專利名稱：一種硝酸咪康唑栓的微生物限度檢查方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，特別涉及一種硝酸咪康唑栓的微生物限度檢查方法。
背景技術：
硝酸咪康唑是一種廣譜抗真菌藥，對多種真菌尤其是念珠菌生長有很強的抑制作用，對某些革蘭陽性細菌也有抗菌力。在微生物限度檢查中，由于抗菌藥物會抑制某些微生物的生長繁殖，用常規(guī)方法檢查會出現(xiàn)假陰性的結果，但并不等于藥品中沒有微生物甚至是致病性微生物，而這些被微生物污染的藥品進入人體后，有些微生物會復蘇并繁殖，危及人體健康。目前市場上銷售的硝酸咪康唑栓所用的輔料大致有三類含硬脂、混合脂肪酸甘油酯、半合成脂肪酸甘油酯，其中硬脂最難溶解，抑菌性也最強。由于硝酸咪康唑屬于廣譜抗生素類藥物，因此具有較強的抑菌性；另外從劑型上看它屬于難溶的脂溶性栓劑，重量大而且粘稠性強，這就決定了其自身的難溶性；從輔料上來講，常見的主要有EDTA、脂溶性大碳鏈組分、陽離子表面活性劑等，以上因素都影響著不同工藝條件下該產品微生物限度檢查的順利進行。有研究報道，硝酸咪康唑栓供試品溶液制備方法為取樣品10克切碎，加入無菌十四烷酸異丙酯30ml及玻璃珠，再加入45°C pH7. O無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖使全部融化，放置分層，分取水層作為I : 10的供試液。檢查方法驗證過程中為采用薄膜過濾法，用PH7. O無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液過濾10次，每次100ml。控制菌驗證方法金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均采用薄膜過濾法，缺少白色念珠菌的驗證方法。另有研究報道，硝酸咪康唑栓供試品溶液制備方法為取樣品IOg切碎，加至含 20ml無菌十四燒酸異丙酯及無菌玻璃珠的三角瓶中，45°C水浴保溫IOmin,充分振搖使全部融化。加入pH 7. O無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液IOOml萃取，振搖lOmin，靜置分層，取水層作為I : 10的供試液。檢查方法驗證過程中為采用薄膜過濾法，用保溫45°C無菌的pH 7. O氯化鈉-蛋白胨緩沖液400ml，分4次沖洗?？刂凭炞C方法金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均采用薄膜過濾法，缺少白色念珠菌的驗證方法。按照以上文獻報道的試驗方法，以聚山梨酯8010%的pH7. O氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋液，以O. 1%聚山梨酯80的O. 1%蛋白胨水溶液為沖洗液。在采用薄膜過濾法測回收率試驗時，樣品在稀釋液中即難溶解，且脂水分層極慢。不僅延長了試驗時間，而且在做霉菌和酵母菌、控制菌(金黃色葡萄球菌、白色念珠菌)檢查時沖洗較困難，在沖洗量接近200ml時就出現(xiàn)堵膜，造成試驗不能繼續(xù)進行。以上方法中普遍存在以下幾個問題。I.在供試品溶液的制備過程中直接加入的有機溶劑十四烷酸異丙酯破壞了細菌的生存環(huán)境，不利于細菌的生長；此外，玻璃珠的碰撞可能會對樣品中所含的細菌造成損傷；以10%聚山梨酯80的pH7. O氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋液，以O. I %聚山梨酯80的 O. 1%蛋白胨水溶液為沖洗液；在采用薄膜過濾法測回收率試驗時，樣品在稀釋液中難以溶解，且脂水分層速度慢。不僅延長了試驗時間，而且在做霉菌和酵母菌、控制菌(金黃色葡萄球菌、白色念珠菌)檢查時沖洗較困難，在沖洗量接近200ml時就經常出現(xiàn)堵膜，造成試驗不能繼續(xù)進行。2.在細菌、霉菌和酵母菌方法驗證過程中，有的沖洗方法采用IOOOml/膜、IOOml/ 次的沖洗方法，沖洗時間過長，成本較大，沖洗過程也造成了對細菌的損傷，長時間沖洗還可能導致微生物的污染；此外，由于不同生產廠家采用了不同的賦形劑，例如有的廠家的賦形劑為酯類、EDTA，賦形劑可以增強樣品的抑菌強度，但是賦形劑越多樣品越難溶解，沖洗液的用量應充分考慮到不同賦形劑的影響。3.控制菌驗證方法金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均采用薄膜過濾法，缺少白色念珠菌的驗證方法。本藥物的抗菌譜為霉菌，同時也對某些細菌有抑制作用，因此，依據《中國藥典》2010年版的要求及本藥物為婦科用栓劑的特性，應增加白色念珠菌的質量控制方法。

發(fā)明內容
