專利名稱：一個核酸適配子篩選文庫的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本項發(fā)明屬生物分析與工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一個自行設(shè)計的用于核酸適配子篩選的隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫及其配套的引物。
背景技術(shù)：
核酸適配子(aptamer)是一種生物分子的人工單鏈核酸配體，通過SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技術(shù)從隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫中篩選獲得。核酸適配子與抗體的功能相似，可用于靶分子的識別，且敏感性和特異性可優(yōu)于抗體。在兩者的制備過程中，核酸適配子在靶標(biāo)方面有明顯的優(yōu)勢。篩選適配子的靶標(biāo)可以小到無機(jī)分子，大到完整的活細(xì)胞，甚至組織，而制備抗體的靶標(biāo)主要為蛋白質(zhì)，且必須具有免疫原性，還不能有毒。因而兩者所針對的靶分子范圍相差甚遠(yuǎn)。不僅如此，核酸適配子的制備過程本身也較抗體更簡單、不需要體內(nèi)過程、耗時更短、可人工合成。此夕卜，從核酸適配子與抗體之間理化性質(zhì)的差異也可看到核酸適配子的優(yōu)勢，如性質(zhì)穩(wěn)定、無免疫原性、分子量較小。因而核酸適配子的篩選與應(yīng)用已涉及醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域，包括基礎(chǔ)研究、臨床診斷、疾病治療和藥物研發(fā)等方面。SELEX技術(shù)是一種組合化學(xué)新技術(shù)，自1990年問世以來受到廣泛關(guān)注，發(fā)展迅速。它利用人工合成的大容量隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫與靶分子相互作用，從中篩選出能與靶分子特異結(jié)合的單鏈寡核苷酸，并借助PCR擴(kuò)增技術(shù)使之指數(shù)富集，最終獲得能與靶分子高特異性、高親和力結(jié)合的核酸適配子。核酸適配子的SELEX篩選的基本步驟如下設(shè)計并合成隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫及配套的引物；將靶標(biāo)與文庫共孵育，使文庫中能與靶標(biāo)特異性結(jié)合的寡核苷酸與靶標(biāo)形成復(fù)合物，分離后者并洗脫寡核苷酸；以洗脫的寡核苷酸作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制備出新的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫(亞文庫)，開始下一輪篩選；通過重復(fù)數(shù)輪篩選與擴(kuò)增，能與靶標(biāo)高特異性和高親和力結(jié)合的寡核苷酸留在文庫中并被指數(shù)富集；對最后一輪篩選后制備的文庫進(jìn)行克隆、測序，其中長度及兩端固定序列與文庫相符的寡核苷酸即為核酸適配子；測定各核酸適配子與靶標(biāo)結(jié)合的特異性和親和力，選出特異性強(qiáng)、親和力大的核酸適配子應(yīng)用于靶標(biāo)的檢測分析。核酸適配子篩選過程中所用文庫中的單鏈寡核苷酸兩端為固定序列，中間為隨機(jī)序列。固定序列為引物提供結(jié)合部位，便于SELEX篩選過程中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，富集特異性序列和制備下一輪篩選用的亞文庫。隨機(jī)序列是文庫中核酸序列多樣性的基礎(chǔ)，隨機(jī)區(qū)越長，多樣性越豐富。隨機(jī)區(qū)長度一般為30個核苷酸左右，此時文庫容量實際上能達(dá)到1014_15(理論上304 = I. 1518)，延長隨機(jī)區(qū)可增加文庫序列及其分子構(gòu)象的多樣性，但會明顯影響PCR擴(kuò)增時產(chǎn)物的特異性。另外，固定序列的長度則與文庫多樣性成反比，在總長度一定的情況下，縮短固定序列長度，則可延長隨機(jī)序列的長度，有利文庫有更好的多樣性。