專利名稱：構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離篩選方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是構(gòu)樹內(nèi)生真菌在植物修復(fù)和制備抗菌抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物內(nèi)生真菌(fungal endophyte)是指生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各組織和器官內(nèi)的真菌。它們與宿主植物通過互作形成了緊密的共生關(guān)系。內(nèi)生真菌可以促進植物的生長，提高植物應(yīng)對生物或非生物脅迫的適應(yīng)能力。例如，從重金屬脅迫環(huán)境下植物體中分離得到的內(nèi)生真菌Mucor sp. CBRF59對Cd和1 有很強的抗性與富集能力，具有促進植物生長和重金屬富集的雙重特性(Chen L., Luo S., Xiao X.，Guo H. , Chen J. , Wan Y. , Li B. , Xu Τ. , Xi Q. , Rao C. , Liu C. , Zeng G. Application of plant growth-promoting endophytes (PGPE) isolated from Solanum nigrum L. for phytoextraction of Cd-polluted soils. Applied Soil Ecology, 2010,46 (3), 383-389 ；Deng Ζ. , Cao L. , Huang H. , Jiang X. , Wang W. , Shi Y. , Zhang R. (2011). Characterization of Cd- and Pb-resistant fungal endophyte Mucor sp. CBRF59 isolated from rapes (Brassica chinensis) in a metal-contaminated soil. Journal of Hazardous Materials, 2011，185 0-3) : 717-724.)。有些植物內(nèi)生真菌還被證實具有藥用價值，如1993年Mierle首次從短葉紅豆杉(Taxus breviflia)中分離得到一株能合成抗癌物質(zhì)紫杉醇的內(nèi)生真菌(Taxomyces andreanae)，中國專利文獻CN 200810041214. 8，公告日2010年9月四日，公開了一種抑制肝癌細胞生長的發(fā)酵液的制備方法，則發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生真菌長枝木霉(Trichoderima longibrachiatum)發(fā)酵產(chǎn)物可抑制肝癌細胞生長。
構(gòu)樹(Broussonetia papyrifera (L. ) Vent.)為?？茦?gòu)屬植物，是一種內(nèi)生真菌宿主植物，呈現(xiàn)豐富的內(nèi)生真菌多樣性，構(gòu)樹與其內(nèi)生真菌存在協(xié)同進化或互作關(guān)系。構(gòu)樹具有重金屬富集特性，如黃長干等(2004)調(diào)查發(fā)現(xiàn)江西德興銅礦污染區(qū)域的構(gòu)樹具有良好的植物修復(fù)潛力，其生物量在140余種植物中位列第一；賴發(fā)英等(2007)調(diào)查結(jié)果表明構(gòu)樹對污染農(nóng)田的Cu、Zn具有富集能力；童方平等(2010)對銻礦區(qū)構(gòu)樹富集重金屬的特性研究發(fā)現(xiàn)，重金屬Sb、ai、Pb、As主要富集在構(gòu)樹的枝葉部位(占85%以上)。以往的研究認為，內(nèi)生真菌與宿主植物富集重金屬的能力有密切的關(guān)系，包括內(nèi)生真菌在內(nèi)的微生物在重金屬污染環(huán)境中逐漸形成了一些對重金屬抗性的種群，它們通過生物吸附、胞外沉淀、生物轉(zhuǎn)化、生物累積和外排作用對重金屬毒性產(chǎn)生抗性，并可分泌多聚糖、糖蛋白、脂多糖、可溶性氨基酸等胞外聚合物質(zhì)，選擇性地從環(huán)境中結(jié)合金屬，可用于污染環(huán)境的生物修復(fù)。如通過生物吸附或積累作用去除廢水中的重金屬，與內(nèi)生真菌-植物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染土壤。由于內(nèi)生真菌呈絲狀生長，接觸污染面積大，且生長快，生物量大，分離培養(yǎng)簡單，多數(shù)內(nèi)生菌寄主范圍廣，協(xié)同利用微生物和宿主植物對重金屬污染土壤進行修復(fù)，可以改善植物修復(fù)效果，具有廣闊前景。但是對于某一宿主植物，究竟何種內(nèi)生真菌或哪幾類內(nèi)生真菌起到重金屬富集作用，是需要進行大量的研究加以證實的，這類內(nèi)生真菌的篩選出來以后， 可制備成菌根菌劑，從而應(yīng)用于生物修復(fù)。
