專利名稱：一種來(lái)源于放線菌(Streptomyces rameus L2001)的耐熱木聚糖酶基因及其產(chǎn)物木聚糖 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種來(lái)源于放線菌(Streptomyces rameus L2001)的耐熱木聚糖酶的基因及其產(chǎn)物木聚糖酶XynA的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
木聚糖(xylan)主要是由五碳的D-卩比喃型木糖(xylopryanose)通過(guò)β-1,4_糖苷鍵以不同聚合度形成的不均一多糖，是植物半纖維素主要成分，是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的重要組成成分，占被子植物細(xì)胞壁干重的15% -30%,占裸子植物細(xì)胞壁干重的7% -12%，木 聚糖廣泛存在于植物根、莖、葉、花和果實(shí)中，占植物總的生物量的20%-40%，是自然界中僅次于纖維素的最豐富的可再生有機(jī)資源。木聚糖除了含有聚合度不同的木糖外，還同其它多糖以多種糖苷鍵共價(jià)交聯(lián)，同時(shí)還存在大量的支鏈取代基，完全降解需要一系列的酶協(xié)同作用，其中起主要作用的是β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶，以內(nèi)切的方式破壞木聚糖主鏈的糖苷鍵，釋放寡聚木糖和少量的木糖単體，其次需要β木糖苷酶，作用寡聚木糖的還原端，釋放木糖単體，另外還需要降解支鏈的 α -L-呋喃阿拉伯糖苷酶(a -L-arabinofuranoside, EC 3. 2. I. 55)，a -D-葡萄糖醒酸酶(α -D-glucuronidase,EC 3. 2. I. 139)，こ酸木聚糖酯酶(acetyl xylan esterase,EC
3.I. I. 72)和酹醒酸酯酶(phenolic acid esterase)(包括阿魏酸酯酶和p_香豆酸酯酶)等木聚糖酶的參與。木聚糖酶目前被報(bào)道廣泛存在于動(dòng)物植物中，包括真菌，細(xì)菌，藻類，甲殼動(dòng)物，蝸牛，藻類利陸生植物，其中絲狀真菌，細(xì)菌以及放線菌是主要的生產(chǎn)者，包括絲狀真菌的木霉屬(Trichoderma sp·),腐質(zhì)酶屬(Humicola sp·),鏈抱霉屬(Neurospora sp.),曲霉屬(Aspergillus sp·),祿抱屬(Fusarium sp·),青霉屬(Penicillium sp.)和膠霉屬(Gliocladium sp.)。細(xì)菌的放線菌包括 S. actuosus, S. cyaneus, S. halstedii,b.matensIs, b. 0丄Ivaceoviridis， b. roseisc丄eroticus， S. thermoviolaceus,b. viridosporus.木聚糖酶具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和前景，其主要在造紙，飼料和食品エ業(yè)得到廣泛應(yīng)用，在紡織、生物能源、化妝品、醫(yī)藥保健品等領(lǐng)域也有良好的應(yīng)用前景。在造紙エ業(yè)中，傳統(tǒng)的化學(xué)漂白法采用氯化物在堿性條件下去除木質(zhì)素，一方面產(chǎn)生大量的有毒利強(qiáng)致癌化合物，ニ是在后處理過(guò)程中又消耗大量的能源，木聚糖酶的應(yīng)用能夠增強(qiáng)漂白效果和減少后續(xù)氯化物的用量，實(shí)際使用不僅大大降低了環(huán)境污染，還改善了紙張的性能，提高了紙張的質(zhì)量。在分離自然的木聚糖酶的工作基礎(chǔ)上，研究人員也在通過(guò)生物工程和基因工程的方法對(duì)木聚糖酶進(jìn)行改造，試圖進(jìn)一步獲得更適合造紙エ業(yè)生產(chǎn)所用的木聚糖酶。在飼料エ業(yè)中，非反芻動(dòng)物消化道中由于缺少木聚糖酶等消化半纖維素酶，對(duì)飼料中豐富的半纖維素物質(zhì)無(wú)法利用，造成飼料利用效率低，動(dòng)物消化道疾病増加以及糞便污染環(huán)境等不良后果，在飼料中添加木聚糖酶等分解半纖維素的酶類，可以提高動(dòng)物對(duì)飼料的利用效率，減少動(dòng)物的腸道疾病，提高成活率，減少糞便污染。