專利名稱：一種結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于多重聚合酶式反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(mPCR-SSCP)用于同時檢測結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，簡稱MTB)臨床分離株耐異煙胼和利福平相關(guān)的基因突變的方法，可同時用于臨床結(jié)核分枝桿菌異煙胼和利福平耐藥性的快速檢測。
背景技術(shù)：
中國結(jié)核病人數(shù)位于全球第二，近年來結(jié)核分支桿菌的耐藥性呈現(xiàn)顯著的增長趨勢，中國也是耐藥性程度最高的國家之一，耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)已經(jīng)成為一個嚴(yán)重的公眾健康問題。異煙胼(INH)、利福平(RFP)、鏈霉素(SM)和乙胺丁醇(EMB)是臨床一線抗結(jié)核藥物。所謂耐多藥結(jié)核病是指至少對INH和RFP兩個主要抗結(jié)核藥物耐藥的結(jié)核病，全球約有4. 3 %的結(jié)核病例發(fā)生耐多藥，部分高發(fā)地區(qū)的耐多藥更是高達(dá)10%以上，耐藥的上升特別是耐多藥率逐年上升，成為結(jié)核病日趨流行的主要原因?；仡櫺哉{(diào)查結(jié)果表明，中國結(jié)核分支桿菌的總耐藥率為27. 8 %，耐多藥率為10. 7%。及早的MTB藥敏試驗結(jié)果以便制訂個性化治療方案是結(jié)核控制的關(guān)鍵。由于MTB 生長緩慢，經(jīng)典的藥敏試驗以細(xì)菌培養(yǎng)為基礎(chǔ)，目前雖然有新的液體培養(yǎng)基的出現(xiàn)，但耗時仍然較長，不能及時獲得藥敏試驗結(jié)果；不僅影響治療效果，而且不能及時阻斷傳播還可能促進(jìn)耐藥株形成。因此，開發(fā)一種快速測定MTB耐藥性特別是同時檢測耐多藥性的檢測方法，對于規(guī)范用藥、及時阻斷耐結(jié)核株的傳播，提高結(jié)核病治愈率具有重要意義。大量研究結(jié)果顯示，耐多藥結(jié)核分枝桿菌中多個藥物作用靶位基因突變是引起耐多藥的主要原因。 近年來報道了許多檢測結(jié)核耐藥相關(guān)基因突變的分子生物學(xué)方法；然而，這些方法往往需要高昂的成本、專業(yè)的儀器設(shè)備及極強(qiáng)的專業(yè)操作技能?；谝陨显颍壳皣鴥?nèi)用于MTB 耐藥相關(guān)基因突變檢測多停留在研究機(jī)構(gòu)或?qū)嶒炇覂?nèi)，目前還沒有一種不用專業(yè)技術(shù)人員操作能在臨床應(yīng)用的檢測方法。PCR-SSCP技術(shù)是1989年日本關(guān)谷實驗室將PCR反應(yīng)與單鏈DNA非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳相結(jié)合而創(chuàng)立的。其基本原理為DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對等分子內(nèi)相互作用力來維持的；單鏈DNA片段堿基發(fā)生改變時，影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變；空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開，即所謂的單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-Mrand Conformation PolymorPhism, SSCP)。將SSCP檢測方法用于檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因突變，建立的PCR-SSCP技術(shù)，可用于科學(xué)研究中檢測基因點突變和短序列的缺失和插入，進(jìn)行DNA定量分析。該方法操作簡便，且以PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)，能檢測到單個基因突變產(chǎn)生的改變，其靈敏度、特異性高，也可用于一般臨床實驗室。2007年香港Chan等報道過用PCR-SSCP檢測MTB某些基因突變與耐藥的相關(guān)性，包洪等2007年利用PCR-SSCP檢測了痰標(biāo)本中與利福平耐藥相關(guān)基因rpoB突變與耐藥的相關(guān)性，特異性和靈敏度都有很好的臨床意義；但由于MTB耐藥基因數(shù)量多，逐個進(jìn)行PCR-SSCP分析仍然十分麻煩且費時費工；國內(nèi)的程曉東等報道用mPCC-SSCP同時檢測與異煙胼耐藥相關(guān)三個基因突變，解決了單個PCR-SSCP費時費工的缺陷，但只檢測了單個藥物異煙胼耐藥相關(guān)基因突變；不適應(yīng)逐年增加的MTB的多耐藥率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述背景技術(shù)的不足，提供一種結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測方法，該方法應(yīng)能同時測定結(jié)核分枝桿菌對異煙胼和利福平的耐藥性，具有特異性與靈敏度較高、檢測快速、操作簡便易行、易于規(guī)范化且成本低、以及有利于在臨床實驗室普及的特