目前關(guān)于構(gòu)樹內(nèi)生真菌尚未見有分離鑒定的報道，也未見有重金屬抗性及生物活性方面的報道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種耐重金屬Si的構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離篩選方法。
本發(fā)明的再一的目的是，提供構(gòu)樹內(nèi)生真菌在修復(fù)重金屬污染土壤中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一的目的是，提供一種具有抗人肝癌細胞活性的構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離篩選方法。
本發(fā)明的第四個目的是，提供一種具有抗人肝癌細胞活性的發(fā)酵液的制備方法。
本發(fā)明的第五個目的是，提供一種構(gòu)樹內(nèi)生真菌在制備抗人肝癌細胞活性藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第六個目的是，提供一種具有抗炎活性的構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離篩選方法。
本發(fā)明的第七個目的是，提供一種具有抗炎活性的發(fā)酵液的制備方法。
本發(fā)明的第八個目的是，提供一種構(gòu)樹內(nèi)生真菌在制備抗炎活性藥物中的應(yīng)用。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種耐重金屬ai的構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離篩選方法，它包括以下步驟(a)材料預(yù)處理采集新鮮構(gòu)樹的根、莖段和成熟葉，用雙蒸水沖洗干凈后，無菌水略洗；(b)材料消毒將步驟(a)的構(gòu)樹成熟葉用75%EtOH漂洗lmin，無菌水沖洗，2. 5% NaClO漂洗3min，無菌水沖洗，75% EtOH漂洗0. 5min,無菌水沖洗；步驟(a)的構(gòu)樹根和莖段用75% EtOH漂洗lmin，無菌水沖洗，5% NaClO漂洗3min，無菌水沖洗，75% EtOH漂洗 0. 5min，無菌水沖洗；(c)構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離將步驟(b)的成熟葉用無菌濾紙吸干水分后切成組織塊， 根、莖段剝?nèi)ジひ嗲谐山M織塊，接入PDA培養(yǎng)基；(d)構(gòu)樹內(nèi)生真菌的純化將分離繁殖出的不同種類的構(gòu)樹內(nèi)生真菌接入PDA平板純化；(e)含重金屬Si的培養(yǎng)基的配制PDA培養(yǎng)基高溫滅菌后，加入150-250mmol/L無菌的SiSO4 · 7H20輕輕振搖使其溶解均勻；(f)耐受重金屬Si構(gòu)樹內(nèi)生真菌的篩選將步驟(d)所分構(gòu)樹內(nèi)生真菌接種在步驟(e) 的培養(yǎng)基上，26°C培養(yǎng)一周，挑出長出的菌落，即為重金屬Si耐受菌株。
所述的PDA培養(yǎng)基各組分及質(zhì)量百分比為土豆20%，葡萄糖2%，瓊脂1. 5%，余量 *Η20，ρΗ 自然。
為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是構(gòu)樹內(nèi)生真菌在修復(fù)重金屬污染土壤中的應(yīng)用，所述的構(gòu)樹內(nèi)生真菌是按照上述耐重金屬ai的構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離篩選方法分離篩選得到的。
為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種具有抗人肝癌細胞活性的構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離篩選方法，它包括以下步驟(a)材料預(yù)處理采集新鮮構(gòu)樹的根、莖段和成熟葉，用雙蒸水沖洗干凈后，無菌水略洗；(b)材料消毒將步驟(a)的構(gòu)樹成熟葉用75%KOH漂洗lmin，無菌水沖洗，2. 5% NaClO漂洗3min，無菌水沖洗，75% EtOH漂洗0. 5min,無菌水沖洗；步驟(a)的構(gòu)樹根和莖段用75% KOH漂洗lmin，無菌水沖洗，5% NaCHO漂洗;3min，無菌水沖洗，75% KOH漂洗 0. 