在食品エ業(yè)中，木糖的甜度是蔗糖的40%，在人體內(nèi)不會(huì)造成葡萄糖的水平升高，因此可以作為糖尿病患者和肥胖患者的甜味劑，此外，作為難發(fā)酵型糖，不容易造成齲齒，因此也是兒童食品的甜味劑，在面包生產(chǎn)上，添加木聚糖糖漿，可以改良面包色澤，増加香味，保持面包水分等效果，這些都是木聚糖酶在食品エ業(yè)中的應(yīng)用方向。在紡織エ業(yè)中，木聚糖酶在苧麻脫膠中起重要作用，作為優(yōu)良的紡織原料，苧麻在我國(guó)紡織產(chǎn)業(yè)中有一定的地位，在生產(chǎn)過(guò)程中，重要的一歩是脫膠，傳統(tǒng)方法采用高溫強(qiáng)酸強(qiáng)堿法，污染環(huán)境，且破壞纖維降低品質(zhì)，我國(guó)科研人員將木聚糖酶和果膠酶配合使用，創(chuàng)造出酶法脫膠法，改善了勞動(dòng)環(huán)境，提高了產(chǎn)品品質(zhì)，而且大大減輕了環(huán)境污 染。在能源エ業(yè)中，由于木聚糖是地球上僅次于纖維素的第二大可再生有機(jī)物，在生物質(zhì)能源的生產(chǎn)上具備了潛在應(yīng)用前景。在化妝品，木聚糖酶作用木聚糖，產(chǎn)生的寡聚合的木聚糖，具有很好的保水效果，可用于化妝品保持皮膚水分。在制備醫(yī)藥和保健品種行業(yè)中，木聚糖酶作用木聚糖產(chǎn)物単獨(dú)或者和其它寡聚糖(如果聚糖)混合服用，產(chǎn)生的寡聚合的木聚糖可以改善人體腸道的菌群平衡，有助于良性細(xì)菌的繁殖，改善人的消化功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從來(lái)源于放線菌(Streptomyces rameusL2001)的耐熱木聚糖酶獲得木聚糖酶基因多核苷序列如SEQIDN01所示CCATAGGACGCGCTCAGCGTCTCGGCGATCTCCTCGTCGGCCTGCGCCACGGTGCGGCGGATCGTACGGTGCCGAGCAAGGGCCTGTCGGCGGGGTCGCTCTCGMGGGGCAGCGCCGGACATGGCCGGGCCCGTAGGCCTCGAGTCCGGCCGTCGCCACGCGGCGCAGCTCCTGTGTCGTCGAAACATTCGAAACCCAGTGTGGGGACTTCGGCGTCTCCATGGAGTGTTCCGGGATGTTCCTAGAGGGATCTCCTCACTCATGCCGATTCATCAGCGGACACGTAGCGACGGTCGCGCTAGGACGCAGACGAATGTTTCGAAATATCGACCGAAAGTGTTGACAGATGACATGGCCAGGCCAACACTCCCCATCACGTCACACCCCACCCGTCGCACAAGGAGGAAGTACGACATGAATCCGCTCGACCATGCGACGAGCCGCAGGGCCGCCTGCGCGCTGCTGCTCGGCACCGCGGCCGGACTGGCCCTGCCCGGCACCGCCCGTGCCGCCACGGTCGTCACCACGAACCAGACCGGCACCGACAACGGCTTCTACTACTCGTTCTGGACCGACGCGCAGGGCACGGTCTCGATGACCCTGGGCTCCGGTGGCAACTACAGCACCAGCTGGCGCAACACCGGCAACTTCGTGGCCGGCAAGGGCTGGAGCACCGGCGCCCGCAGGAACGTGACCTACTCCGGCAGCTTCAACCCGTCCGGCAACGGCTACCTGTCGCTCTACGGCTGGACGTCGAACCCGCTCGTGGAGTACTACATCGTCGACAACTGGGGCACCTACCGGCCCACGGGGACGTACAAGGGCAGTGTCACCAGTGACGGCGGAACGTACGACATCTACCAGACGACGCGGTACAACGCCCCGTCCGTCGAGGGCACCAGGACCTTCAACCAGTACTGGAGCGTGCGGCAGTCGAAGCGCACCGGCGGCACCATCACCACCGGCAACCACTTCGACGCCTGGGCCCGCGCCGGGATGCCCCTCGGCAGCTTCGCGTACTACATGATCCTCGCGACCGAGGGGTACCAGAGCAGCGGCAACTCCAATATCACGGTGTCGTCGTGAGGACCGCACGACAGCTCGCGTTACGTCCGGCGGTGACCGCCGCCGTCGCCGCACCGGCCCTCGCCGCTACGCTCATCGTCGGAGCCGCCCCTCGCACGCGCACCCTTCCC本發(fā)明從來(lái)源于放線菌(Streptomyces rameus L2001)的耐熱木聚糖酶獲得木聚糖酶基因多肽序列如SEQ IDN02所示