點ο本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測方法，其步驟是A、建立MTB臨床菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的PCR模板；B、設(shè)計與異煙胼和利福平耐藥密切相關(guān)katG、inhA和rpoB基因片段的三對引物， 同時對臨床菌株的katG、inhA和rpoB基因進(jìn)行mPCR擴(kuò)增；并對臨床菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv 的katG、inhA和rpoB基因分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；C、采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測方法同時檢測臨床菌株耐INH和RFP相關(guān)的3個基因的突變情況；所述步驟B中的mPCR引物以及PCR引物是擴(kuò)增katG基因的上、下游引物分別為 5，-AAG GAA GCC ACC TGG CTC GGC-3，以及 5，-GCC GAA CGG GTC CGG GAT GGT-3，，擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期的大小為510bp ；擴(kuò)增inhA基因的上、下游引物分別為5’-GGC ATC CAC ATC TCG GCG-3，以及5，-CAG CGC GCA CAC CGT CTT GGC-3，，擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期的大小為381bp ；擴(kuò)增 rpoB 基因的上、下游引物分別為 5’ -ACA TCC GGC CGG TGG TCG CCG-3，以及 5，-TTT CGA TCG GGC ACA TCC GGC-3，，擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期的大小為207bp。所述mPCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為PCR總體積100 μ L,內(nèi)含2. 5mol/L dNTP、katG、inhA 和rpoB基因的各自上、下游引物250mmol/L、2. 5U Ex-Taq DNA聚合酶(TaKafci)、2μ L模板、 IX PCR 緩沖液(ρΗ8· 3)。所述mPCR 擴(kuò)增的參數(shù)為94°C 4min ；94°C 30s,52°C 30s,72°C 45s，循環(huán)；35 輪； 720C 5min ；采用1 μ g/mL溴乙錠預(yù)染2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中只加katG、inhA或rpoB基因的各自上、下游引物 250mmol/L,反應(yīng)體系其它成分以及PCR參數(shù)與mPCR相同。所述單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測方法是將上述mPCR產(chǎn)物以及結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 H37RvkatG、inhA和rpoB基因的PCR產(chǎn)物各10 μ L分別與等體積變性劑混合，沸水浴5min 后冰浴anin，50(K)r/min 4°C離心2min，取水相加入8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠上樣孔， 13°C 400V電泳5min后120V電泳10h，然后取膠板進(jìn)行銀染法染色，觀察結(jié)果(單基因PCR 產(chǎn)物經(jīng)變性后形成2條或3條單鏈，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后呈現(xiàn)1 3條帶)；若單鏈位置與標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv單鏈位置不同，稱為運動變位，判定為基因突變。還對MTB臨床菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株H37RV的katG、inhA和rpoB基因分別進(jìn)行DNA直接測序，然后對測序結(jié)果進(jìn)行比較，驗證單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測方法的可靠性。對MTB臨床菌株進(jìn)行DNA測序時設(shè)置H37Rv株作標(biāo)準(zhǔn)對照；臨床菌株與H37Rv株的katG、inhA或rpoB基因擴(kuò)增片段分別用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(BioColor)提純、回收后，測序。