5min，無菌水沖洗；(c)構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離將步驟(b)的成熟葉用無菌濾紙吸干水分后切成組織塊， 根、莖段剝?nèi)ジひ嗲谐山M織塊，接入PDA培養(yǎng)基；(d)構(gòu)樹內(nèi)生真菌的純化將分離繁殖出的不同種類的構(gòu)樹內(nèi)生真菌接入PDA平板純化；(e)構(gòu)樹內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(d)所分構(gòu)樹內(nèi)生真菌接入PDB培養(yǎng)基，置25°C搖床，30-150 r/min，液體發(fā)酵培養(yǎng)8-20d ；(f)菌株發(fā)酵液的乙酸乙酯提取步驟(e)發(fā)酵液經(jīng)4500-5500r/min離心2. 5-3. 5 min，取發(fā)酵上清液，用等體積乙酸乙酯對發(fā)酵上清液進行萃取，充分振搖5min，后靜置 30min，萃取3次，0.05個大氣壓下減壓濃縮30 min，揮干乙酸乙酯；(g)樣品配制將步驟(f)中的IOmg菌株發(fā)酵液乙酸乙酯提取物用ImlDMSO溶解后， 加入9ml PBS(-)配成1000 μδ/πι1的溶液或均勻的混懸液，然后用含0. 1% DMSO的PBS (-) 稀釋100倍；(h)具備抗人肝癌細胞活性的菌株篩選:MTT法檢測步驟(g)的樣品液對人肝癌細胞體外增殖的抑制作用。
所述的PDA培養(yǎng)基各組分及質(zhì)量百分比為土豆20%，葡萄糖2%，瓊脂1. 5%，余量 *Η20，ρΗ 自然。
為實現(xiàn)上述第四個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種具有抗人肝癌細胞活性的發(fā)酵液的制備方法，它包括以下步驟(a)材料預(yù)處理采集新鮮構(gòu)樹的根、莖段和成熟葉，用雙蒸水沖洗干凈后，無菌水略洗；(b)材料消毒將步驟(a)的構(gòu)樹成熟葉用75%KOH漂洗lmin，無菌水沖洗，2. 5% NaClO漂洗3min，無菌水沖洗，75% EtOH漂洗0. 5min,無菌水沖洗；步驟(a)的構(gòu)樹根和莖段用75% KOH漂洗lmin，無菌水沖洗，5% NaCHO漂洗;3min，無菌水沖洗，75% KOH漂洗 0. 5min，無菌水沖洗；(c)構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離將步驟(b)的成熟葉用無菌濾紙吸干水分后切成組織塊， 根、莖段剝?nèi)ジひ嗲谐山M織塊，接入PDA培養(yǎng)基；(d)構(gòu)樹內(nèi)生真菌的純化將分離繁殖出的不同種類的構(gòu)樹內(nèi)生真菌接入PDA平板純化；(e)構(gòu)樹內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(d)所分株構(gòu)樹內(nèi)生真菌接入PDB培養(yǎng)基，置25°C 搖床，30-150 r/min，液體發(fā)酵培養(yǎng)8-20 d。
所述的PDA培養(yǎng)基各組分及質(zhì)量百分比為土豆20%，葡萄糖2%，瓊脂1. 5%，余量*Η20，ρΗ 自然。
為實現(xiàn)上述第五個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是構(gòu)樹內(nèi)生真菌在制備抗人肝癌細胞活性藥物中的應(yīng)用，所述的構(gòu)樹內(nèi)生真菌是按照上述具有抗人肝癌細胞活性的構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離篩選方法分離篩選得到的。
為實現(xiàn)上述第六個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種具有抗炎活性的構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離篩選方法，它包括以下步驟(a)材料預(yù)處理采集新鮮構(gòu)樹的根、莖段和成熟葉，用雙蒸水沖洗干凈后，無菌水略洗；(b)材料消毒將步驟(a)的構(gòu)樹成熟葉用75%KOH漂洗lmin，無菌水沖洗，2. 5% NaClO漂洗3min，無菌水沖洗，75% EtOH漂洗0. 5min,無菌水沖洗；步驟(a)的構(gòu)樹根和莖段用75% KOH漂洗lmin，無菌水沖洗，5% NaCHO漂洗;3min，無菌水沖洗，75% KOH漂洗 0. 5min，無菌水沖洗；(c)構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離將步驟(b)的成熟葉用無菌濾紙吸干水分后切成組織塊， 根、莖段剝?nèi)ジひ嗲谐山M織塊，接入PDA培養(yǎng)基；(d)構(gòu)樹內(nèi)生真菌的純化將分離繁殖出的不同種類的構(gòu)樹內(nèi)生真菌接入PDA平板純化；(e)構(gòu)樹內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(d)所分構(gòu)樹內(nèi)生真菌接入PDB培養(yǎng)基，置25°C搖床，30-150 r/min，液體發(fā)酵培養(yǎng)8-20 d ；(f)菌株發(fā)酵液的乙酸乙酯提取步驟(e)發(fā)酵液經(jīng)4500-5500r/min離心2. 5-3. 5 min，取發(fā)酵上清液，用等體積乙酸乙酯對發(fā)酵上清液進行萃取，充分振搖5min，后靜置 30min，萃取3次，在0. 05個大氣壓減壓濃縮30min，揮干乙酸乙酯；(g)樣品配制將步驟(f)中的IOmg菌株發(fā)酵液乙酸乙酯提取物用ImlDMSO溶解后， 加入9ml PBS(-)配成1000 μδ/πι1的溶液或均勻的混懸液，然后用含0. 1% DMSO的PBS (-) 稀釋100倍；(h)具備抗炎活性的菌株篩選檢測步驟(g)的樣品對RWA264. 7細胞中LPS誘導(dǎo)NO 含量的影響。