MAGPVGLESGRRHAAQLLCRRNIRNPVWGLRRLHGVFRDVPRGISSLMPIHQRTRSDGRARTQTNVSKYRPKVLTDDMARPTLPITSHPTRRTRRKYDMNPLDHATSRRAACALLLGTAAGLALPGTARAATVVTTNQTGTDNGFYYSFWTDAQGTVSMTLGSGGNYSTSWRNTGNFVAGKGWSTGARRNVTYSGSFNPSGNGYLSLYGffTSNPLVEYYIVDNWGTYRPTGTYKGSVTSDGGTYDIYQTTRYNAPSVEGTRTFNQYWSVRQSKRTGGTITTGNHFDAWARAGMPLGSFAYYMILATEGYQSSGNSNITVSS本發(fā)明從來(lái)源于放線菌(Streptomyces rameusL2001)的耐熱木聚糖酶獲得木聚糖酶基因多肽序列如SEQ IDN03所示MNPLDHATSRRAACALLLGTAAGLALPGTARAATVVTTNQTGTDNGFYYS FffTDAQGTVSMTLGSGGNYSTSWRNTGNFVAGKGffSTGARRNVTYSGSFNPSGNGYLSLYGWTSNPLVEYYIVDNWGTYRPTGTYKGSVTSDGGTYDIYQTTRYNAPSVEGTRTFNQYWSVRQSKRTGGTITTGNHFDAWARAGM-PLGSFAYYMILATEGYQSSGNSNITVSS本發(fā)明從來(lái)源于放線菌(Streptomyces rameus L2001)的耐熱木聚糖酶獲得木聚糖酶基因信號(hào)多肽序列如SEQ ID N04所示MNPLDHATSRRAACALLLGTAAGLALPGTARA


圖I為枝鏈霉菌L2001基因組DNA電泳照片。圖2為圖2編碼木聚糖酶的保守序列。圖3Tail_PCR過(guò)程簡(jiǎn)略圖。其中Spl，Sp2為嵌套引物，根據(jù)核心序列設(shè)計(jì)的，LAD為兼并引物。圖4-1為5'端側(cè)翼序列擴(kuò)增電泳照片。泳道1、2、3為Sp5,與不同LAD引物之間的組合進(jìn)行的第三輪Tail-PCR擴(kuò)增結(jié)
果O圖4-2為:V端側(cè)翼序列擴(kuò)增電泳照片。泳道1、2、3為Sp3,與不同LAD引物之間的組合進(jìn)行的第三輪Tail-PCR擴(kuò)增結(jié)
果O圖5為轉(zhuǎn)基因木聚糖酶A酵母中木聚糖酶活性分析。圖6為大腸桿菌表達(dá)木聚糖酶A的SDS-PAGE蛋白電泳圖。I =Marker, 2-3 :含空載體大腸桿菌表達(dá)蛋白4_7 :含XylA表達(dá)載體的大腸桿菌表達(dá)蛋白。圖7為比赤酵母表達(dá)木聚糖酶A的SDS-PAGE蛋白電泳圖。I =Marker，2_5 :陽(yáng)性畢赤酵母pPIC9K-XylA表達(dá)蛋白。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明以下結(jié)合具體實(shí)例作進(jìn)ー步說(shuō)明，但并不是限制本發(fā)明。菌株大腸桿菌DH5 α和Transtetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金公司；畢赤酵母菌株GS115購(gòu)自invitrogen公司。載體T載體 pEASY-blunt simple 和 pEASY-simple Tl 購(gòu)自全式金公司；pET_28a (+)和pET_32a購(gòu)自Merk公司，畢赤酵母表達(dá)載體購(gòu)自pPIC9K Invitrogen公司。、