還對MTB臨床菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv進(jìn)行藥物敏感試驗，根據(jù)藥敏結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)， 測定結(jié)核分枝桿菌臨床菌株對異煙胼和利福平耐藥性。所述藥物敏感試驗是采用絕對濃度法檢測MTB臨床菌株對INH和RFP的耐藥性， 實驗中以對INH和RFP敏感的標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv為質(zhì)控菌株，藥物濃度為低高兩個濃度，INH 為1和10 μ g/mL, RFP為50和250 μ g/mL,實驗重復(fù)三次以確保結(jié)果正確。所述藥敏結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)是在無藥對照培養(yǎng)基上被檢菌株生長良好時，含藥培養(yǎng)基斜面無菌落生長為敏感；菌落生長占斜面面積1/4為耐藥1+ ；菌落生長占斜面面積1/2 耐藥2+ ；菌落生長占斜面面積3/4為耐藥3+。低濃度含藥培養(yǎng)基菌落生長1+以上提示耐藥。所述步驟A中PCR模板的DNA從經(jīng)過培養(yǎng)的MTB臨床菌株以及標(biāo)準(zhǔn)菌株H37RvDNA
基因組中提取。所述PCR模板的DNA提取方法是將細(xì)菌培養(yǎng)物移入1. 5ml離心管中，用生理鹽水洗滌3次，6000r/m、4°C離心5min棄上清，取沉淀用提取DNA試劑盒提取DNA。所述變性劑的成分為95%重量比的甲酰胺、10mmoL/LEDTA、0. 02%重量比的溴酚藍(lán)，其余為水。本發(fā)明的有益效果是1)本發(fā)明利用Genbank公布的NC_000962 H37Rv基因序列設(shè)計的三對一次性檢測異煙胼和利福平耐藥相關(guān)基因的mPCR引物序列，可使所有臨床菌株均能擴(kuò)增出對應(yīng)目的基因片段。2)本發(fā)明通過mPCR-SSCP同時檢測與結(jié)核分支桿菌INH和RFP耐藥密切相關(guān)的 katG、inhA和rpoB基因突變，與常規(guī)絕對濃度法藥敏試驗比較，方法的特異性分別為100% 和97.8%，靈敏度為78. 6%和91. 1% ；高于傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗，表明我們發(fā)明的mPCR-SSCP能用于臨床菌株多耐藥性檢測。3)本發(fā)明通過對mPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)檢測(如MTB臨床菌株katG、inhA和rpoB基因片段存在突變，則通過電泳后與H37Rv株比較DNA單鏈的數(shù)目及位置是否存在不同)，由此篩選出存在目的基因突變菌株；又通過PCR直接測序確定目的基因突變位點，進(jìn)一步驗證了 SSCP的可靠性(檢測證明所有INH敏感結(jié)核分枝桿菌相關(guān)基因與PCR-DS結(jié)果全部一致，RFP敏感菌符合率為98. 9%;INH耐菌株mPCR-SSCP檢測結(jié)果與 PCR-DS符合率為91. 7% )。還通過藥物敏感試驗測定了耐藥性(RFP耐藥菌株mPCR-SSCP 檢測結(jié)果與PCR-DS符合率為95. 3%。mPCR-SSCP與PCR-DS總符合率至少為91.7%)。進(jìn)一步驗證了 mPCR-SSCP的檢測結(jié)核分支桿菌INH和RFP耐藥密切相關(guān)的katG、inhA和rpoB 基因突變的可靠性。4)本發(fā)明通過引物設(shè)計在同一 PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行多個與耐藥相關(guān)基因目的片段擴(kuò)增，結(jié)合單鏈DNA非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，不僅利用了 PCR的高靈敏度，而且通過設(shè)計引物建立mPCR同時擴(kuò)增三個與異煙胼和利福平耐藥相關(guān)的基因片段，簡化了實驗操作、降低了試驗成本。5)本發(fā)明特異性與靈敏度較高，能檢測通過培養(yǎng)的MTB，也可以直接檢測疑似結(jié)核病人痰標(biāo)本，能在1 2天內(nèi)快速獲得實驗結(jié)果，不僅MTB檢出率高于涂片陽性率，且由于本發(fā)明操作簡便、不需要昂貴的儀器設(shè)備、易于規(guī)范化成本又低，有利于在臨床實驗室推廣普及，將會帶來顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。此外，本發(fā)明可用于痰液標(biāo)本直接檢測；由于提取MTB使用痰量限制，檢出率明顯低于直接用MTB樣本進(jìn)行檢測；本發(fā)明用mPCR-SSCP同時檢測了疑似結(jié)核病人痰液標(biāo)本與 INH耐藥相關(guān)的katG和inhA基因突變，以及與RFP耐藥相關(guān)的rpoB基因突變，方法步驟與培養(yǎng)MTB為標(biāo)本的mPCR-SSCP相同；發(fā)現(xiàn)雖然靈敏度與特異性降低，但以病人痰液為直接檢測對象，檢測結(jié)果可以在Mi內(nèi)給出；與傳統(tǒng)MTB藥敏需時2 3月比極大縮短時間，為及時阻斷MTB耐藥菌株的傳播提供了有力的技術(shù)支持。