所述的PDA培養(yǎng)基各組分及質(zhì)量百分比為土豆20%，葡萄糖2%，瓊脂1. 5%，余量 *Η20，ρΗ 自然。
為實現(xiàn)上述第七個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是 一種具有抗炎活性的發(fā)酵液的制備方法，它包括以下步驟(a)材料預(yù)處理采集新鮮構(gòu)樹的根、莖段和成熟葉，用雙蒸水沖洗干凈后，無菌水略洗；(b)材料消毒將步驟(a)的構(gòu)樹成熟葉用75%KOH漂洗lmin，無菌水沖洗，2. 5% NaClO漂洗3min，無菌水沖洗，75% EtOH漂洗0. 5min,無菌水沖洗；步驟(a)的構(gòu)樹根和莖段用75% KOH漂洗lmin，無菌水沖洗，5% NaCHO漂洗;3min，無菌水沖洗，75% KOH漂洗 0. 5min，無菌水沖洗；(c)構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離將步驟(b)的成熟葉用無菌濾紙吸干水分后切成組織塊， 根、莖段剝?nèi)ジひ嗲谐山M織塊，接入PDA培養(yǎng)基；(d)構(gòu)樹內(nèi)生真菌的純化將分離繁殖出的不同種類的構(gòu)樹內(nèi)生真菌接入PDA平板純化；(e)構(gòu)樹內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(d)所分構(gòu)樹內(nèi)生真菌接入PDB培養(yǎng)基，置25°C搖床，30-150 r/min，液體發(fā)酵培養(yǎng)8-20 d ；(f)菌株發(fā)酵液的乙酸乙酯提取步驟(e)發(fā)酵液經(jīng)4500-5500r/min離心2. 5-3. 5 min，取發(fā)酵上清液，用等體積乙酸乙酯對發(fā)酵上清液進行萃取，充分振搖5min，后靜置 30min，萃取3次，在0. 05個大氣壓減壓濃縮30min，揮干乙酸乙酯。
所述的PDA培養(yǎng)基各組分及質(zhì)量百分比為土豆20%，葡萄糖2%，瓊脂1. 5%，余量 *Η20，ρΗ 自然。
為實現(xiàn)上述第八個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是構(gòu)樹內(nèi)生真菌在制備抗炎活性藥物中的應(yīng)用，所述的構(gòu)樹內(nèi)生真菌是按照上述具有抗炎活性的構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離篩選方法分離篩選得到的。
本發(fā)明優(yōu)點在于1、本發(fā)明根據(jù)“內(nèi)共生理論”從構(gòu)樹組織中成功篩選出耐重金屬ai的構(gòu)樹內(nèi)生真菌， 提供了有效的菌種分離篩選方法；2、本發(fā)明證實了所分耐重金屬構(gòu)樹真菌具有良好的ai富集作用，為重金屬污染土壤的生物修復(fù)提供了切實可行的方法；3、本發(fā)明根據(jù)“內(nèi)共生理論”從構(gòu)樹組織中成功篩選出具備抗人肝癌細胞活性、具備抗炎活性的構(gòu)樹內(nèi)生真菌，為實現(xiàn)由植物中提取抗癌、抗炎活性物質(zhì)到微生物發(fā)酵法生產(chǎn)抗癌、抗炎活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化提供了有效的菌種分離篩選方法；4、本發(fā)明提供了新的抗癌、抗炎發(fā)酵液的制備方法，該發(fā)酵液具有顯著的抑制人肝癌細胞增殖和抗炎作用，開辟了抗癌、抗炎藥物研發(fā)的新途徑。


附圖1是不同構(gòu)樹內(nèi)生真菌發(fā)酵物及不同濃度對RWA 264. 7細胞中LPS誘導(dǎo)NO 含量的影響。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式
作詳細說明。
實施例1一、構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離和純化 1.材料預(yù)處理構(gòu)樹，生長于遼寧省紅透山，樹齡8年，2005年6月份采集新鮮構(gòu)樹的直徑0. 5cm以下的根、直徑0. 5cm以下的莖段和成熟葉，用雙蒸水沖洗干凈后，用無菌水略洗，備用。