生化試劑rTaq,ExTaq, EcoRI, EcoRV, AvrII, XhoI 和 T41igase 等購(gòu)自 Takara 公司,KDO-plus購(gòu)自Toyobo公司。溶菌酶購(gòu)自Amresco公司。質(zhì)粒小量提取試劑盒,質(zhì)粒中量提取試劑盒，膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)miga公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。普通化學(xué)試劑氯仿，甲醇，こ醇，異丙醇，氯化鈉，鹽酸，冰醋酸等購(gòu)自北京化學(xué)試劑廠，β -巰基こ醇，Tris, SDS,山犁醇，甘油，DMSO,卡那霉素，氨卞青霉素，考馬斯亮藍(lán)，過(guò)硫酸銨，丙烯酰胺，雙丙烯酰胺等購(gòu)自Amresco公司。樺木木聚糖購(gòu)自Sigma公司。Tris-飽和酚，瓊脂粉購(gòu)自鼎國(guó)生物公司。瓊脂糖購(gòu)自西班牙Biowest公司。胰蛋白胨和酵母提取物購(gòu)自O(shè)xford公司。剛果紅，咪唑-鄰苯ニ甲酸氫鉀購(gòu)自天津市文達(dá)稀貴試劑化工廠。
引物擴(kuò)增木聚糖酶核心序列所用兼并引物正向引物Xyn-p I 序列5' -STBSTACTCSTTCTGGACSGA-3'反向引物Xyn-p2 序列5' -CCASGCGTCGAAGTGRTT-3'(注R = A/G, S = C/G, W = A/T, B = C/G/T, N = A/C/G/T)。T載體用測(cè)序引物M13+序列5' -GTTTTCCCAGTCACGAC-3'M13-序列5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3'全長(zhǎng)基因擴(kuò)增引物xynA-pI 5/ -CCATAGGACGCGCTCAG-3'xynA-p2 5/ -GGGAAGGGTG CGCGTG-3'Tail-PCR 所用引物上游擴(kuò)增引物sp5-l:5' -CGATTCATCAGCGGACACGTAGC-3'sp5-2 5/ -GATGTTCCTAGAGGGATCTCCTCACTCAT-3' sp5-3 5/ -GTCGAAACATTCGAAACCCAGTGTGG-3'下游擴(kuò)增引物sp3-l:5' -CCACACTGGGTTTCGAATGTTTCGAC-3'sp3-2 5/ -CATGAGTGAGGAGATCCCTCTAGGAACAT-3'sp3-3 5/ -GCTACGTGTCCGCTGATGAA TCG-3'大腸桿菌表達(dá)載體引物正向長(zhǎng)片段引物xynA-eLl :5' -CAGAATTCATGAATCCGCTCGACCATG-3'正向短片段引物xynA-eSl :5' -CAGAATTCACGGTCGTCACCACGAA-3'反向通用弓丨物xynA-eD 5' ~TACTCGAGTCACGACGACACCGTGA~3'畢赤酵母表達(dá)載體引物正向長(zhǎng)片段弓丨物xynA-yLl 5' -CAGAATTCATGAATCCGCTCGACCATG-3'正向短片段引物xynA-ySl :5' -CAGAATTCACGGTCGTCACCACGAA-3'反向通用弓丨物xynA-yD 5' -TACCTAGGTCACGACGACACCGTGA-3'基因組DNA的提取放線菌基因組總DNA提取使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)，方法略做改進(jìn)，裂解完全后的菌體，采用等體積的Tris-飽和酚/氯仿抽提2次，等體積的氯仿抽提一次再上拄，可以得到純凈和不容易降解的放線菌基因組總DNA(圖I)。
兼并引物的設(shè)計(jì)將來(lái)源于放線菌Streptomyces rameus發(fā)酵液并經(jīng)過(guò)純化后的木聚糖酶的純酶，進(jìn)行N末端蛋白序列測(cè)定，測(cè)得了此酶N端15個(gè)氨基酸序列ATVVTTNQTGTDNGF(Ala-Thr-Val-Val-Thr-Thr-Asn-Gln-Thr-Gly-Thr-Asp-Asn-Gly-Phe),用此 15 個(gè)氨基酸序列對(duì) NCBI的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST檢索，獲得相似度高的16條木聚糖酶的蛋白質(zhì)序列，將這些蛋白質(zhì)序列通過(guò)軟件DNAman進(jìn)行AUGMENT比對(duì)，分析得到該類木聚糖酶的保守序列區(qū)(圖2)，設(shè)計(jì)兼并引物Xyn-p I和Xyn-p2。