圖1是本發(fā)明的檢測方法示意圖。圖2是本發(fā)明中用于mPCR擴(kuò)增的各基因上、下游引物序列設(shè)計區(qū)域示意圖。圖3是結(jié)核分枝桿菌katG、inhA和rpoB基因mPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。其中泳道M =DNA Marker ；泳道1 :H37Rv株擴(kuò)增條帶；泳道2 對INH及RFP敏感的臨床菌株； 泳道3和4 僅對INH耐藥的臨床菌株；泳道5和6 僅對RFP耐藥的臨床菌株；泳道7和8 對INH和RFP均耐藥的臨床菌株。圖4是結(jié)核分枝桿菌katG、inhA和rpoB基因mPCR-SSCP分析檢測圖。其中泳道 MK,MI和M R分別表示結(jié)核分枝桿菌H37Rv株的katG、inhA和rpoB基因PCR-SSCP電泳結(jié)果；泳道1和5 :H37Rv株；泳道2 :katG變位臨床菌株電泳結(jié)果；泳道3 :inhA變位臨床菌株電泳結(jié)果；泳道4 :rpoB變位臨床菌株電泳結(jié)果；泳道6 :katG+inhA變位臨床菌株電泳結(jié)果；泳道7 :katG+rpoB變位臨床菌株電泳結(jié)果；泳道8 :inhA+rpoB變位臨床菌株電泳結(jié)果； 泳道9 :katG+inhA+rpoB變位臨床菌株電泳結(jié)果。
具體實施例方式序列表說明序列1是根據(jù)GenBank(DNA序列數(shù)據(jù)庫)公布的H37Rv基因序列(Accession NC_000962)設(shè)計的擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌katG基因目的片段的上游引物，為核苷酸序列。序列2是根據(jù)GenBank公布的H37Rv基因序列(Accession :NC_000962)設(shè)計的擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌katG基因目的片段的下游引物，為核苷酸序列。序列3是根據(jù)GenBank公布的H37Rv基因序列(Accession :NC_000962)設(shè)計的擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌inhA基因目的片段的上游引物，為核苷酸序列。序列4是根據(jù)GenBank公布的H37Rv基因序列(Accession :NC_000962)設(shè)計的擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌inhA基因目的片段的下游引物，為核苷酸序列。序列5是根據(jù)GenBank公布的H37Rv基因序列(Accession :NC_000962)設(shè)計的擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌rpoB基因目的片段的上游引物，為核苷酸序列。序列6是根據(jù)GenBank公布的H37Rv基因序列(Accession :NC_000962)設(shè)計的擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌rpoB基因目的片段的下游引物，為核苷酸序列。本發(fā)明利用根據(jù)基因突變是引起結(jié)核分枝某些菌耐藥的主要原因這一耐藥機(jī)制， 通過分子生物學(xué)手段建立檢測與多耐藥相關(guān)基因的突變的mPCR-SSCP。
基因選擇的依據(jù)所謂耐多藥結(jié)核病是指至少對INH和RFP兩個主要抗結(jié)核藥物耐藥的結(jié)核病，大量研究結(jié)果顯示，耐多藥結(jié)核分枝桿菌中多個藥物作用靶位基因突變是引起多重耐藥的主要原因，其中結(jié)核桿菌耐多藥相關(guān)基因katG、inhA和rpoB的突變與細(xì)菌對INH和RFP耐藥密切相關(guān)。所以通過檢測katG、inhA和rpoB的突變?yōu)榕R床提供結(jié)核分枝桿菌臨床菌株耐多藥特點，我們構(gòu)建了能同時檢測上述基因突變的mPCR-SSCP用于檢測MTB對應(yīng)基因的突變，結(jié)果表明突變檢出率達(dá)90%以上，且檢測方法靈敏度、特異性高， 是一種簡便易行、靈敏、特異的檢測方法。本發(fā)明采用mPCR-SSCP的理由是基因突變是引起結(jié)核分枝桿菌耐藥的主要原因 (耐多藥結(jié)核分枝桿菌中多個藥物作用靶位基因突變是引起多重耐藥的主要原因)；目前以單一基因突變檢測為目的的PCR-SSCP已有不少研究報道，隨著耐多藥率的不斷升高，常常需要同時檢測臨床菌株對多種藥物的耐藥性；若使用多個PCR-SSCP檢測多個耐藥基因突變，不僅提高檢測成本，而且操作過程繁復(fù)而增加了實驗誤差發(fā)生率；通過mPCR(多重擴(kuò)增)可一次性檢測多個基因的目的片段，簡化了實驗操作、降低了試驗成本。