專(zhuān)利名稱(chēng)：豬PPARδ基因5’調(diào)控區(qū)作為脂肪沉積性狀的遺傳標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬的分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與豬的脂肪性狀相關(guān)基因PPAR δ 5’調(diào)控區(qū)片段的克隆及其作為豬脂肪性狀遺傳標(biāo)記與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
分子標(biāo)記輔助選擇(MAS,marker-assisted selection)是隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展而產(chǎn)生的新技術(shù)，它可以從分子水平上快速準(zhǔn)確地分析個(gè)體的遺傳組成，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因型的直接選擇，進(jìn)行分子育種。分子標(biāo)記直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個(gè)組織各個(gè)發(fā)育階段均可檢測(cè)到，不受季節(jié)環(huán)境限制；多態(tài)性豐富，數(shù)量多；大多數(shù)為共顯性，能區(qū)別純合體和雜合體。因此，分子標(biāo)記輔助選擇具有高準(zhǔn)確性，可用于早期選種，縮短世代間隔。與常規(guī)育種相結(jié)合，可大大加快育種進(jìn)程。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)標(biāo)記是同一物種不同個(gè)體基因組DNA的等位序列上單個(gè)核苷酸存在差別的現(xiàn)象，它具體是指由基因組單核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括堿基轉(zhuǎn)換、顛換、單堿基插入或缺失等，被公認(rèn)為是最新的第三代DNA分子標(biāo)記。核激素受體超家族過(guò)氧化物酶增殖體激活受體(PeroxisomeProliferators-Activated Receptor,PPAR)屬于類(lèi)固醇/甲狀腺/維甲酸受體超家族，共有三種亞型(PPARa ,PPARy ,PPAR δ )，在調(diào)控脂肪細(xì)胞分化和調(diào)控多種代謝(糖、脂肪、能量代謝等)中起重要作用。PPARa、PPARY主要在肝臟和脂肪組織中表達(dá)，而PPAR δ在多個(gè)組織中均有表達(dá)。與PPARa、PPARy相比，PPAR δ是三個(gè)亞型中研究最不透徹的基因(Ehrenborg 和 Krook,2009)。在人巨噬細(xì)胞中PPARS激動(dòng)劑可促進(jìn)膽固醇積累，同時(shí)在肥胖動(dòng)物模型提高血清高密度脂蛋白，降低三酰甘油水平(Vosper等,2001 ；Leibowitz等,2000 ；01iver等，2001)。對(duì)肥胖、有胰島素抵抗伴血脂紊亂的印度恒河猴的研究發(fā)現(xiàn)給予選擇性PPARS激動(dòng)劑GW501516以后，高密度脂蛋白增加，三酰甘油和胰島素水平降低。PPARS可降低體重、脂滴數(shù)量和大小、三酰甘油和脂肪酸，同時(shí)選擇性的激活脂肪酸氧化和能量解偶聯(lián)相關(guān)基因。有學(xué)者研究證實(shí)，豬PPAR δ基因是一個(gè)很重要的候選基因，它參與了軟骨的生長(zhǎng)發(fā)育和脂肪的代謝，未來(lái)對(duì)PPARS的研究空間還相當(dāng)大。PPARS基因在瘦肉型皮特蘭和相對(duì)脂肪型德國(guó)長(zhǎng)白豬差異表達(dá)，其中在瘦肉型皮特蘭品種中的表達(dá)量顯著高于相對(duì)脂肪型長(zhǎng)白豬(Ponsuksili等，2007);在MangalitsaX皮特蘭F2代和德國(guó)商業(yè)長(zhǎng)白豬群中PPAR δ單體型和背膘厚之間存在顯著關(guān)聯(lián)，在MangalitsaX皮特蘭F2代中單體型4具有增加背膘厚效應(yīng)，而在德國(guó)商業(yè)長(zhǎng)白豬群中單體型5具有降低背膘厚效應(yīng)。有趣的是，單體型4可增加PPAR δ在肝臟組織中的mRNA表達(dá)水平，而單體5降低PPAR δ的mRNA表達(dá)水平(Meidtner 等，2009 )。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克隆豬PPAR δ基因5’調(diào)控區(qū)DNA片段，尋找SNP位點(diǎn)，并建立相應(yīng)的SNP檢測(cè)方法，分析其與豬脂肪沉積性狀的關(guān)系，為豬脂肪沉積性狀的標(biāo)記輔助選擇提供有用的遺傳標(biāo)記。