單鏈寡核苷酸的一個獨特表現(xiàn)是容易形成各種形狀的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾、口袋、假結(jié)、凸環(huán)、G-四聚體(G-quartet)等，通過分子構(gòu)象上“鎖鑰”匹配，加上氫鍵、范德華力等作用，可與靶分子形成穩(wěn)定的復(fù)合物。1014—15的巨大庫容所擁有的豐富的寡核苷酸分子構(gòu)象，被認(rèn)為可為自然界存在的幾乎所有分子找到構(gòu)象匹配的單鏈寡核苷酸配體(核酸適配子)。通過SELEX技術(shù)篩選靶標(biāo)的核酸適配子的原理和技術(shù)都不復(fù)雜，但要成功篩選到理想的核酸適配子卻并不簡單，其中隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫序列的設(shè)計是關(guān)鍵因素。在SELEX篩選的每一輪中，都要進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，以富集能與靶標(biāo)相對特異結(jié)合的單鏈寡核苷酸序列。一般而言，隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時有一個非常獨特的現(xiàn)象，就是隨著循環(huán)次數(shù)的增加，各種大小不一的非特異性產(chǎn)物迅速增多，而且目的條帶不斷減少，從而嚴(yán)重干擾亞文庫的制備，甚至導(dǎo)致篩選失敗。造成這一特殊現(xiàn)象的原因主要是文庫的隨機(jī)序列的存在，因文庫的序列多樣性達(dá)1014_15，單鏈寡核苷酸之間的部分堿基局部性相互配對難以避免，引物與某些寡核苷酸之間的錯配也難以消除。要減少寡核苷酸相互配對和引物錯配，理論上可以縮短隨機(jī)序列的長度。然而，從文庫中篩選能與靶分子構(gòu)象適配的單鏈寡核苷酸(核酸適配子)，其前提是文庫中的寡核苷酸序列分子構(gòu)象多樣性必須足夠，也就是說文庫的中間隨機(jī)序列必須足夠長，才有可能形成豐富分子構(gòu)象。因此，在核酸適配子篩選時的首要問題是設(shè)計一個隨機(jī)序列長度足夠的文庫，在這個前提下，改善文庫的PCR 擴(kuò)增特性，既能有效獲得目的產(chǎn)物，又能有效抑制非特異性產(chǎn)物形成，這是成功篩選到理想的核酸適配子的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的設(shè)計一個PCR擴(kuò)增效率高且非特異性產(chǎn)物少、多樣性豐富的核酸適配子篩選文庫，能有效應(yīng)用于核酸適配子的體外篩選。本發(fā)明的技術(shù)思路為了保證文庫的多樣性，設(shè)計盡可能短的固定序列和較長的隨機(jī)序列。根據(jù)文庫在PCR擴(kuò)增過程中的特殊性，設(shè)計獨特的固定序列(引物序列)，使文庫的PCR擴(kuò)增效率高且能有效抑制非特異產(chǎn)物形成。本發(fā)明采用PCR引物設(shè)計軟件分析和調(diào)整所擬定的文庫和引物的序列，消除能影響PCR擴(kuò)增的引物二聚體及發(fā)卡結(jié)構(gòu)，保證合理的能值。將設(shè)計好的文庫和引物人工合成后觀察其不同類型的PCR擴(kuò)增特性。將文庫應(yīng)用于肝癌細(xì)胞核酸適配子的篩選，驗證其實際應(yīng)用效果。本發(fā)明所述的核酸適配子篩選文庫的創(chuàng)建方法包括以下步驟。I、擬出文庫及引物的核苷酸序列自行擬出一個寡核苷酸文庫，兩端為19個核苷酸(一般為18 30個核苷酸)的固定序列、中間為40個核苷酸(一般為30個核苷酸)的隨機(jī)序列，上游引物與文庫5'端固定序列相同，下游引物與文庫3'端固定序列互補(bǔ)。固定區(qū)的核苷酸序列擬定時遵循下列原則G+C含量較高，上下游引物的GC含量相差不大，3'端不出現(xiàn)連續(xù)GGG或CCC及A。2、分析擬定的序列并進(jìn)行必要的調(diào)整使用PCR引物設(shè)計軟件分析所擬定的文庫和引物序列，并根據(jù)下列參數(shù)進(jìn)行序列調(diào)整引物的Tm值接近70°C (最鄰近法)；不存在具有實質(zhì)意義的引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成(能值不超過4. 5kcal/mol);引物3'端AG值較低(絕對值〈6. 