檢測結(jié)核分枝桿菌耐多藥相關(guān)基因katG、inhA和rpoB的突變的mPCR-SSCP，包含以下的步驟1)建立MTB臨床菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的PCR模板(同時作為mPCR擴(kuò)增模板)2)設(shè)計與異煙胼和利福平耐藥密切相關(guān)各基因擴(kuò)增的上、下游引物；3)采用mPCR在同一反應(yīng)體系中同時擴(kuò)增臨床菌株katG、inhA和rpoB目的基因片段；4) katG、inhA和rpoB目的基因mPCR產(chǎn)物經(jīng)SSCP篩選出目的基因突變菌株(通過與標(biāo)準(zhǔn)菌株對比進(jìn)行篩選)；5)PCR分別擴(kuò)增臨床菌株以及標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的katG、inhA和rpoB目的基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后進(jìn)行DNA測序。上述檢測方法適用于各應(yīng)用單位(醫(yī)院、研究院所、疾病預(yù)防控制中心等)。本發(fā)明還包括了以下內(nèi)容1)對臨床菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行絕對濃度法藥敏試驗，比較確定mPCR-SSCP方法特異性與靈敏度；2)與PCR直接測序比較，確定mPCR-SSCP方法檢測基因突變的檢出率。以下結(jié)合實施例進(jìn)一步說明。實施例本實施例中標(biāo)本來源為經(jīng)培養(yǎng)并鑒定的結(jié)核分枝桿菌臨床菌株，也可以是疑似結(jié)核病人的痰標(biāo)本。本實施例中試劑來源本實施例中所用的一切實驗用材料和試劑及相關(guān)設(shè)備均可從各自國內(nèi)外相關(guān)產(chǎn)業(yè)公司或國外公司國內(nèi)銷售代理公司購得。在微生物學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員，均可重復(fù)本實施例中的制備方法并進(jìn)行試用。1. DNA基因組提取從經(jīng)過培養(yǎng)與鑒定的134例MTB臨床菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv 的DNA基因組中提?。痪唧w是將細(xì)菌培養(yǎng)物移入1. 5ml離心管中，用生理鹽水洗滌3次， 6000r/m(4°C )離心5min棄上清，取沉淀用提取DNA試劑盒提取DNA，用作mPCR及PCR擴(kuò)增的模板。2. mPCR 引物設(shè)計根據(jù) GenBank 公布的 H37Rv 基因序列(Accession :NC_000962)， 按擴(kuò)增區(qū)域盡可能涵蓋85%以上耐藥基因突變位點為原則，選擇katG、inhA和rpoB基因合適的擴(kuò)增區(qū)域并采用Blast軟件設(shè)計擴(kuò)增引物(設(shè)計區(qū)域示意圖見附圖2、。擴(kuò)增katG 基因的上、下游引物分別為 5，-AAG GAA GCC ACC TGG CTC GGC-3，以及 5，-GCC GAA CGG GTC CGG GAT GGT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期的大小為510bp ；擴(kuò)增inhA基因的上、下游引物分別為 5，-GGC ATC CAC ATC TCG GCG-3，以及 5，-CAG CGC GCA CAC CGT CTT GGC-3，，擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期的大小為381bp ；擴(kuò)增rpoB基因的上、下游引物分別為5，-ACA TCC GGC CGG TGG TCG CCG-3，以及 5，-TTT CGA TCG GGC ACA TCC GGC-3，，擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期的大小為 207bp。3. mPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系總體積100 μ L，內(nèi)含2. 5mol/L dNTP、katG、inhA和 rpoB基因的各自上、下游引物250mmol/L、2. 5U Ex-Taq DNA聚合酶(TaKafci)、2 μ L模板、 IX PCR 緩沖液(ρΗ8· 3)。4.mPCR 參數(shù)94°C 4min ；94°C 30s,52°C 30s,72°C 45s，循環(huán) 35 輪；72°C 5min。采用1 μ g/mL溴乙錠預(yù)染的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。5. PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中只加katG、inhA或rpoB基因的各自上、下游引物250mmol/L，反應(yīng)體系其它成分以及PCR參數(shù)與mPCR相同。