2.消毒構(gòu)樹成熟葉的消毒方法為75% EtOH漂洗lmin，無菌水沖洗4次，2. 5% NaClO漂洗 3min，無菌水沖洗4次，75% EtOH 0. 5min，無菌水沖洗4次；構(gòu)樹根和莖段的消毒方法為75% EtOH lmin，無菌水沖洗4次，5% NaClO 3min，無菌水沖洗4次，75% EtOH 0. 5min，無菌水沖洗4次。
3.分離將經(jīng)表面消毒的構(gòu)樹成熟葉用無菌濾紙吸干水分后切成0. 5cmX0. 5cm的組織塊，根、 莖段剝?nèi)ジひ嗲谐?. 5cmX0. 5cm的組織塊，接入PDA (土豆葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基進行內(nèi)生真菌的繁殖。所用PDA培養(yǎng)基的各組分及質(zhì)量百分比為土豆20 %，葡萄糖2 %，瓊脂 1.5 %，余量*Η20，ρΗ自然。培養(yǎng)溫度為^°C，培養(yǎng)方式為平板培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為72h。
4.純化將分離繁殖出的不同種類的構(gòu)樹內(nèi)生真菌，采用尖端菌絲挑取法，挑取形態(tài)不用的菌落，接入新的PDA平板進行純化2-3次。
經(jīng)過2-3次點接純化共得到95株構(gòu)樹形態(tài)型內(nèi)生真菌。
二、耐受重金屬Si的構(gòu)樹內(nèi)生真菌篩選 1.含重金屬Si的培養(yǎng)基的配制PDA培養(yǎng)基高溫滅菌后，根據(jù)其體積趁熱加入200mmol/L經(jīng)紫外照射2 h的SiSO4 · 7H20輕輕振搖使其溶解均勻。
2.耐受重金屬Si構(gòu)樹內(nèi)生真菌的篩選將所分構(gòu)樹內(nèi)生真菌接種在含Si的PDA培養(yǎng)基上，于^rc培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為一周，一周后能長出菌落的即為重金屬ai耐受菌株。
經(jīng)過以上方法從所分95株構(gòu)樹內(nèi)生真菌篩選出5株在Si濃度為200mmol/L時仍能生長的菌株，編號為 S-18、S-48、S-l-23、S-l-41、S-1-46。
3.耐受重金屬Si構(gòu)樹內(nèi)生真菌的ITS序列分析與分子鑒定對編號S-18、S-48、S-l-23、S-l-41、S-l-46五株菌進行ITS序列分析與分子鑒定。首先刮取PDA平板上的菌絲，采用常規(guī)的分子生物學(xué)方法提取基因組DNA。再采用購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的通用引物 ITS4 (5'-GGAAGTAAAAGTCGTAAGG-3‘)禾口ITS5 (5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3')進行 PCR 擴增，PCR 擴增體系為模板 DNA 0. 5Pg，引物各 20pM，dNTPs 各 20(^M，Taq DNA 聚合酶 2. 5μ1,Μδ2+ 1. 5mM，加雙蒸水至 ΙΟΟμΙ ； 反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min，95°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸45s，循環(huán)30次，72 °C 延伸lOmin。所得PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。以每個形態(tài)型菌株的ITS和5. 8S基因作為靶序列，在GenBank數(shù)據(jù)庫中用Blast程序來搜索同源序列。挑選與形態(tài)型序列最相近的參考序列，用于系統(tǒng)發(fā)育分析。5. 8S基因和ITS區(qū)序列通過Clustal XI. 81程序來進行序列間的匹配排序，為了實現(xiàn)匹配排序的最優(yōu)化，對一些堿基位置進行必要的調(diào)整。這些被匹配排序后的數(shù)據(jù)，用于鄰接法(Neighbor-joining，NJ)的系統(tǒng)發(fā)育分析。用Clustal X1.81作鄰接法分析，隨機挑取1個序列，重復(fù)比對1000次，保存其中遺傳距離最短的系統(tǒng)發(fā)育樹。
經(jīng)分子鑒定，耐受重金屬Si的5株構(gòu)樹內(nèi)生真菌S-18、S-48、S-l-23、S-1-41、 S-1-46 分別 為 Apiospora montagnei、Arthrinium phaeospermum、Peyronellaea australis> Aspergillus sp. >Stagonosporopsis cucurbitacearum。
通過上述實驗篩選獲得5株構(gòu)樹內(nèi)生真菌Apiospora montagnei、Arthrinium phaeospermum、PeyronelIaea australis>Aspergillus sp.、Stagonosporopsis cucurbitacearum，均可而 受 200mmol/L 白勺 Zn。
