病性比較按12. 1抗病鑒定方法對5k助MBbchitl轉(zhuǎn)基因棉花同時進(jìn)行了抗病鑒定。接種落葉型黃萎病菌7d，轉(zhuǎn)基因棉花株系的病情指數(shù)見圖10和圖11。結(jié)果顯示，接種7d，野生型棉花的病情指數(shù)為100。獲得的 個SwBbchitl轉(zhuǎn)基因株系中有2個株系(SwBb-2和 SwBb-8)的病情指數(shù)低于20，2個株系的病情指數(shù)在20-50之間(SwBb_4和SwBb_15)。而 7々Bbchitl轉(zhuǎn)基因株系中沒有病情指數(shù)低于20的株系，病情指數(shù)20-50之間的株系2個 (Bb-12和Bb-23)，其余株系都高于50。將不同病情指數(shù)的轉(zhuǎn)基因棉花株系所占百分比制作分布圖，結(jié)果顯示，SwBbchitl 轉(zhuǎn)基因棉花中，病情指數(shù)低于20的株系占四％，20-50的占四％，超過50的占42% (圖12)。 相比較，助did轉(zhuǎn)基因株系中71%的病情指數(shù)超過了 50，沒有病情指數(shù)低于20的株系，病情指數(shù)20-50的株系占四％ (圖13)。上述不同病情指數(shù)株系所占百分比表明，SwBbchitl基因的抗病性遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于 Bbchitl纖。因此，助幾丁酶基因添加家蠶幾丁酶基因的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域后可有效提高其抗病性。同時實現(xiàn)5k助Mi 7基因在棉花內(nèi)的組成型表達(dá)可更有效提高棉花對黃萎病的抗性，培育抗黃萎病的轉(zhuǎn)基因棉花新材料。12.3 SwBbchitl和助轉(zhuǎn)基因棉花的抗病性與助基因表達(dá)量的關(guān)系以轉(zhuǎn)基因棉花幼嫩葉片為材料提取RNA，然后利用cDNA —鏈合成試劑盒合成一鏈
cDNA，再以cDNA為模板擴(kuò)增助did基因片段，以檢測助did的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，檢測結(jié)果見表2。比較助基因的相對表達(dá)水平和離體葉片接種黃萎病菌7d后的病情指數(shù)，結(jié)果表明..SwBbchitl轉(zhuǎn)基因棉花要達(dá)到一個較好的抗病水平需要的助基因的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于助轉(zhuǎn)基因棉花，如，SwBb-2和SwBb-8，這兩個轉(zhuǎn)基因株系內(nèi)助基因的相對表達(dá)水平分別為101. 07和118. 47，病情指數(shù)都為12. 5 -,MBbchitl轉(zhuǎn)基因棉花恥_12 ■錢Bbchitl基因的相對表達(dá)水平達(dá)到了 348. 66，而該株系有病情指數(shù)卻為29. 35。又如，SwBb-15株系的病情指數(shù)為41. ？Bbchitl基因的相對表達(dá)水平為66. 81，而恥_15 和恥-20兩個株系的表達(dá)水平超過了 80，而其病情指數(shù)卻高于70。結(jié)果表明，在助基因內(nèi)融合家蠶幾丁酶的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域能有效提高 Bbchitl基因的抗病性。利用SwBbchitl新基因能更有效地提高轉(zhuǎn)基因棉花對黃萎病的抗病效果，培育抗病棉花資源。實施例13 SwBbchitl轉(zhuǎn)基因番茄和轉(zhuǎn)基因棉花的抗病表現(xiàn)
利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將p5-35S-SWm3chitl植物表達(dá)載體按實施例11和實施例12 的方法分別轉(zhuǎn)入番茄和棉花，實現(xiàn)基因在棉花和番茄內(nèi)的超量表達(dá)。轉(zhuǎn)基因番茄和轉(zhuǎn)基因棉花分別按實施例11和實施例12的方法進(jìn)行抗病鑒定。轉(zhuǎn)基因番茄接種早疫病菌5d，SwBbchitl轉(zhuǎn)基因株系的病情指數(shù)見圖5，在獲得的轉(zhuǎn)基因番茄株系中Sw-14、Sw-15和Sw-17三個株系的病情指數(shù)分別為12. 5、18. 75和 18. 75，極顯著低野生型對照的100，有效地提高了轉(zhuǎn)基因番茄對早疫病的抗性。接種5d，野生型對照植株葉片全部發(fā)病，而SwBbchitl轉(zhuǎn)基因抗病植株葉片沒有病癥，或病癥很輕(圖 14)。轉(zhuǎn)基因棉花接種強(qiáng)致病力落型型黃萎病菌高濃度孢子懸浮液7d，SwBbchitl轉(zhuǎn)基因株系的病情指數(shù)見圖10，其中SwBb-2和SwBb-8兩個株系的病情指數(shù)均只有12. 5，與野生型對照100的病情指數(shù)相比，病情指數(shù)降低了 87. 5%，極顯著低于野生型對照，達(dá)到了抗病水平。接種7d，野生型對照植株葉片全部發(fā)病，病級都達(dá)到最高級別4級，葉片布滿了病斑，而抗病植株葉片沒有病癥，或有很少的病斑(圖15)。結(jié)果表明，實現(xiàn)基因在轉(zhuǎn)基因番茄和棉花內(nèi)的組成型表達(dá)，能有效提高番茄和棉花的抗病性，培育抗病番茄和棉花新資源。上述實施實例表明，本發(fā)明提供的提高球孢白僵菌幾丁酶基因抗病性的方法獲得的新基因的抗病性顯著優(yōu)于助did基因。實現(xiàn)該基因在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)組成型表達(dá)，能更有效提高轉(zhuǎn)基因植株對真菌病害的抗性。本發(fā)明方法簡便易行，效果顯著，具有很好的市場前景。
表1轉(zhuǎn)基因番茄株系的病情指數(shù)以及助did基因的相對表達(dá)量轉(zhuǎn)基因株系|Bbchitl基因相對表達(dá)水平 I病情指數(shù)
WT_0. 00_100. 00
Bb-2 ~ 1.0061.11
Bb-3 ~3.4728.33