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):本發(fā)明獲得了大白豬和梅山豬PPAR δ基因5’調(diào)控區(qū)568bp的序列，其DNA序列如序列表SEQ IDN0:1(大白豬)和SEQ ID NO:2 (梅山豬)所述，通過(guò)2個(gè)豬種的上述序列進(jìn)行Cluster W比對(duì)提供了位于該擴(kuò)增片段內(nèi)部的I處核苷酸多態(tài)性(SNP)，其SNP位點(diǎn)如圖3所示。突變位點(diǎn)具體在以轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)記為O處起,上游655bp處，以下凡涉及到此突變位點(diǎn)都記為A655/G655。選擇中國(guó)地方豬種梅山豬和外來(lái)的歐洲大白豬為實(shí)驗(yàn)材料，從豬血液中提取基因組DNA，根據(jù)豬PPAR δ基因5’側(cè)翼調(diào)控序列設(shè)計(jì)如下引物:正向引物F: 5 ’ TCAAAGGCAAGGAGGTTA3 ’。反向引物R: 5 ’ CAGCACAGTTTCCTCCAG 3 ’。

利用該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化，克隆測(cè)序，序列比對(duì)分析。本發(fā)明獲得了一種篩選的與豬脂肪沉積性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，它的核苷酸序列如下所示:TCAAAGGCAAGGAGGTTAACATCTGAATGACAAAAGTAGTGTACATTCATTTCAAAAAGTAGAGAAGAAAAAAAAGAAGCAGGCATTCCTTTGCGGAGCGGTGGGTTAGGGATCCGGTGTTGTCACTGCAGCAGCCTGGGTCACTTGCTGTGGATTGGGTTCCATCCCTGGCCGGGTTGCATGCTGCAGGTGCAACCAAAAAAACCCTTCCCCAAAACCAAACCAAAACAAAAGACCATCGTTAAGAAGCAAGAATAGCGAGTCTCCCTTGTGGCTAAGTGGAAACGAACACGACTAGTATCCAGGAGGATGTGARTTTGATCCCGGCATCTCCGATTTGATCCACAGCCTGGGAACTTCGCATGCTGTACCTGCCACCCCACCCCGCCAAATCGAGGACATAATTTTCTACAACAGTATGGAGGATGTTCCCCATTTAGGCGAGCAAGCATATTAAATAAATAGGAAGACAGGTAAGAAGTCCAGAACCATACATTTCTAGTTGCAGAAGCCTCATGAGGGAGCGAAGCCCTTTTGTGAAAATTATAGGCAGCACAGTTTCCTCCAG上述序列中的R是A或G，導(dǎo)致EcoR 1-RFLP多態(tài)性；和TCAAAGGCAAGGAGGTTAACATCTGAATGACAAAAGTAGTGTACATTCATTTCAAAAAGTAGAGAAGAAAAAAAAGAAGCAGGCATTCCTTTGCGGAGCGGTGGGTTAGGGATCCGGTGTTGTCACTGCAGCAGCCTGGGTCACTTGCTGTGGATTGGGTTCCATCCCTGGCCGGGTTGCATGCTGCAGGTGCAACCAAAAAAACCCTTCCCCAAAACCAAACCAAAACAAAAGACCATCGTTAAGAAGCAAGAATAGCGAGTCTCCCTTGTGGCTAAGTGGAAACGAACACGACTAGTATCCAGGAGGATGTGARTTCGATCCCGGCATCTCCGATTTGATCCACAGCCTGGGAACTTCGCATGCTGTACCTGCCACCCCACCCCGCCAAATCGAGGACATAATTTTCTACAACAGTATGGAGGATGTTCCCCATTTAGGCGAGCAAGCATATTAAATAAATAGGAAGACAGGTAAGAAGTCCAGAACCATACATTTCTAGTTGCAGAAGCCTCATGAGGG AGCGAAGCCCTTTTGTGAAAATTATAGGCAGCACAGTTTCTCCAG上述序列中的R是A或G，導(dǎo)致EcoR 1-RFLP多態(tài)性。本發(fā)明提供了一種擴(kuò)增權(quán)利如要求I所述的遺傳標(biāo)記的引物對(duì)，其核苷酸序列如下所述:正向引物:5 ’ -TCAAAGGCAAGGAGGTTA-3 ’，