4、耐受重金屬Si構(gòu)樹內(nèi)生真菌的土壤修復(fù)試驗4. 1菌液制備±S ii M Zn 5 ^ I^j W ^ Λ Apiospora montagnei> Arthrinium phaeospermum、PeyronelIaea australis>Aspergillus sp.、Stagonosporopsis cucurbitacearum制備成侵染菌液，制備方法是接種少量菌至25ml的PDB培養(yǎng)基(配方同上述的PDA培養(yǎng)基，但不加瓊脂)，置25°C搖床，90 r/min,培養(yǎng)24h,取5ml菌液，13000 r/ min離心lOmin，去離子水清洗后再離心，收集菌體懸浮于0. 03 M的MgSO4溶液中，并稀釋至濃度為5 X IO9 Cfumr1。
4. 2植物幼苗和種子的處理構(gòu)樹種子浸泡于70%乙醇溶液lmin，再浸泡于1%次氯酸鈉溶液lOmin，濃硫酸處理 5min，無菌水漂洗5-10次，晾干，接種至無菌水浸潤的濾紙，黑暗培養(yǎng)15d，待種子萌發(fā)，轉(zhuǎn)接到MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方MS 4.748·!^，蔗糖為30 g·!/1，瓊脂為5. 25或4. 75 g·!/1，用ImoPL-1NaOH將pH值調(diào)至5. 8后，按每瓶40ml分裝于高10cm，直徑5cm的培養(yǎng)瓶內(nèi)，于121°C濕熱滅菌30min ；培養(yǎng)溫度為沈°C，光照強度為15001ux，光照周期為UMcT1， 無菌室培養(yǎng)長至莖長10-12cm，取出待浸菌。加拿大一枝黃花(Solidago decurrens)種子浸泡于70%乙醇溶液lmin，再浸泡于1%次氯酸鈉溶液lOmin，無菌水漂洗5_10次，晾干，待浸菌。
4. 3植物幼苗和種子的浸菌將步驟4. 2的構(gòu)樹幼苗根系和加拿大一枝黃花種子浸于步驟4. 1制備的菌液中4. 5h。
4. 4植物栽培將步驟4. 3浸菌后的構(gòu)樹幼苗和加拿大一枝黃花種子栽種或播種于Si污染的蛭石土盆栽，其中，土壤中重金屬濃度設(shè)兩個梯度，分別為1500 mg/kg ,2500 mg/kg，室內(nèi)培養(yǎng) 12周，培養(yǎng)條件為14h光照/天，PAR 300Mmol πΓ2 s—1，白天溫度^°C，夜晚^°C，隔天灌溉1/4濃度霍格溶液。以未浸菌的構(gòu)樹幼苗和加拿大一枝黃花種子作為對照。
4. 5植物富集重金屬Si能力的測定收獲植物地上部位，0. OlM的EDTA和去離子水清洗除去表面附著重金屬，105°C干燥至恒重，測干重；取250mg植物干組織用硝酸/高氯酸(體積比4:1)消解，采用原子吸收法測定單位質(zhì)量植物組織中重金屬Si含量；另取Ig新鮮植物地上組織，滅菌，涂PDA培養(yǎng)上分離篩選，鑒定是否為接種的內(nèi)生真菌。
經(jīng)測定，5株構(gòu)樹內(nèi)生真菌對構(gòu)樹和加拿大一枝黃花地上部分重金屬Si累積總量的提升率如表1所示表ι構(gòu)樹內(nèi)生真菌對構(gòu)樹和加拿大一枝黃花地上部分重金屬ai累積總量的提升率
權(quán)利要求
1. 一種耐重金屬ai的構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離篩選方法，其特征在于，它包括以下步驟(a)材料預(yù)處理采集新鮮構(gòu)樹的根、莖段和成熟葉，用雙蒸水沖洗干凈后，無菌水略洗；(b)材料消毒將步驟(a)的構(gòu)樹成熟葉用75%EtOH漂洗lmin，無菌水沖洗，2. 5% NaClO漂洗3min，無菌水沖洗，75% EtOH漂洗0. 5min,無菌水沖洗；步驟(a)的構(gòu)樹根和莖段用75% EtOH漂洗lmin，無菌水沖洗，5% NaClO漂洗3min，無菌水沖洗，75% EtOH漂洗 0. 5min，無菌水沖洗；(c)構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離將步驟(b)的成熟葉用無菌濾紙吸干水分后切成組織塊， 根、莖段剝?nèi)ジひ嗲谐山M織塊，接入PDA培養(yǎng)基；(d)構(gòu)樹內(nèi)生真菌的純化將分離繁殖出的不同種類的構(gòu)樹內(nèi)生真菌接入PDA平板純化；(e)含重金屬Si的培養(yǎng)基的配制PDA培養(yǎng)基高溫滅菌后，加入150-250mmol/L無菌的SiSO4 · 7H20輕輕振搖使其溶解均勻；(f)耐受重金屬Si構(gòu)樹內(nèi)生真菌的篩選將步驟(d)所分構(gòu)樹內(nèi)生真菌接種在步驟(e) 的培養(yǎng)基上，26°C培養(yǎng)一周，挑出長出的菌落，即為重金屬Si耐受菌株。