5kcal/mol)，而Y端AG值較高(絕對值>9. 5kcal/mol )。將滿足上述嚴(yán)格條件的序列確定為最終的文庫和引物序列。3、文庫及引物的PCR擴(kuò)增特性分析根據(jù)最終確定的核苷酸序列人工合成文庫和引物，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，觀察文庫在PCR擴(kuò)增中的特性，并進(jìn)行必要的反應(yīng)條件優(yōu)化。4、文庫及引物的實際應(yīng)用效果驗證將文庫應(yīng)用于肝癌細(xì)胞的核酸適配子篩選，觀察是否能篩選出有應(yīng)用價值的肝癌細(xì)胞特異性核酸適配子。其中上述步驟中所述的PCR引物設(shè)計軟件為Oligo 6. 71，按軟件說明書進(jìn)行序列分析操作。其中上述步驟中所述的PCR擴(kuò)增包括對稱PCR、不對稱PCR和實時熒光定量PCR，文庫的PCR擴(kuò)增特性包括擴(kuò)增效率、非特異性產(chǎn)物情況，反應(yīng)條件的優(yōu)化包括最佳的PCR循環(huán)次數(shù)、退火溫度、不對稱PCR擴(kuò)增時的上下游引物比例等。其中上述步驟中所述的肝癌細(xì)胞為體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株H印G2，其核酸適配子的篩選方法采用細(xì)胞SELEX技術(shù)。通過上述步驟設(shè)計出的核酸適配子篩選文庫及其PCR擴(kuò)增引物，具有以下特定的核苷酸序列。
文庫序列5'-ACC GAC CGT GCT GGA CTC T (N40) ACT ATG AGC GAG CCT GGCG-3/。上游引物序列5'-ACC GAC CGT GCT GGA CTC T-3/。下游引物序列5'-CGC CAG GCT CGC TCA TAG Τ-3/。根據(jù)上述核酸適配子篩選文庫的序列，可通過人工合成或其他生物學(xué)技術(shù)，制備 端含19個特定核苷酸組成的固定序列ACC GAC CGT GCT GGA CTC T、中間含40個核
苷酸組成的隨機(jī)序列、3 ^端含19個特定核苷酸組成的固定序列ACT ATG AGC GAG CCTGGC G的隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫(包括ssDNA和RNA文庫)，用于任何靶標(biāo)的核酸適配子的篩選。根據(jù)上述核酸適配子篩選文庫的引物序列，可通過人工合成或其他生物學(xué)技術(shù)，制備序列為 5' -ACC GAC CGT GCT GGA CTC T-3'和5' -CGC CAG GCT CGC TCA TAG T-3'的引物對，采用PCR技術(shù)或其他生物技術(shù)擴(kuò)增文庫序列，應(yīng)用于核酸適配子的篩選以及核酸適配子的檢測、分析及應(yīng)用。以上述核酸適配子篩選文庫為基礎(chǔ)，可對文庫兩端的固定序列的個別核苷酸進(jìn)行替換、顛倒、移位，或?qū)ζ溟L度進(jìn)行小幅延長或縮短，或?qū)ξ膸熘虚g的隨機(jī)序列進(jìn)行延長或縮短，或?qū)U(kuò)增文庫的引物作相應(yīng)的簡單改造，然后制備簡單改造后的文庫和引物進(jìn)行核酸適配子的篩選、PCR擴(kuò)增和分析與應(yīng)用。以上述核酸適配子篩選文庫為基礎(chǔ)，可隨機(jī)改變文庫中間的隨機(jī)序列區(qū)的核苷酸組成，通過計算機(jī)軟件模擬寡核苷酸序列的二級結(jié)構(gòu)或三級結(jié)構(gòu)，設(shè)計出核酸適配子或改造從本文庫篩選出的核酸適配子。可利用上述任何一個原始或簡單改造后的文庫進(jìn)行核酸適配子的篩選、分析、改造和應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明設(shè)計出了一個性能優(yōu)秀的隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫。文庫具有接近長度下限的短固定序列和較長的隨機(jī)序列，充分保證了文庫中單鏈寡核苷酸的多樣性。文庫固定序列(引物序列)的獨特設(shè)計能使用高退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，既能有效獲得目的產(chǎn)物，又能有效抑制非特異性產(chǎn)物，在對稱PCR擴(kuò)增、不對稱PCR擴(kuò)增和實時熒光定量PCR擴(kuò)增中均得到證實。本文庫及引物應(yīng)用于肝癌細(xì)胞株H印G2的核酸適配子篩選獲得成功，進(jìn)一驗證了文庫的應(yīng)用價值。本發(fā)明設(shè)計出的隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫，性能優(yōu)秀，為成功篩選生物靶標(biāo)的核酸適配子提供了保證。