根據硝酸咪康唑栓在微生物限度檢查中遇到的這些問題，本發(fā)明有針對性地開展了相應的研究，提供了一種硝酸咪康唑栓的微生物限度檢查方法。本發(fā)明的技術解決方案是一種硝酸咪康唑栓的微生物限度檢查方法，包括以下步驟I. I菌液制備接種枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，33±2°C培養(yǎng)24h;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，25±2°C培養(yǎng)48h ;上述培養(yǎng)物用質量體積百分比濃度O. 9%無菌氯化鈉溶液制成每 Iml含50 IOOcfu的菌懸液；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上， 25±2°C培養(yǎng)7天加入3ml含體積百分比濃度O. 05% (ml/ml)的聚山梨酯80的質量體積百分比濃度O. 9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子用含體積百分比濃度O. 05% (ml/ ml)的聚山梨酯80的質量體積百分比濃度O. 9 %無菌氯化鈉溶液制成每Iml含50 IOOcfu 的菌懸液；I. 2供試品溶液制備稱取供試品10g，加入含體積百分比濃度10%聚山梨酯80的pH7. O氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋液IOOml于45°C以下水浴振搖使溶解后，加入十四烷酸異丙酯20ml輕微振搖，靜置分層，取水層作為I : 10的供試液；I. 3細菌、霉菌和酵母菌方法驗證1.3. I 試驗組取I : 10供試液Iml加入含50ml體積百分比濃度O. I %聚山梨酯80的質量體積百分比濃度O. 1%蛋白胨水溶液為沖洗液的薄膜過濾器中，用沖洗液500ml/膜，IOOml/次沖洗；在最后一次沖洗液中加入50 IOOcfu “菌液制備”項下的菌懸液，過濾，取出濾膜貼于培養(yǎng)基上平行制備2皿，測定菌數(shù)；I. 3. 2 菌液組取“菌液制備”項下的菌懸液lmL，按試驗組方法測定所加試驗菌數(shù)；
I. 3. 3供試品對照組取I : 10供試液1ml，按試驗組方法，不加試驗菌，測定供試品的本底菌數(shù)；I. 3. 4稀釋劑對照組取體積比為5 I的稀釋液與十四烷酸異丙酯的混合液1ml，按試驗組方法測定所加試驗菌數(shù)；I. 4控制菌檢查方法驗證I. 4. I銅綠假單胞菌檢查I. 4. I. I 試驗組取“供試品溶液制備”項下供試液IOml和“菌液制備”項下的銅綠假單胞菌試驗菌液10 IOOcfu，加入到膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基(BL) 200ml中，依據《中國藥典》2010年版附錄XI J銅綠假單胞菌檢查法試驗；I. 4. I. 2陽性對照組取銅綠假單胞菌試驗菌液10 IOOcfu，加入到膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基(BL) 200ml 中，依據《中國藥典》2010年版附錄XI J銅綠假單胞菌檢查法試驗；I. 4. I. 3陰性對照組取稀釋液IOml加入到膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基(BL) 200ml中，依據《中國藥典》2010 年版附錄XI J銅綠假單胞菌檢查法試驗；1.4.2金黃色葡萄球菌檢查I. 4. 2. I 試驗組取“供試品溶液制備”項下供試液10ml，加入含50ml稀釋液的薄膜過濾器中過濾， 用沖洗液500ml/膜，IOOml/次沖洗至剩余50ml沖洗液時，加入“菌液制備”項下的金黃色葡萄球菌試驗菌液10 IOOcfu，依據《中國藥典》2010年版附錄XI J金黃色葡萄球菌檢查法試驗；I. 4. 2. 2陽性對照組取沖洗液500ml/膜，IOOml/次過濾至剩余50ml沖洗液時，加入“菌液制備”項下的金黃色葡萄球菌試驗菌液10 IOOcfu，依據《中國藥典》2010年版附錄XI J金黃色葡萄球菌檢查法試驗；I. 4. 2. 3陰性對照組取稀釋液IOml加入含50ml稀釋液的薄膜過濾器中過濾，用沖洗液500ml/膜， IOOml/次沖洗；依據《中國藥典》2010年版附錄XI J金黃色葡萄球菌檢查法試驗；1.4. 3白色念珠菌檢查I. 4. 3. I 試驗組取“供試品溶液制備”項下供試液10ml，加入含50ml稀釋液的薄膜過濾器中過濾， 用沖洗液800ml/膜，IOOml/次沖洗至剩余50ml沖洗液時，加入“菌液制備”項下的白色念珠菌試驗菌液10 IOOcfu，依據《中國藥典》2010年版附錄XI J白色念珠菌檢查法試驗；I. 4. 3. 2陽性對照組取沖洗液800ml/膜，IOOml/次過濾至剩余50ml沖洗液時，加入“菌液制備”項下的白色念珠菌試驗菌液10 IOOcfu，依據《中國藥典》2010年版附錄XI J白色念珠菌檢
查法試驗；
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I. 4. 3. 3陰性對照組取稀釋液IOml加入含50ml稀釋液的薄膜過濾器中過濾，用沖洗液800ml/膜， IOOml/次沖洗；依據《中國藥典》2010年版附錄XI J白色念珠菌檢查法試驗。硝酸咪康唑栓自身具有較強的抑菌性，且為難溶的脂溶性栓劑，這就增加了菌檢難度，本發(fā)明通過加入十四烷酸異丙酯的方法，不僅加速了脂水分層，縮短了實驗時間，而且流速平穩(wěn)，降低了檢驗成本，具有較強的可操作性。所加入的聚山梨酯80和十四烷酸異丙酯增強了樣品的破乳作用，抑菌作用也得到了消除，同時提高了樣品的分層速度。
