專利名稱：利用固定化運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產(chǎn)高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方法
利用固定化運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產(chǎn)高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基化學(xué)品的生物制造和生物煉制領(lǐng)域，具體地說，是以菊粉和木薯淀粉為原料，利用重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌催化等摩爾濃度菊粉果糖和木薯淀粉葡萄糖生產(chǎn)高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方法。
背景技術(shù)：
山梨醇是一種用途廣泛的化工原料，主要用于甜味劑、潤(rùn)濕劑、調(diào)質(zhì)劑、軟化劑等的生產(chǎn)和制備。目前山梨醇的工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)是采用50%的D-葡萄糖漿催化加氫工藝，但是這種化學(xué)法生產(chǎn)山梨醇是一個(gè)高耗能、回收成本高昂并產(chǎn)生環(huán)境污染的工藝。而生物法生產(chǎn)山梨醇主要是利用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌周質(zhì)空間內(nèi)的葡萄糖果糖氧化還原酶轉(zhuǎn)化果糖和葡萄糖生成，反應(yīng)過程簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，無需高壓設(shè)備，節(jié)約能源，并且對(duì)環(huán)境友好。但是果糖和葡萄糖這兩種基質(zhì)相對(duì)于產(chǎn)物的價(jià)格偏高，因此使用一些廉價(jià)的替代原料可以大大降低生物法生產(chǎn)山梨醇的成本。菊粉是由一類天然果聚糖的混合物，是由果糖單元通過β _2，1-糖苷鍵連接而成并以葡萄糖單元終止的碳水化合物，主要存在于菊芋、菊苣等植物的塊莖中。目前，菊粉的水解主要是利用菊粉酶，切斷菊粉的β _2，1-糖苷鍵，水解為果糖和葡萄糖。菊粉可以用來生產(chǎn)果糖、乙醇、單細(xì)胞蛋白、單細(xì)胞油脂、檸檬酸、聚果糖以及其他生物化學(xué)產(chǎn)品。而目前木薯淀粉也被廣泛用于生產(chǎn)干乳酸、檸檬酸等產(chǎn)品。利用菊粉、菊芋或者木薯淀粉這些可再生的、廉價(jià)的、豐富的生 物質(zhì)原料來生產(chǎn)生物化學(xué)品具有良好的優(yōu)勢(shì)。近年來，利用菊芋或菊粉來生產(chǎn)山梨醇的研究有一些報(bào)道。Dong-man等人將菊粉酶和滲透處理的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌共固定后催化菊芋和葡萄糖來生產(chǎn)山梨醇。另外鮑杰等人指出利用菊芋的酸水解液加入適量的葡萄糖后，用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌催化菊芋水解液可得到山梨醇和葡萄糖酸(專利號(hào)200910199317)。但是，這些研究中首先將細(xì)胞經(jīng)過甲苯、十六烷基三甲基溴化銨或金屬離子處理后進(jìn)行催化試驗(yàn)，認(rèn)為新鮮不經(jīng)過處理的細(xì)胞，在直接催化生產(chǎn)山梨醇和葡萄糖酸是會(huì)有大量副產(chǎn)物乙醇產(chǎn)生，且無法進(jìn)行反復(fù)循環(huán)利用會(huì)影響整個(gè)過程的生產(chǎn)效率和生產(chǎn)成本。同時(shí)，這些研究獲得山梨醇和葡萄糖酸的濃度較低，增加了后續(xù)產(chǎn)物分離的成本。我們嘗試將新鮮細(xì)胞經(jīng)過固定化來催化高濃度的葡萄糖酸和山梨醇,原料成本低,簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝；減少了后續(xù)產(chǎn)品分離的成本。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于利用商業(yè)糖化酶同時(shí)水解木薯淀粉和菊粉，在高的菊粉和木薯淀粉底物含量下獲得含有等摩爾濃度的果糖和葡萄糖的混合水解液，然后采用固定化的新鮮運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌催化生產(chǎn)高濃度的葡萄糖酸和山梨醇的方法。本發(fā)明的構(gòu)思:從菊粉和木薯淀粉生產(chǎn)高濃度葡萄糖酸和山梨醇的方法，具體地說是首先將木薯淀粉液化，然后降溫并調(diào)整pH。利用商業(yè)糖化酶水解菊粉一定時(shí)間后，將液化后的淀粉加入菊粉水解液進(jìn)行共糖化，以獲得含有等摩爾濃度的果糖和葡萄糖的混合水解液。將表達(dá)有葡萄糖果糖氧化還原酶的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌進(jìn)行細(xì)胞固定化，然后循環(huán)利用固定化的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌催化等摩爾濃度的果糖和葡萄糖的混合液生產(chǎn)山梨醇和葡萄糖酸。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:一種利用固定化運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌同時(shí)催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產(chǎn)高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方法，其具體步驟為，(I)高濃度等摩爾的菊粉果糖和木薯葡萄糖混合水解液的酶法制備；首先，將質(zhì)量濃度為50%的菊粉在60°C、pH 4.0、糖化酶酶量lU/g菊粉的條件下酶解48小時(shí)，然后加入已在90°C液化I小時(shí)的木薯淀粉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50% )，在60°C、pH