2.構(gòu)樹內(nèi)生真菌在修復(fù)重金屬污染土壤中的應(yīng)用，其特征在于，所述的構(gòu)樹內(nèi)生真菌是按照權(quán)利要求1的方法分離篩選得到的。
3.一種具有抗人肝癌細胞活性的構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離篩選方法，其特征在于，它包括以下步驟(a)材料預(yù)處理采集新鮮構(gòu)樹的根、莖段和成熟葉，用雙蒸水沖洗干凈后，無菌水略洗；(b)材料消毒將步驟(a)的構(gòu)樹成熟葉用75%KOH漂洗lmin，無菌水沖洗，2. 5% Natno漂洗3min，無菌水沖洗，75% KOH漂洗0. 5min，無菌水沖洗；步驟(a)的構(gòu)樹根和莖段用75% KOH漂洗lmin，無菌水沖洗，5% NaCHO漂洗;3min，無菌水沖洗，75% KOH漂洗 0. 5min，無菌水沖洗；(c)構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離將步驟(b)的成熟葉用無菌濾紙吸干水分后切成組織塊， 根、莖段剝?nèi)ジひ嗲谐山M織塊，接入PDA培養(yǎng)基；(d)構(gòu)樹內(nèi)生真菌的純化將分離繁殖出的不同種類的構(gòu)樹內(nèi)生真菌接入PDA平板純化；(e)構(gòu)樹內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(d)所分構(gòu)樹內(nèi)生真菌接入PDB培養(yǎng)基，置25°C搖床，30-150 r/min，液體發(fā)酵培養(yǎng)8-20d ；(f)菌株發(fā)酵液的乙酸乙酯提取步驟(e)發(fā)酵液經(jīng)4500-5500r/min離心2. 5-3. 5 min，取發(fā)酵上清液，用等體積乙酸乙酯對發(fā)酵上清液進行萃取，充分振搖5min，后靜置 30min，萃取3次，0.05個大氣壓下減壓濃縮30 min，揮干乙酸乙酯；(g)樣品配制將步驟(f)中的IOmg菌株發(fā)酵液乙酸乙酯提取物用ImlDMSO溶解后， 加入9ml PBS(-)配成1000 μδ/πι1的溶液或均勻的混懸液，然后用含0. 1% DMSO的PBS (-) 稀釋100倍；(h)具備抗人肝癌細胞活性的菌株篩選:MTT法檢測步驟(g)的樣品液對人肝癌細胞體外增殖的抑制作用。
4.一種具有抗人肝癌細胞活性的發(fā)酵液的制備方法，其特征在于，它包括以下步驟(a)材料預(yù)處理采集新鮮構(gòu)樹的根、莖段和成熟葉，用雙蒸水沖洗干凈后，無菌水略洗；(b)材料消毒將步驟(a)的構(gòu)樹成熟葉用75%KOH漂洗lmin，無菌水沖洗，2. 5% NaClO漂洗3min，無菌水沖洗，75% EtOH漂洗0. 5min,無菌水沖洗；步驟(a)的構(gòu)樹根和莖段用75% KOH漂洗lmin，無菌水沖洗，5% NaCHO漂洗;3min，無菌水沖洗，75% KOH漂洗 0. 5min，無菌水沖洗；(c)構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離將步驟(b)的成熟葉用無菌濾紙吸干水分后切成組織塊， 根、莖段剝?nèi)ジひ嗲谐山M織塊，接入PDA培養(yǎng)基；(d)構(gòu)樹內(nèi)生真菌的純化將分離繁殖出的不同種類的構(gòu)樹內(nèi)生真菌接入PDA平板純化；(e)構(gòu)樹內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(d)所分株構(gòu)樹內(nèi)生真菌接入PDB培養(yǎng)基，置25°C 搖床，30-150 r/min，液體發(fā)酵培養(yǎng)8-20 d。
5.構(gòu)樹內(nèi)生真菌在制備抗人肝癌細胞活性藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的構(gòu)樹內(nèi)生真菌是按照權(quán)利要求3的方法分離篩選得到的。
6.一種具有抗炎活性的構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離篩選方法，其特征在于，它包括以下步驟(a)材料預(yù)處理采集新鮮構(gòu)樹的根、莖段和成熟葉，用雙蒸水沖洗干凈后，無菌水略洗；(b)材料消毒將步驟(a)的構(gòu)樹成熟葉用75%KOH漂洗lmin，無菌水沖洗，2. 5% Natno漂洗3min，無菌水沖洗，75% KOH漂洗0. 5min，無菌水沖洗；步驟(a)的構(gòu)樹根和莖段用75% KOH漂洗lmin，無菌水沖洗，5% NaCHO漂洗;3min，無菌水沖洗，75% KOH漂洗 0. 