6. SSCP 上述mPCR產(chǎn)物及標(biāo)準(zhǔn)菌株katG、inhA和rpoB基因的PCR產(chǎn)物各 10 μ L (共4份；其中mPCR產(chǎn)物1份，katG、inhA以及rpoB基因的PCR產(chǎn)物各1份)與等體積變性劑(成分及重量比為95%甲酰胺、lOmmoL/LEDTAj.OZ^溴酚藍(lán)，其余為水)混合， 沸水浴5min后冰浴2min，5000r/min、4°C離心2min，取水相加入8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上樣孔，13°C 400V電泳5min后120V電泳10h，然后取膠板進(jìn)行銀染法染色，觀察結(jié)果。單基因PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后形成2條或3條單鏈，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后呈現(xiàn)1 3條帶。若臨床菌株的單鏈位置與標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv單鏈位置不同(稱為運動變位)，判定為基因突變。7. PCR直接測序為驗證上述mPCR-SSCP檢測的可靠性，還對臨床菌株以及標(biāo)準(zhǔn)菌株的katG、inhA以及rpoB基因分別進(jìn)行PCR直接測序(PCR-DS)；用于測序的單個基因的PCR擴(kuò)增引物同mPCR，只是反應(yīng)體系中只加katG、inhA和rpoB基因的各自上、下游引物 250mmol/L,反應(yīng)體系其它組成與mPCR相同，PCR參數(shù)也與mPCR相同；設(shè)置H37Rv株作標(biāo)準(zhǔn)對照，臨床菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的katG、inhA和rpoB基因擴(kuò)增片段用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(BioColor)提純、回收后，測序。8.藥物敏感試驗為驗證上述mPCR-SSCP檢測的耐藥性結(jié)果符合率，采用絕對濃度法檢測結(jié)核分枝桿菌臨床菌株對INH和RFP的耐藥性；實驗中以對INH和RFP敏感的標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv為質(zhì)控菌株，藥物濃度為低高兩個濃度，INH為1和10 μ g/mL, RFP為50和 250 μ g/mL,實驗重復(fù)三次以確保結(jié)果正確。9.藥敏結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)在無藥對照培養(yǎng)基上被檢菌株生長良好時，含藥培養(yǎng)基斜面無菌落生長為敏感；菌落生長占斜面面積1/4為耐藥1+ ；菌落生長占斜面面積1/2耐藥 2+ ；菌落生長占斜面面積3/4為耐藥3+。低濃度含藥培養(yǎng)基菌落生長1+以上提示耐藥。本實施例結(jié)果1.藥敏試驗結(jié)果134株臨床菌株中，52株對INH或?qū)FP耐藥，總耐藥率為38. 8% ；35株同時對INH和RFP耐藥呈耐多藥，耐多藥率為26. 1% ；分別有7和10株僅對 INH或RFP耐藥。2.檢測結(jié)果所有(134株)結(jié)核分枝桿菌臨床菌株mPCR和H37Rv株P(guān)CR后均出現(xiàn)510bp的katG基因、381bp的inhA基因和207bp的rpoB基因擴(kuò)增片段(圖3)。3. PCR-DS結(jié)果(參見表1和表2) :134株臨床分離株的katG、inhA和rpoB基因片段測序結(jié)果與H37Rv株相應(yīng)基因序列(Accession :NC_00096》比較結(jié)果見表2。其中82 株對INH和RFP均敏感菌株中，有81株的KatG和inhA基因片段序列與H37Rv株相應(yīng)基因序列完全相同，1株rpoB基因發(fā)生L511M突變；10株僅對INH敏感菌株的katG和inhA基因片段、7株僅對RFP敏感菌株的rpoB基因片段與H37Rv株相應(yīng)序列完全相同；PCR-DS檢測臨床菌株對INH和RFP耐藥的特異性分別為100%和98. 9%。42株對INH耐藥的臨床菌株中，katG和/或inhA基因突變36株，PCR-DS檢測菌株對INH耐藥的靈敏度為85. 7%。 INH耐藥菌株中，katG基因測定區(qū)域有8個氨基酸發(fā)生10種類型的替換突變，以315位絲氨基酸突變最常見；其中22株發(fā)生S315N/T/I突變，4株為S315突變伴其它位點的雙突變。 inhA基因測定區(qū)域，7個氨基酸位點發(fā)生11次替換突變。45株RFP耐藥菌株中檢測到rpoB 基因突變的菌株43株，PCR-DS檢測臨床菌株對RFP耐藥的靈敏度為95. 6%，最常見的突變位點為編碼5沈、531和516位氨基酸的核苷酸序列，其突變頻率H5^D/Y/R/L(48. 8%， 21/43) > S531L (39. 5 %，17/43) > D516V/Y (9.3%, 4/43) > L533P (7. 0 %, 3/43)，其中 D516V+H526D 和 H526L+S531L 雙突變各 1 株。