Bb-6 — 1.0779. 17
Bb-7 ~3. 1731.25
Bb-8 ~2. 1244.44
Bb-IO ~0.03100.00
Bb-13 ~2. 1050.00
Sw-I — 1.0735.42
Sw-3 — 1.0435.42
Sw-5|θ. 21丨47.92
1權(quán)利要求
1.一種提高球孢白僵菌幾丁酶基因抗病性的方法，其特征在于，在球孢白僵菌幾丁酶基因中添加家蠶幾丁酶基因的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，提高球孢白僵菌幾丁酶基因的抗病性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述提高球孢白僵菌幾丁酶基因抗病性的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)獲得球孢白僵菌幾丁酶基因助以球孢白僵菌基因組DNA為模板，以序列 1和序列2為引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與PMD18載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆獲得助Mi 7基因序列；(2)獲得家蠶幾丁質(zhì)酶基因的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域SwChBD利用家蠶4至5齡蛻皮期的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；以cDNA為模板，以序列3和序列4為引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入PBS載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-blue感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆獲得SwChBD序列；(3)構(gòu)建家蠶幾丁酶基因的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域SwChBD與球孢白僵菌幾丁酶基因 Bbchitl的融合基因用KpnI與Xba I雙酶切pMD18_Bbchitl質(zhì)粒，回收助基因片段，然后克隆入用SpeI與EcoRI消化的pBS_SwChBD質(zhì)粒，得到pBS-SwBbchitl載體； 轉(zhuǎn)化大腸桿菌后篩選陽性克隆即獲得抗病性提高的新基因SwBbchitl序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高球孢白僵菌幾丁酶基因抗病性的方法，其特征在于，將權(quán)利要求2的步驟(1)獲得的球孢白僵菌幾丁酶基因助4#7與步驟(2)獲得的家蠶幾丁酶基因的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域SwChBD融合，構(gòu)建融合基因5k^cAii7，獲得較球孢白僵菌幾丁酶基因抗病性更好的新基因。
4.一種利用球孢白僵菌幾丁酶基因抗病性培育抗病植物的方法，其特征在于，構(gòu)建球孢白僵菌幾丁酶基因助4#7的植物表達(dá)載體后，利用基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)入植物，獲得抗病性更好的轉(zhuǎn)基因植物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述利用球孢白僵菌幾丁酶基因抗病性培育抗病植物的方法，其特征在于包括以下步驟1)將權(quán)利要求2步驟(3)獲得的新基因序列SwBbchitl可操作地插入表達(dá)載體中，構(gòu)建植物表達(dá)載體，獲得組成型表達(dá)基因的植物表達(dá)載體；2)將上述步驟(1)獲得的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得轉(zhuǎn)化子；3)將上述步驟(2)獲得的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化棉花或番茄，經(jīng)組織培養(yǎng)和抗性篩選獲得轉(zhuǎn)基因棉花或番茄。
6.一種利用球孢白僵菌幾丁酶基因抗病性培育抗病植物的方法，其特征在于，將權(quán)利要求5所述基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入棉花或番茄基因組，實現(xiàn)該基因的組成型表達(dá)，進(jìn)一步提高棉花或番茄的抗病能力。
7.一種利用球孢白僵菌幾丁酶基因抗病性培育抗病植物的方法，其特征在于，將權(quán)利要求5驗SwBbchitl基因的植物表達(dá)載體在制備轉(zhuǎn)基因抗病植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種提高球孢白僵菌幾丁酶基因Bbchit1的抗病性以及利用其培育抗病植物的方法。該方法是將家蠶幾丁酶基因的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域與球孢白僵菌幾丁酶基因融合，提高球孢白僵菌幾丁酶基因的抗病性。利用35S啟動子控制該融合基因SwBbchit1并構(gòu)建植物表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)入棉花和番茄，可進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)基因棉花和番茄的抗病性。利用本發(fā)明方法獲得的SwBbchit1轉(zhuǎn)基因蕃茄和棉花比Bbchit1轉(zhuǎn)基因番茄和棉花抗病性明顯提高。
文檔編號C12N15/70GK102533819SQ201210038380
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月20日
發(fā)明者侯磊, 宋水清, 張瑞芝, 李先碧, 李德謀, 梁愛敏, 羅小英, 羅志兵, 羅明, 肖月華, 范艷華, 裴炎, 金丹 申請人:西南大學(xué)