反向引物:5’ -CAGCACAGTTTCCTCCAG-3 ’。本發(fā)明提供了一種篩選豬脂肪沉積性狀的遺傳標(biāo)記的方法，按照以下步驟制備:從豬血液中提取基因組DNA，根據(jù)豬PPAR δ基因基因組序列設(shè)計(jì)引物，該引物的序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示，用該引物在豬基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增片段EcoR I酶切分型，得到導(dǎo)致EcoR 1-RFLP多態(tài)性的SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的序列，其中序列表SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示堿基的第316bp處有一個(gè)A/G堿基突變，利用該位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記進(jìn)行豬脂肪沉積性狀的關(guān)聯(lián)分析。本發(fā)明提供了檢測(cè)上述序列A655/G655變異的EcoR 1-RFLP基因型分型方法。本發(fā)明進(jìn)一步提 供了利用EcoR 1-RFLP方法確定不同基因型個(gè)體與豬產(chǎn)肉性狀之間的相關(guān)關(guān)系的關(guān)聯(lián)分析的應(yīng)用。更詳細(xì)的技術(shù)方案見(jiàn)《具體實(shí)施方式
》所述。


序列表SEQ ID NO:1是外來(lái)品種大白豬的PPAR δ核苷酸序列；R表示括號(hào)里的A/G突變位點(diǎn)。序列表SEQ ID NO:2是中國(guó)地方豬種梅山豬的PPAR δ核苷酸序列；R表示括號(hào)里的A/G突變位點(diǎn)。圖1:是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。圖2:是是外來(lái)品種大白豬的PPAR δ核苷酸序列和中國(guó)地方豬種梅山豬的PPAR δ核苷酸序列；上述序列中的326bp處的R是A或G(A/G突變位點(diǎn))，該突變導(dǎo)致EcoR 1-RFLP多態(tài)性。圖3 ^PPARS基因5’調(diào)控區(qū)EcoR 1-RFLP檢測(cè)結(jié)果。瓊脂糖濃度為2%。圖中泳道:M為DL2000Maker ;用AA表示的泳道為AA型，314bp和254bp ;用GG表示的泳道為GG基因型，568bp ;用AG表示的泳道為AG基因型，568bp，314bp，254bp。圖4:是大白豬和梅山豬核苷酸序列比對(duì)結(jié)果和SNP位點(diǎn)(突變位點(diǎn)為斜體帶下劃線標(biāo)記)，LW為大白豬，MS為梅山豬，NCBI為網(wǎng)上公布原序列，序列ID號(hào)為:397297。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1豬PPAR δ 5’側(cè)翼啟動(dòng)子區(qū)特異DNA片段的獲得及SNP檢測(cè)方法的建立試驗(yàn)選擇外國(guó)血緣豬品種“大白豬”和中國(guó)地方血緣豬品種“梅山豬”(來(lái)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)精品豬場(chǎng))兩種類(lèi)型豬品種為材料，根據(jù)豬PPARS基因基因組序列(GeneBank登錄號(hào)DQ437886)設(shè)計(jì)如下引物，引物序列如下:正向引物:5’ AGGAGACAGCGAGTAGCG 3 ’，反向引物:5’ CCCTGATGCCTGTGCTTA 3，。用上述引物在“大白豬”和“梅山豬”基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表I。表I PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種篩選的與豬脂肪沉積性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，其特征在于它的核苷酸序列如下所示TCAAAGGCAAGGAGGTTAACATCTGAATGACAAAAGTAGTGTACATTCATTTCAAAAAGTAGAGAAGAAAAAAAAGAAGCAGGCATTCCTTTGCGGAGCGGTGGGTTAGGGATCCGGTGTTGTCACTGCAGCAGCCTGGGTCACTTGCTGTGGATTGGGTTCCATCCCTGGCCGGGTTGCATGCTGCAGGTGCAACCAAAAAAACCCTTCCCCAAAACCAAACCAAAACAAAAGACCATCGTTAAGAAGCAAGAATAGCGAGTCTCCCTTGTGGCTAAGTGGAAACGAACACGACTAGTATCCAGGAGGATGTGARTTTGATCCCGGCATCTCCGATTTGATCCACAGCCTGGGAACTTCGCATGCTGTACCTGCCACCCCACCCCGCCAAATCGAGGACATAATTTTCTACAACAGTATGGAGGATGTTCCCCATTTAGGCGAGCAAGCATATTAAATAAATAGGAAGACAGGTAAGAAGTCCAGAACCATACATTTCTAGTTGCAGAAGCCTCATGAGGGAGCGAAGCCCTTTTGTGAAAATTATAGGCAGCACAGTTTCCTCCAG 上述序列中的R是A或G，導(dǎo)致EcoR