4. SSCP結(jié)果(參見表1、表2及圖4)參考標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv三個目的基因SSCP電泳圖譜，82株對INH和RFP均敏感的結(jié)核分枝桿菌臨床菌株SSCP結(jié)果顯示，katG和inhA 基因電泳未見異常，rpoB基因電泳檢出有2株發(fā)生運動變位，17株僅對RFP或INH敏感菌株SSCP均未見異常；SSCP檢測結(jié)核分枝桿菌對INH和RFP耐藥的特異性分別為100%和 97. 8%。SSCP檢測42株INH耐藥臨床菌株katG和inhA基因突變情況，檢出katG和/或 inhA基因電泳運動異常33株，SSCP檢測臨床菌株對INH耐藥的靈敏度為78. 6% (33/42)， katG基因和inhA基因mPCR-SSCP表現(xiàn)為電泳運動變位菌株數(shù)分別為27株和10株，其中 4株katG和inhA兩個基因mPCR-SSCP電泳運動同時變位。SSCP檢測45株RFP耐藥臨床菌株rpoB基因突變情況，發(fā)現(xiàn)43株RFP耐藥菌株rpoB基因電泳運動變位，SSCP檢測臨床菌株對RFP耐藥的靈敏度為95. 6% (43/45)，其中21株伴katG基因電泳運動變位，4株伴 inhA基因電泳運動變位，2株出現(xiàn)katG、inhA和rpoB三個基因同時運動變位。表1 52株耐藥結(jié)核分枝桿菌mPCR-SSCP和PCR-DS檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測方法，其步驟是A、建立MTB臨床菌株和H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株的PCR模板；B、設(shè)計與異煙胼和利福平耐藥密切相關(guān)katG、inhA和rpoB基因片段的三對引物，同時對臨床菌株的katG、inhA和rpoB基因進(jìn)行mPCR擴(kuò)增；并對臨床菌株和H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株的的katG、inhA和rpoB基因分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；C、采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測方法同時檢測臨床菌株耐INH和RFP相關(guān)的3個基因的突變情況；所述步驟B中的mPCR引物以及PCR引物是擴(kuò)增katG基因的上、下游引物分別為 5，-AAG GAA GCC ACC TGG CTC GGC-3，以及 5，-GCC GAA CGG GTC CGG GAT GGT-3，，擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期的大小為510bp ；擴(kuò)增inhA基因的上、下游引物分別為5’-GGC ATC CAC ATC TCG GCG-3，以及5，-CAG CGC GCA CAC CGT CTT GGC-3，，擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期的大小為381bp ；擴(kuò)增 rpoB 基因的上、下游引物分別為 5’ -ACA TCC GGC CGG TGG TCG CCG-3，以及 5，-TTT CGA TCG GGC ACA TCC GGC-3，，擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期的大小為207bp。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測方法，其特征在于所述mPCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為PCR總體積100 μ L,內(nèi)含2. 5mol/L dNTP、katG、inhA和rpoB基因的各自上、下游引物250mmol/L、2. 5UEx-TaqDNA聚合酶、2 μ L模板、ρΗ8. 3的1 XPCR緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測方法，其特征在于所述mPCR擴(kuò)增的參數(shù)為94°C 4min ；94°C 30s,52°C 30s,72°C 45s，循環(huán)；35 輪；72°C 5min ；采用 1 μ g/mL 溴乙錠預(yù)染2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測方法，其特征在于所述單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測方法是將上述mPCR產(chǎn)物以及結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株katG、inhA 和rpoB基因的PCR產(chǎn)物各10 μ L分別與等體積變性劑混合，沸水浴5min后冰浴2min， 5000r/min4°C離心2min，取水相加入8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠上樣孔，13 °C 400V電泳 5min后120V電泳10h，然后取膠板進(jìn)行銀染法染色，觀察結(jié)果；若單鏈位置與H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株單鏈位置不同，稱為運動變位，判定為基因突變。