PCR 擴(kuò)增 以提取的基因組DNA為模板，使用Toyobo公司的高保真擴(kuò)增酶KOD-plus，PCR擴(kuò)增條件為94°C變性3分鐘；94°C變性30秒，50°C退火30秒，68 °C延伸I分鐘，共10個(gè)循環(huán)；94°C變性30秒，54°C退火30秒，68°C延伸I分鐘，共20個(gè)循環(huán)；68°C延伸10分鐘。得到ー個(gè)約450bp DNA片段。T-載體連接將上述PCR產(chǎn)物片段通過(guò)1%瓊脂糖電泳，使用Omiga公司的膠回收試劑盒，并采用說(shuō)明書提供的步驟回收PCR片段，隨后將回收片段與T-載體pEASY-blunt simple (全式金公司)按說(shuō)明書連接PCR產(chǎn)物和T載體，按《分子克隆》方法熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株。DNA序列測(cè)定將上述轉(zhuǎn)化的后的陽(yáng)性DH5a克隆接種于Iml LB培養(yǎng)基，交上海生エ生物技術(shù)公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定，使用通用測(cè)序引物M13+和M13-，測(cè)序獲得如下序列GTGGTACTCGTTCTGGACCGACGCGCAGGGCACGGTCTCGATGACCCTGGGCTCCGGTGGCAACTACAGCACCAGCTGGCGCAACACCGGCAACTTCGTGGCCGGCAAGGGCTGGAGCACCGGCGCCCGCAGGAACGTGACCTACTCCGGCAGCTTCAACCCGTCCGGCAACGGCTACCTGTCGCTCTACGGCTGGACGTCGAACCCGCTCGTGGAGTACTACATCGTCGACAACTGGGGCACCTACCGGCCCACGGGGACGTACAAGGGCAGTGTCACCAGTGACGGCGGAACGTACGACATCTACCAGACGACGCGGTACAACGCCCCGTCCGTCGAGGGCACCAGGACCTTCAACCAGTACTGGAGCGTGCGGCAGTCGAAGCGCACCGGCGGCACCATCACCACCGGCAACCACTTCGACGCCTGGGTail-PCR引物的設(shè)計(jì)根據(jù)以上獲得的DNA序列，在此序列內(nèi)設(shè)計(jì)擴(kuò)增木聚糖酶基因上游和下游Tail-PCR用引物各三條擴(kuò)增方向?yàn)樯嫌畏较虻囊锓謩e命名為sp5-l，sp5_2和sp5_3，引物sp5-l在引物sp5-2外側(cè)，引物sp5-2在引物sp5-3外測(cè)；引物擴(kuò)增方向?yàn)橄掠畏较虻囊锓謩e命名為sp3-l，sp3-2和sp3-3，引物sp3_l在引物sp3_2外側(cè)，引物sp3_2在引物sp3-3外側(cè)(表)。引物sp3-3和引物sp5-3之間存在200個(gè)bp的重疊區(qū)(圖3)，保證Tail-PCR產(chǎn)物測(cè)序后，可以正確拼節(jié)出完整的基因序列。Tail-PCR Tail-PCR的方法參考劉耀光(文獻(xiàn))的方法；分別獲得基因上游方向PCR片段為500bp (圖4-1),下游方向?yàn)?00bp (圖4-2)。使的用擴(kuò)增酶為Takara公司的ExTaq酶。T-載體連接將基因上游和下游擴(kuò)增片段經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖電泳后，由Omiga公司的膠回收試劑盒回收PCR片段，然后同T載體pEASY-simple Tl (全式金公司)連接，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株。DNA序列測(cè)定將上述轉(zhuǎn)化的后的陽(yáng)性DH5A接種于Iml LB培養(yǎng)基，交上海生エ生物技術(shù)公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定，采用通用測(cè)序引物Μ13+和Μ13-。全長(zhǎng)基因PCR擴(kuò)增