5min，無菌水沖洗；(c)構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離將步驟(b)的成熟葉用無菌濾紙吸干水分后切成組織塊， 根、莖段剝?nèi)ジひ嗲谐山M織塊，接入PDA培養(yǎng)基；(d)構(gòu)樹內(nèi)生真菌的純化將分離繁殖出的不同種類的構(gòu)樹內(nèi)生真菌接入PDA平板純化；(e)構(gòu)樹內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(d)所分構(gòu)樹內(nèi)生真菌接入PDB培養(yǎng)基，置25°C搖床，30-150 r/min，液體發(fā)酵培養(yǎng)8-20 d ；(f)菌株發(fā)酵液的乙酸乙酯提取步驟(e)發(fā)酵液經(jīng)4500-5500r/min離心2. 5-3. 5 min，取發(fā)酵上清液，用等體積乙酸乙酯對發(fā)酵上清液進行萃取，充分振搖5min，后靜置 30min，萃取3次，在0. 05個大氣壓減壓濃縮30min，揮干乙酸乙酯；(g)樣品配制將步驟(f)中的IOmg菌株發(fā)酵液乙酸乙酯提取物用ImlDMSO溶解后， 加入9ml PBS(-)配成1000 μδ/πι1的溶液或均勻的混懸液，然后用含0. 1% DMSO的PBS (-) 稀釋100倍；(h)具備抗炎活性的菌株篩選檢測步驟(g)的樣品對RWA264. 7細胞中LPS誘導(dǎo)NO 含量的影響。
7.一種具有抗炎活性的發(fā)酵液的制備方法，其特征在于，它包括以下步驟(a)材料預(yù)處理采集新鮮構(gòu)樹的根、莖段和成熟葉，用雙蒸水沖洗干凈后，無菌水略洗；(b)材料消毒將步驟(a)的構(gòu)樹成熟葉用75%KOH漂洗lmin，無菌水沖洗，2. 5% Natno漂洗3min，無菌水沖洗，75% KOH漂洗0. 5min，無菌水沖洗；步驟(a)的構(gòu)樹根和莖段用75% EtOH漂洗lmin，無菌水沖洗，5% NaClO漂洗3min，無菌水沖洗，75% EtOH漂洗 0. 5min，無菌水沖洗；(c)構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離將步驟(b)的成熟葉用無菌濾紙吸干水分后切成組織塊， 根、莖段剝?nèi)ジひ嗲谐山M織塊，接入PDA培養(yǎng)基；(d)構(gòu)樹內(nèi)生真菌的純化將分離繁殖出的不同種類的構(gòu)樹內(nèi)生真菌接入PDA平板純化；(e)構(gòu)樹內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(d)所分構(gòu)樹內(nèi)生真菌接入PDB培養(yǎng)基，置25°C搖床，30-150 r/min，液體發(fā)酵培養(yǎng)8-20 d ；(f)菌株發(fā)酵液的乙酸乙酯提取步驟(e)發(fā)酵液經(jīng)4500-5500r/min離心2. 5-3. 5 min，取發(fā)酵上清液，用等體積乙酸乙酯對發(fā)酵上清液進行萃取，充分振搖5min，后靜置 30min，萃取3次，在0. 05個大氣壓減壓濃縮30min，揮干乙酸乙酯。
8.構(gòu)樹內(nèi)生真菌在制備抗炎活性藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的構(gòu)樹內(nèi)生真菌是按照權(quán)利要求6的方法分離篩選得到的。
9.根據(jù)權(quán)利1、3、4、6或7任一所述的方法，其特征在于，所述的PDA培養(yǎng)基各組分及質(zhì)量百分比為土豆20%，葡萄糖2%，瓊脂1. 5%，余量為H2O, pH自然。
全文摘要
本發(fā)明提供一種耐重金屬Zn的構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離篩選方法，及構(gòu)樹內(nèi)生真菌在修復(fù)重金屬污染土壤中的應(yīng)用，本發(fā)明還提供一種具有抗人肝癌細胞活性的構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離篩選方法、一種具有抗人肝癌細胞活性的發(fā)酵液的制備方法，及構(gòu)樹內(nèi)生真菌在制備抗人肝癌細胞活性藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明還提供一種具有抗炎活性的構(gòu)樹內(nèi)生真菌的分離篩選方法、一種具有抗炎活性的發(fā)酵液的制備方法，及構(gòu)樹內(nèi)生真菌在制備抗炎活性藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明的優(yōu)點在于從構(gòu)樹中成功篩選出耐重金屬Zn、具備抗人肝癌細胞活性、具備抗炎活性的構(gòu)樹內(nèi)生真菌，提供了有效的菌種分離篩選方法，為重金屬污染土壤的生物修復(fù)提供了切實可行的方法，并且開辟了抗癌、抗炎藥物研發(fā)的新途徑。
文檔編號C12R1/645GK102533569SQ20121004340
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月24日
發(fā)明者張春燕, 秦路平, 賈敏, 黃寶康 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)