4.0的條件下繼續(xù)水解12小時(shí)，獲得等摩爾濃度的果糖和葡萄糖的混合水解液。其中菊粉和木薯淀粉的質(zhì)量比根據(jù)菊粉中果聚糖的含量和木薯淀粉中淀粉的含量而定，原則是在充分水解后得到等摩爾濃度的果糖和葡萄糖；所述的高濃度等摩爾的菊粉果糖和木薯葡萄糖混合水解液的酶法制備中，用于酶解菊粉的糖化酶是混合型商業(yè)糖化酶，該酶液中含有糖化酶和菊粉酶等多種酶蛋白，但是本發(fā)明中的酶液不限于商業(yè)糖化酶，還包括糖化酶和菊粉酶混合液等；(2)重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的細(xì)胞固定化；將表達(dá)有葡萄糖果糖氧化還原酶的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌在不通氣、30°C、pH6.0、150rpm、接種量10% (v/v)條件下培養(yǎng)18小時(shí)后，離心獲得濕細(xì)胞并用超純水懸浮至150g/L。然后將12.5% (w/v)的PVA溶液和0.125% (w/v)的海藻酸鈉溶液加熱溶解，冷卻至室溫后與細(xì)胞懸浮液混合(PVA溶液和細(xì)胞溶液體積比4: I)，將混合溶液在磁力攪拌作用下充分混勻I小時(shí)。然后，將混合溶液通過蠕動(dòng)泵滴加到飽和硼酸溶液中(含有0.3mol/L氯化鈣)，并攪拌3小時(shí)。使固定化的細(xì)胞顆粒平均直徑為4毫米，并用大量去離子水清洗以除去顆粒表面的硼酸溶液，即得到固定化的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌細(xì)胞；所述的重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌為表達(dá)有葡萄糖果糖氧化還原酶的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，其葡萄糖果糖氧化還原酶酶活比野生菌中的高出2倍；(3)利用固定化運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌同時(shí)催化果糖和葡萄糖獲得含有高濃度山梨醇和葡萄糖酸的混合液；在反應(yīng)器中加入制備好的混合水解液和固定化的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌細(xì)胞，在pH
6.4、溫度39°C、150rpm的條件下進(jìn)行催化，得到含有高濃度山梨醇和葡萄糖酸的混合液。每次催化結(jié)束后，進(jìn)行固液分離，液體進(jìn)行下一步的山梨醇和葡萄糖酸的分離和純化，固體細(xì)胞顆粒則多次循環(huán)用于催化反應(yīng)。所述的用于固定運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的溶液為12.5% (w/v)的PVA和0.125% (w/v)的海藻酸鈉的混合溶液。單獨(dú)利用海藻酸鈉固定新鮮的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，顆粒易發(fā)生膨脹溶解造成催化過程無法進(jìn)行；而？￥々與硼酸反應(yīng)速度慢，添加少量海藻酸鈉則有助于PVA顆粒的成型，其中PVA和海藻酸鈉較為合適的質(zhì)量比為10: I。所述的初始果糖和葡萄糖的總糖濃度500g/L，即果糖和葡萄糖濃度各為250g/L，在此高糖濃度下可以抑制乙醇的產(chǎn)生；細(xì)胞濃度則選擇10g/L，在此濃度下，催化可以順利進(jìn)行，從而降低了細(xì)胞催化 劑的使用量。
所述的每一次轉(zhuǎn)化結(jié)束后，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行固液分離，液體進(jìn)行山梨醇和葡萄糖酸的產(chǎn)品分離，固定化的細(xì)胞顆粒則留在反應(yīng)器中，重新加入新鮮的水解液，進(jìn)行下一次催化過程，整個(gè)過程固定化細(xì)胞可以進(jìn)行1-4次循環(huán)催化反應(yīng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極效果是:(I)本發(fā)明以菊粉和木薯淀粉為原料生產(chǎn)山梨醇和葡萄糖酸，基質(zhì)成本低廉，來源廣泛豐富，充分利用了可再生資源，能夠滿足葡萄糖酸和山梨醇不斷擴(kuò)大的市場(chǎng)需求；(2)本發(fā)明用于水解菊粉和木薯淀粉的糖化酶，是一個(gè)商業(yè)化的價(jià)格低廉的糖化酶，能夠滿足大規(guī)?；a(chǎn)的需要；(3)本發(fā)明將菊粉和木薯淀粉的水解結(jié)合，實(shí)現(xiàn)同時(shí)糖化過程，減少反應(yīng)器使用，節(jié)省生產(chǎn)成本；(4)本發(fā)明將新鮮細(xì)胞經(jīng)過固定化來催化高濃度的山梨醇和葡萄糖酸，不儀減少細(xì)胞處理程序，減少了催化劑的用量，而且避免細(xì)胞催化劑的連續(xù)生產(chǎn)；(5)本發(fā)明得到含有高濃度的山梨醇和葡萄糖酸的混合液，減少了后續(xù)產(chǎn)品分離的成本。