根據(jù)測(cè)得基因上游和下游序列，由軟件DNAmanO進(jìn)行序列拼接，獲得全長(zhǎng)基因得DNA序列,根據(jù)獲得序列，設(shè)計(jì)引物xynA-pl和xynA_p2,采用全基因組DNA為模板,高保真擴(kuò)增酶KOD-plus，擴(kuò)增條件為94°C變性3分鐘；94°C變性30秒，50°C退火30秒，68°C延伸I分鐘，共10個(gè)循環(huán)；94°C變性30秒，54°C退火30秒，68°C延伸I分鐘，共20個(gè)循環(huán)；68°C延伸10分鐘。得到單ー約1200bp DNA片段。T-載體連接將上述PCR產(chǎn)物片段通過(guò)I %瓊脂糖電泳，采用Omiga公司的膠回收試劑盒并采用說(shuō)明書提供的步驟回收PCR片段，隨后將回收片段與T-載體pEASY-simple blunt (全式金公司)按說(shuō)明書連接PCR產(chǎn)物和T載體，按《分子克隆》方法熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株。DNA序列測(cè)定將上述轉(zhuǎn)化的后的陽(yáng)性DH5a接種于1ml LB培養(yǎng)基，交上海生エ生物技術(shù)公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定，采用通用測(cè)序引物M13+和M13-。經(jīng)DNAman分析得到ORF全長(zhǎng)為671個(gè)堿基或者966個(gè)堿基的XylA全長(zhǎng)蛋白質(zhì)編碼序列。通過(guò)對(duì)NCBI進(jìn)行blast序列比對(duì)，序列分析為木聚糖酶，可能編碼長(zhǎng)為234氨基酸和322氨基酸兩種多肽。pET28a(+)表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)基因序列可能編碼長(zhǎng)度不同的兩種多肽，分別設(shè)計(jì)基因正向引物xynA-eLl和xynA-eSl以及反向引物xynA_eD2，采用全基因組DNA為模板，高保真擴(kuò)增酶KOD-plus，擴(kuò)增條件為94°C變性3分鐘；94°C變性30秒，50°C退火30秒，68°C延伸I分鐘，共10個(gè)循環(huán)；94°C變性30秒，54°C退火30秒，68°C延伸I分鐘，共20個(gè)循環(huán)；68°C延伸10分鐘。得到ー個(gè)680bp DNA片和段ー個(gè)985bp (圖6) DNA片段。將上述PCR產(chǎn)物片段通過(guò)1%瓊脂糖電泳，采用Omiga公司的膠回收試劑盒并采用說(shuō)明書提供的步驟回收PCR片段，按實(shí)施例方法連接T載體，并按實(shí)施例進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)定結(jié)果完全正確的克隆用于表達(dá)載體的構(gòu)建。將正確T-載體菌株接種于5ml LB 37°C培基中陪養(yǎng)過(guò)夜，按Omiga試劑盒方法提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)過(guò)EcoRI和XhoI酶切，經(jīng)過(guò)OMIGA公司PCR純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物，將純化后產(chǎn)物于同樣經(jīng)過(guò)EcoRI和XhoI酶切并通過(guò)I %瓊脂糖電泳,采用Omiga公司的膠回收試劑盒的回收載體骨架連接，連接體系為IOOngPCR產(chǎn)物酶切片段，IOng pET28a(+)產(chǎn)物片段，Ιμ Τ4連接酶緩沖液，Ιμ T4DNA連接酶，補(bǔ)充無(wú)菌超純水至10 μ 1，連接條件為在16°C低溫連接過(guò)夜，按《分子克隆》方法熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株。轉(zhuǎn)化得到的陽(yáng)性克隆用于培養(yǎng)及木聚糖酶表達(dá)。