具體實施例方式本發(fā)明的具體試驗過程如下I儀器與材料I. I 儀器隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱重慶四大實驗儀器廠生產型號WGP_600生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司生產型號LRH-250霉菌培養(yǎng)箱重慶萬達生產型號SHH-250JS生物安全柜上海力申科學儀器公司生產型號HF Safe 760sI. 2培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基批號090912北京三藥科技開發(fā)公司生產玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基批號0911172北京三藥科技開發(fā)公司生產營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基批號100310,北京三藥科技開發(fā)公司生產改良馬丁培養(yǎng)基批號0910203北京三藥科技開發(fā)公司生產改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基批號081126北京三藥科技開發(fā)公司生產膽鹽乳糖增基(BL)培養(yǎng)基批號100504北京三藥科技開發(fā)公司生產溴代十六烷基三甲胺瓊脂批號1008021北京三藥科技開發(fā)公司生產甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基批號1008021北京三藥科技開發(fā)公司生產液體沙氏培養(yǎng)基批號1008021北京三藥科技開發(fā)公司生產沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基批號1003021北京三藥科技開發(fā)公司生產I %聚山梨酯80-玉米粉瓊脂培養(yǎng)基批號20100811北京陸橋技術有限責任公司生產I. 3稀釋液含體積百分比濃度10%聚山梨酯80的pH7. O氯化鈉-蛋白胨緩沖液I. 4沖洗液含體積百分比濃度O. 1%聚山梨酯80的質量體積比濃度O. 1%蛋白胨水溶液2方法與結果2. I菌液制備接種枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，33±2°C培養(yǎng)24h;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，25±2°C培養(yǎng)48h ;上述培養(yǎng)物用質量體積百分比濃度O. 9 %無菌氯化鈉溶液制成每Iml含50 IOOcfu的菌懸液；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25±2°C培養(yǎng)7天加入3ml含體積百分比濃度O. 05% (ml/ml)的聚山梨酯80的質量體積百分比濃度O. 9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子用含體積百分比濃度O. 05% (ml/ml)的聚山梨酯80的質量體積百分比濃度O. 9%無菌氯化鈉溶液制成每Iml含 50 IOOcfu的菌懸液；2. 2供試品溶液制備稱取供試品10g，加入含體積百分比濃度10%聚山梨酯80的 PH7. O氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋液IOOml于45°C以下水浴振搖使溶解后，加入十四烷酸異丙酯20ml輕微振搖，靜置分層，取水層作為I : 10的供試液；表I十四烷酸異丙酯量化效果試驗
權利要求
1. 一種硝酸咪康唑栓的微生物限度檢查方法，其特征在于包括以下步驟1.1菌液制備接種枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，33±2°c培養(yǎng)24h ;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，25±2 °C培養(yǎng)48h ；上述培養(yǎng)物用質量體積百分比濃度O. 9 %無菌氯化鈉溶液制成每 Iml含50 IOOcfu的菌懸液；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上， 25 ± 2°C培養(yǎng)7天加入3ml含體積百分比濃度O. 05 % (ml/ml)的聚山梨酯80的質量體積百分比濃度O. 9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子用含體積百分比濃度O. 05% (ml/ ml)的聚山梨酯80的質量體積百分比濃度O. 9%無菌氯化鈉溶液制成每Iml含50 IOOcfu 的菌懸液；1. 