圖1實(shí)施例1固定化細(xì)胞催化過程曲線圖。
具體實(shí)施方式以下提供本發(fā)明一種利用固定化運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌同時(shí)催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產(chǎn)高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方 法的具體實(shí)施方式
。實(shí)施例1請(qǐng)參見附圖1，將表達(dá)有葡萄糖果糖氧化還原酶的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌在不通氣、30°C、pH 6.0、150rpm、接種量10% (v/v)條件下培養(yǎng)18小時(shí)后，離心獲得濕細(xì)胞并用超純水懸浮至150g/L。然后將12.5% (w/v)的PVA溶液和0.125% (w/v)的海藻酸鈉溶液加熱溶解，冷卻至室溫后與細(xì)胞懸浮液混合(PVA溶液和細(xì)胞溶液體積比4: I)，將混合溶液在磁力攪拌作用下充分混勻I小時(shí)。然后，將混合溶液通過蠕動(dòng)泵滴加到飽和硼酸溶液中(含有0.3mol/L氯化鈣)，并攪拌3小時(shí)。使固定化的細(xì)胞顆粒平均直徑為4毫米，并用大量去離子水清洗以除去顆粒表面的硼酸溶液，即得到固定化的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌細(xì)胞。在500毫升體積的反應(yīng)器中加入300毫升水解液和固定化的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌顆粒，在pH
6.4(14mol/L氫氧化鈉控制pH)、39°C、150rpm進(jìn)行催化反應(yīng)。整個(gè)過程中，山梨醇的濃度為180g/L，山梨醇的轉(zhuǎn)化率為97.33%，山梨醇的產(chǎn)率為每克細(xì)胞每小時(shí)0.492g。本發(fā)明所涉及的原料不限于菊粉和木薯淀粉，還可以為木薯、玉米淀粉類的原料，菊芋、菊苣等聚果糖原料。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種利用固定化運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌同時(shí)催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產(chǎn)高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方法，其特征在于，具體步驟為 (1)高濃度等摩爾的菊粉果糖和木薯葡萄糖混合水解液的酶法制備； 首先，將質(zhì)量濃度為50%的菊粉在60°C、pH4. O、糖化酶酶量lU/g菊粉的條件下酶解48小時(shí)，然后加入已在90°C液化I小時(shí)的木薯淀粉，在60°C、pH4. O的條件下繼續(xù)水解12小時(shí)，獲得等摩爾濃度的果糖和葡萄糖的混合水解液； (2)重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的細(xì)胞固定化； 將表達(dá)有葡萄糖果糖氧化還原酶的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌在不通氣、30°C、pH6. 0、150rpm、接種量10% (v/v)的條件下培養(yǎng)18小時(shí)后，離心獲得濕細(xì)胞并用超純水懸浮至150g/L。然后將12. 5% (w/v)的聚乙烯醇溶液和O. 125% (w/v)的海藻酸鈉溶液加熱溶解，冷卻至室溫后與細(xì)胞懸浮液混合，其中PVA溶液和細(xì)胞溶液體積比4 I，將混合溶液在磁力攪拌作用下充分混勻I小時(shí)；然后，將混合溶液通過蠕動(dòng)泵滴加到飽和硼酸溶液中，并攪拌3小時(shí)；使固定化的細(xì)胞顆粒平均直徑為4毫米，并用去離子水清洗以除去顆粒表面的硼酸溶液，即得到固定化的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌細(xì)胞； (3)利用固定化運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌同時(shí)催化果糖和葡萄糖獲得含有高濃度山梨醇和葡萄糖酸的混合液； 在反應(yīng)器中加入制備好的混合水解液和固定化的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌細(xì)胞，在pH 6. 4、溫度39°C、150rpm的條件下進(jìn)行催化，得到含有高濃度山梨醇和葡萄糖酸的混合液；每次催化結(jié)束后，進(jìn)行固液分離，液體進(jìn)行下一步的山梨醇和葡萄糖酸的分離和純化，固體細(xì)胞顆粒則多次循環(huán)用于催化反應(yīng)。