酵母表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)基因序列可能編碼長(zhǎng)度不同的兩種多肽，分別設(shè)計(jì)基因正向引物xynA-yLl和xynA-ySl以及反向引物xynA_yD2,采用全基因組DNA為模板,高保真擴(kuò)增酶KOD-plus,擴(kuò)增條件為94°C變性3分鐘；94°C變性30秒，50°C退火30秒，68°C延伸I分鐘，共15個(gè)循環(huán)；94°C變性30秒，54°C退火30秒，68°C延伸I分鐘，共15個(gè)循環(huán)；68°C延伸10分鐘。得到ー個(gè)680bp DNA片和段ー個(gè)985bp (圖7) DNA片段。將上述PCR產(chǎn)物片段通過(guò)1%瓊脂糖電泳，采用Omiga公司的膠回收試劑盒并采用說(shuō)明書提供的步驟回收PCR片段，按實(shí)施例方法連接T載體，并按實(shí)施例進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)定結(jié)果完全正確的克隆用于表達(dá)載體的構(gòu)建。將正確T-載體菌株接種于5ml LB 37°C培基中陪養(yǎng)過(guò)夜，按OMGA試劑盒方法提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)過(guò)EcoRI和AvrII酶切，經(jīng)過(guò)Omiga公司PCR純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物，將純化后產(chǎn)物于同樣經(jīng)過(guò)EcoRI和AvrII酶切并通過(guò)I %瓊脂糖電泳,采用Omiga公司的膠回收試劑盒的回收載體骨架連接，連接體系為IOOngPCR產(chǎn)物酶切片段，IOng pPIC9K產(chǎn)物片段，I μ I T4連接酶緩沖液，I μ I T4DNA連接酶，補(bǔ)充無(wú)菌超純水至10 μ I，連接條件為在16°C低溫連接過(guò)夜，按《分子克隆》方法熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株。畢赤酵母電激轉(zhuǎn)化

將上述陽(yáng)性克隆接種于500ml的LB培養(yǎng)基過(guò)夜，收集菌體后按Omiga公司質(zhì)粒中型提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA經(jīng)過(guò)EcoRV酶切后，用Omiga公司膠回收試劑盒回收DNA片段，取至少2 μ g線性化的DNA電激轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌GSl 15，RD培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng)。畢赤酵母產(chǎn)木聚糖酶轉(zhuǎn)化子的篩選將RD培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接于MD培養(yǎng)基中，待轉(zhuǎn)化子純化后，接種于3ml BMGY液體培養(yǎng)基富集培養(yǎng)36h，再轉(zhuǎn)接入Iml BMMY液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)24h，4°C，5000rpm,離心5min，得到上清液。將5 μ I上清液點(diǎn)于含O. 5%的樺木木聚糖底物的篩選培養(yǎng)基中，50°C反應(yīng)30min，l%剛果紅染色20min，lM NaCl脫色20min。有透明圈現(xiàn)象的為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。木聚糖酶活性分析將上述陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于15ml BMGY液體培養(yǎng)基富集培養(yǎng)48h后，轉(zhuǎn)接入50mlBMMY液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)216h，每24h取樣1ml，同時(shí)補(bǔ)加ImL終濃度O. 5%的誘導(dǎo)劑甲醇。4°C，5000rpm,離心5min處理發(fā)酵液樣品，得到上清液，采用DNS法測(cè)定木聚糖酶活力。