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中只加katG、inhA或rpoB基因的各自上、下游引物250mmol/L，反應(yīng)體系其它成分以及PCR參數(shù)與mPCR相同。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測方法，其特征在于還對MTB 臨床菌株和H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株的katG、inhA和rpoB基因分別進(jìn)行DNA直接測序，然后對測序結(jié)果進(jìn)行比較，驗證單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測方法的可靠性；對MTB臨床菌株進(jìn)行DNA測序時設(shè)置H37Rv株作標(biāo)準(zhǔn)對照；臨床菌株與H37Rv株的 katG、inhA或rpoB基因擴(kuò)增片段分別用PCR產(chǎn)物純化試劑盒提純、回收后，測序。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測方法，其特征在于還對MTB臨床菌株和H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行藥物敏感試驗，根據(jù)藥敏結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，測定結(jié)核分枝桿菌臨床菌株對異煙胼和利福平耐藥性；所述藥物敏感試驗是采用絕對濃度法檢測MTB臨床菌株對INH和RFP的耐藥性，實驗中以對INH和RFP敏感的H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株為質(zhì)控菌株，藥物濃度為低高兩個濃度，INH為1 和10 μ g/mL, RFP為50和250 μ g/mL,實驗重復(fù)三次以確保結(jié)果正確；所述藥敏結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)是在無藥對照培養(yǎng)基上被檢菌株生長良好時，含藥培養(yǎng)基斜面無菌落生長為敏感；菌落生長占斜面面積1/4為耐藥1+ ；菌落生長占斜面面積1/2耐藥 2+ ；菌落生長占斜面面積3/4為耐藥3+。低濃度含藥培養(yǎng)基菌落生長1+以上提示耐藥。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測方法，其特征在于所述步驟A 中PCR模板的DNA從經(jīng)過培養(yǎng)的MTB臨床菌株以及H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA基因組中提取。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測方法，其特征在于所述PCR模板的DNA提取方法是將細(xì)菌培養(yǎng)物移入1. 5ml離心管中，用生理鹽水洗滌3次，6000r/m、 4°C離心5min棄上清，取沉淀用提取DNA試劑盒提取DNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測方法，其特征在于所述變性劑的成分為95%重量比的甲酰胺、10mmoL/LEDTA、0. 02%重量比的溴酚藍(lán)，其余為水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測方法。目的是提供的方法應(yīng)能同時測定結(jié)核分枝桿菌對異煙肼和利福平的耐藥性，具有特異性與靈敏度較高、檢測快速以及操作簡便的特點。技術(shù)方案是一種結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測方法，其步驟是A、建立MTB臨床菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的PCR模板；B、設(shè)計與異煙肼和利福平耐藥密切相關(guān)katG、inhA和rpoB基因片段的三對引物，同時對臨床菌株的katG、inhA和rpoB基因進(jìn)行mPCR擴(kuò)增；并對臨床菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的katG、inhA和rpoB基因分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；C、采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測方法同時檢測臨床菌株耐INH和RFP相關(guān)的3個基因的突變情況。
文檔編號C12R1/32GK102559916SQ20121004356
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月24日
發(fā)明者嚴(yán)杰, 孫愛華, 李召東 申請人:嚴(yán)杰, 孫愛華, 李召東