I-RFLP多態(tài)性；和TCAAAGGCAAGGAGGTTAACATCTGAATGACAAAAGTAGTGTACATTCATTTCAAAAAGTAGAGAAGAAAAAAAAGAAGCAGGCATTCCTTTGCGGAGCGGTGGGTTAGGGATCCGGTGTTGTCACTGCAGCAGCCTGGGTCACTTGCTGTGGATTGGGTTCCATCCCTGGCCGGGTTGCATGCTGCAGGTGCAACCAAAAAAACCCTTCCCCAAAACCAAACCAAAACAAAAGACCATCGTTAAGAAGCAAGAATAGCGAGTCTCCCTTGTGGCTAAGTGGAAACGAACACGACTAGTATCCAGGAGGATGTGARTTCGATCCCGGCATCTCCGATTTGATCCACAGCCTGGGAACTTCGCATGCTGTACCTGCCACCCCACCCCGCCAAATCGAGGACATAATTTTCTACAACAGTATGGAGGATGTTCCCCATTTAGGCGAGCAAGCATATTAAATAAATAGGAAGACAGGTAAGAAGTCCAGAACCATACATTTCTAGTTGCAGAAGCCTCATGAGGGAGCGAAGCCCTTTTGTGAAAATTATAGGCAGCACAGTTTCTCCAG 上述序列中的R是A或G，導(dǎo)致EcoR I-RFLP多態(tài)性。
2.擴(kuò)增權(quán)利如要求I所述的遺傳標(biāo)記的引物對(duì)，其核苷酸序列如下所述正向引物5 ’ -TCAAAGGCAAGGAGGTTA-3 ’，反向引物5 ’ -CAGCACAGTTTCCTCCAG-3，。
3.一種篩選豬脂肪沉積性狀的遺傳標(biāo)記的方法，其特征在于，按照以下步驟 從豬血液中提取基因組DNA，根據(jù)豬PPARS基因基因組序列設(shè)計(jì)引物，該引物的序列如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示，用該引物在豬基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增片段EcoR I酶切分型，得到導(dǎo)致EcoR I-RFLP多態(tài)性的SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示的序列，其中序列表SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示堿基的第316bp處有一個(gè)A/G堿基突變，利用該位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記進(jìn)行豬脂肪沉積性狀的關(guān)聯(lián)分析。
4.權(quán)利要求I所述的遺傳標(biāo)記在豬脂肪沉積性狀選擇中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2所述的引物對(duì)在豬脂肪沉積性狀選擇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于豬分子標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與豬脂肪沉積性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記、制備方法及應(yīng)用。從豬PPARδ基因5’調(diào)控區(qū)片段克隆得到豬脂肪性狀關(guān)的標(biāo)記，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，在所述序列第316堿基處有一個(gè)A/G堿基突變，導(dǎo)致EcoR I-RFLP多態(tài)性。主要步驟從豬血液中提取基因組DNA，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物克隆、測(cè)序，序列比較分析，SNP檢測(cè)，標(biāo)記與脂肪沉積性狀間相關(guān)性分析，突變影響轉(zhuǎn)錄活性變化的試驗(yàn)驗(yàn)證等。還公開(kāi)了豬PPARδ基因5’調(diào)控區(qū)的SNP分型檢測(cè)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)該A/G突變位點(diǎn)與背膘厚等脂肪沉積性狀呈顯著相關(guān)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103255135SQ201210039360
公開(kāi)日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2012年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月21日
發(fā)明者左波, 林斌, 徐在言, 熊遠(yuǎn)著 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)