具體操作如下用O. 05M, pH值為5. 3的檸檬酸緩沖液稀釋上清液樣品，取100 μ I樣品加入至900 μ I 1%的樺木木聚糖底物中，于55°C反應(yīng)5min，加入Iml DNS反應(yīng)終止液，于沸水中顯色15min,加入Iml 40%的酒石酸鉀鈉溶液,于540nm下測(cè)定吸光度,計(jì)算得到木聚糖酶酶活。經(jīng)上述木聚糖酶酶活力測(cè)定方法，得到6個(gè)高產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化子，分別為1-76、3-59、6-28、6-63、7-111、9-3，酶活力分別為 403±3U/mL、464±9U/mL、447± 13U/mL、479± IOU/mL、768±35U/mL、473±10U/mL。(圖 5)木聚糖酶重組蛋白分析木聚糖酶基因XylA與載體pEASY-simple blunt連接轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α中，發(fā)酵液經(jīng)破壁后測(cè)定木聚糖酶活力為163U/mL，圖6為其SDS-PAGE電泳圖，由分析可知，木聚糖酶蛋白分子量為27KD。將木聚糖酶基因XylA與pPIC9K連接，誘導(dǎo)發(fā)酵196h。發(fā)酵液經(jīng)濃度為12. 5%的SDS-PAGE變性凝膠電泳處理，電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)染色液染色20min，再用IM NaCl洗脫液脫色至蛋白帶清晰，結(jié)果如圖7所示，木聚糖酶蛋白大小為38kDa。
權(quán)利要求
1.一種木聚糖酶的核苷酸序列，其序列細(xì)節(jié)為SEQ NOl0
2.這個(gè)序列的至少90%的同源。
3.ー種木聚糖酶的多肽，其序列細(xì)節(jié)為SEQ N02。
4.這個(gè)序列的至少90%的同源。
5.ー種木聚糖酶的多肽，其序列細(xì)節(jié)為SEQ N03。
6.這個(gè)序列的至少90%的同源。
7.一種木聚糖酶的信號(hào)肽，其序列細(xì)節(jié)為SEQ N04。
8.這個(gè)序列的至少90%的同源。
9.包含權(quán)利1，2，3，4，5，6，7，8的重組載體。
10.權(quán)利9的大腸桿菌的重組表達(dá)系統(tǒng)。
11.權(quán)利9的畢赤酵母的重組表達(dá)系統(tǒng)。
12.類似于權(quán)利10，11在乳酸桿菌，釀酒酵母，芽孢桿菌(如枯草芽孢桿菌)，曲霉(如黑曲霉或者米曲霉)中的表達(dá)應(yīng)用。
13.權(quán)利1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12在造紙エ業(yè)，食品加工，飼料エ業(yè)，紡織エ業(yè)，生物能源，化妝品，醫(yī)藥保健品，以及各種生物反應(yīng)器的應(yīng)用。
全文摘要
本基因公開了一種來(lái)源于放線菌(Streptomyces rameus L2001)的木聚糖酶Xyn A的基因，包括其核酸和蛋白質(zhì)/多肽序列。該基因編碼的木聚糖酶Xyn A的最適反應(yīng)pH值為5.3；50℃時(shí)pH值穩(wěn)定范圍是2.2～11.3，70℃時(shí)pH值穩(wěn)定范圍是4.3～6.7。該酶的最適反應(yīng)溫度為70℃；70℃時(shí)處理30min仍保留60％以上的酶活力。作為一種新的木聚糖酶，該酶及其作用產(chǎn)物具備在造紙工業(yè)，生物能源，食品加工，飼料工業(yè)，化妝品，醫(yī)藥，保健品，釀酒，農(nóng)作物生產(chǎn)，以及各類生物反應(yīng)器中的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/81GK102643842SQ201210045108
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月27日
發(fā)明者孫學(xué)輝, 李秀婷, 李金春, 楊然, 滕超, 路鐵剛 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京工商大學(xué)