2供試品溶液制備稱取供試品10g，加入含體積百分比濃度10%聚山梨酯80的pH7. O氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋液IOOml于45°C以下水浴振搖使溶解后，加入十四烷酸異丙酯20ml輕微振搖， 靜置分層，取水層作為I : 10的供試液；1. 3細菌、霉菌和酵母菌方法驗證 I. 3. I試驗組取I : 10供試液Iml加入含50ml體積百分比濃度0.1%聚山梨酯80的質量體積百分比濃度O. 1%蛋白胨水溶液為沖洗液的薄膜過濾器中，用沖洗液500ml/膜，IOOml/次沖洗；在最后一次沖洗液中加入50 IOOcfu “菌液制備”項下的菌懸液，過濾，取出濾膜貼于培養(yǎng)基上平行制備2皿，測定菌數(shù)；1.3.2菌液組取“菌液制備”項下的菌懸液lmL，按試驗組方法測定所加試驗菌數(shù)；1. 3. 3供試品對照組取I : 10供試液1ml，按試驗組方法，不加試驗菌，測定供試品的本底菌數(shù)；1. 3. 4稀釋劑對照組取體積比為5 I的稀釋液與十四烷酸異丙酯的混合液lml，按試驗組方法測定所加試驗菌數(shù)；1. 4控制菌檢查方法驗證 I. 4. I銅綠假單胞菌檢查 I. 4. I. I試驗組取“供試品溶液制備”項下供試液IOml和“菌液制備”項下的銅綠假單胞菌試驗菌液 10 IOOcfu，加入到膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基(BL) 200ml中，依據《中國藥典》2010年版附錄XI J銅綠假單胞菌檢查法試驗；1.4. I. 2陽性對照組取銅綠假單胞菌試驗菌液10 IOOcfu，加入到膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基(BL) 200ml中，依據《中國藥典》2010年版附錄XI J銅綠假單胞菌檢查法試驗；1.4. 1.3陰性對照組取稀釋液IOml加入到膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基(BL) 200ml中，依據《中國藥典》2010年版附錄XI J銅綠假單胞菌檢查法試驗；1.4. 2金黃色葡萄球菌檢查 I. 4. 2. I試驗組取“供試品溶液制備”項下供試液10ml，加入含50ml稀釋液的薄膜過濾器中過濾，用沖洗液500ml/膜，IOOml/次沖洗至剩余50ml沖洗液時，加入“菌液制備”項下的金黃色葡萄球菌試驗菌液10 IOOcfu，依據《中國藥典》2010年版附錄XI J金黃色葡萄球菌檢查法試驗；I. 4. 2. 2陽性對照組取沖洗液500ml/膜，IOOml/次過濾至剩余50ml沖洗液時，加入“菌液制備”項下的金黃色葡萄球菌試驗菌液10 IOOcfu，依據《中國藥典》2010年版附錄XI J金黃色葡萄球菌檢查法試驗；1.4. 2.3陰性對照組取稀釋液IOml加入含50ml稀釋液的薄膜過濾器中過濾，用沖洗液500ml/膜，IOOml/ 次沖洗；依據《中國藥典》2010年版附錄XI J金黃色葡萄球菌檢查法試驗；1.4.3白色念珠菌檢查 I. 4. 3. I試驗組取“供試品溶液制備”項下供試液10ml，加入含50ml稀釋液的薄膜過濾器中過濾，用沖洗液800ml/膜，IOOml/次沖洗至剩余50ml沖洗液時，加入“菌液制備”項下的白色念珠菌試驗菌液10 IOOcfu，依據《中國藥典》2010年版附錄XI J白色念珠菌檢查法試驗；I. 4. 3. 2陽性對照組取沖洗液800ml/膜，IOOml/次過濾至剩余50ml沖洗液時，加入“菌液制備”項下的白色念珠菌試驗菌液10 IOOcfu，依據《中國藥典》2010年版附錄XI J白色念珠菌檢查法試驗；I. 4. 3. 3陰性對照組取稀釋液IOml加入含50ml稀釋液的薄膜過濾器中過濾，用沖洗液800ml/膜，IOOml/ 次沖洗；依據《中國藥典》2010年版附錄XI J白色念珠菌檢查法試驗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種硝酸咪康唑栓的微生物限度檢查方法，以含質量體積百分比濃度為10％聚山梨酯80的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋液，在樣品溶解后加入十四烷酸異丙酯20ml，以含體積百分比濃度為0.1％聚山梨酯80的質量體積百分比濃度為0.1％蛋白胨水溶液為沖洗液，細菌、霉菌酵母菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌采用薄膜過濾法，五種菌株的回收率均高于70％；銅綠假單胞菌采用培養(yǎng)基稀釋法，結果檢出銅綠假單胞菌。本發(fā)明通過加入十四烷酸異丙酯的方法，不僅加速了脂水分層，縮短了實驗時間，而且流速平穩(wěn)，降低了檢驗成本，具有較強的可操作性。
文檔編號C12R1/685GK102586393SQ20121004420
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月24日 優(yōu)先權日2012年2月24日
發(fā)明者張丹, 李濤, 王嫦鶴 申請人:陜西省食品藥品檢驗所