2.如權(quán)利要求I所述的一種利用固定化運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌同時(shí)催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產(chǎn)高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方法，其特征在于，在所述的步驟(I)中，用于酶解菊粉的糖化酶是混合型商業(yè)糖化酶，該酶液中含有糖化酶和菊粉酶和多種酶蛋白，但所述的酶液不限于商業(yè)糖化酶，還包括糖化酶和菊粉酶混合液。
3.如權(quán)利要求I所述的一種利用固定化運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌同時(shí)催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產(chǎn)高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方法，其特征在于，在所述的步驟(2)中，所述的重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌為表達(dá)有葡萄糖果糖氧化還原酶的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，其葡萄糖果糖氧化還原酶酶活比野生菌中的高出2倍。
4.如權(quán)利要求I所述的一種利用固定化運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌同時(shí)催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產(chǎn)高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方法，其特征在于，在所述的步驟(2)中，用于固定運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的溶液為12. 5% (w/v)的PVA和O. 125% (w/v)的海藻酸鈉的混合溶液；PVA和海藻酸鈉較為合適的質(zhì)量比為10 1。
5.如權(quán)利要求I所述的一種利用固定化運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌同時(shí)催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產(chǎn)高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方法，其特征在于，在所述的步驟(3)中，初始果糖和葡萄糖的總糖濃度500g/L，即果糖和葡萄糖濃度各為250g/L，在此高糖濃度下可以抑制乙醇的產(chǎn)生。細(xì)胞濃度則選擇10g/L。
6.如權(quán)利要求I所述的一種利用固定化運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌同時(shí)催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產(chǎn)高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方法，其特征在于，在所述的步驟(3)中，每一次轉(zhuǎn)化結(jié)束后，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行固液分離，液體進(jìn)行山梨醇和葡萄糖酸的產(chǎn)品分離，固定化的細(xì)胞顆粒則留在反應(yīng)器中，重新加入新鮮的水解液，進(jìn)行下一次催化過程，整個(gè)過程固定化細(xì)胞可以 進(jìn)行1-4次循環(huán)催化反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用固定化重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌同時(shí)催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產(chǎn)山梨醇和葡萄糖酸的方法，具體步驟為(1)高濃度等摩爾的菊粉果糖和木薯葡萄糖混合水解液的酶法制備；(2)重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的細(xì)胞固定化；(3)利用固定化重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌同時(shí)催化果糖和葡萄糖獲得含有高濃度山梨醇和葡萄糖酸的混合產(chǎn)品。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)利用一種糖化酶同步水解菊粉和木薯淀粉生成等摩爾的果糖和葡萄糖，原料成本低且減少了酶用量，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝；循環(huán)利用固定化細(xì)胞催化果糖和葡萄糖生產(chǎn)山梨醇和葡萄糖酸，減少了催化劑的用量，避免細(xì)胞催化劑的連續(xù)生產(chǎn)；得到含有高濃度的山梨醇和葡萄糖酸的混合液，減少了后續(xù)產(chǎn)品分離的成本。
文檔編號(hào)C12R1/01GK103255181SQ20121003970
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2012年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月21日 公開號(hào)201210039707.發(fā)明者鮑杰, 安克紅, 胡鳳仙 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)