圖I為本文庫的對稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行12% (W/V)中性聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染色的結(jié)果圖。退火溫度60°C，第廣8泳道的循環(huán)次數(shù)依次為4、6、8、10、12、14、14、14，第7泳道為不加引物的陰性對照，第8泳道為不加文庫的陰性對照，M為20bp DNA Ladder。圖2為本文庫的對稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行12% (W/V)中性聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染色的結(jié)果圖。退火溫度72°C，第廣8泳道的循環(huán)次數(shù)分別為4、6、8、10、12、14、16、16，第8泳道為不加文庫的陰性對照，M為20bp DNA Ladder。圖3為本文庫的不對稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行12% (W/V)中性聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染色的結(jié)果圖。第I、泳道的上、下游引物比分別為I : 1、20 1,30 1,40 I、50 1、60 1、70 1、80 UlOO 1，第10泳道為陰性對照，循環(huán)次數(shù)均為20次，M為20bp DNA Ladder0 圖4為本文庫的不對稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行12% (W/V)中性聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染色的結(jié)果圖。第廣4泳道的上、下游引物比為20 1，循環(huán)次數(shù)依次為15、20、25、30，第5泳道為陰性對照，M為20bp DNA Ladder。圖5 圖7為本文庫實時熒光定量PCR的擴(kuò)增結(jié)果及其分析圖。其中，圖5為以倍比稀釋的梯度量文庫溶液為模板的實時擴(kuò)增曲線；圖6為以倍比稀釋的梯度量文庫溶液為模板的擴(kuò)增結(jié)果繪制的模板定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖7為以倍比稀釋的梯度量文庫溶液為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解度曲線。 圖8 圖17為以HepG2肝癌細(xì)胞為靶標(biāo)從本文庫中篩選出的10個核酸適配子的二級結(jié)構(gòu)模擬圖。10個核酸適配子依次命名為API、AP2、AP3、AP4、AP5、AP6、AP7、AP8、AP9、AP10。其中，圖8為API的二級結(jié)構(gòu)模擬圖；圖9為AP2的二級結(jié)構(gòu)模擬圖；圖10為AP3的二級結(jié)構(gòu)模擬圖；圖11為AP4的二級結(jié)構(gòu)模擬圖；圖12為AP5的二級結(jié)構(gòu)模擬圖；圖13為AP6的二級結(jié)構(gòu)模擬圖；圖14為AP7的二級結(jié)構(gòu)模擬圖；圖15為AP8的二級結(jié)構(gòu)模擬圖；圖16為AP9的二級結(jié)構(gòu)模擬圖；圖17為APlO的二級結(jié)構(gòu)模擬圖。圖18 圖25為熒光標(biāo)記的圖11 圖17命名的核酸適配子與H印G2肝癌細(xì)胞孵育后流式細(xì)胞儀分析圖。其中，圖18為HepG2肝癌細(xì)胞對照的流式細(xì)胞儀分析圖；圖19為Ap4與H印G2肝癌細(xì)胞孵育后流式細(xì)胞儀分析圖；圖20為Ap5與H印G2肝癌細(xì)胞孵育后流式細(xì)胞儀分析圖；圖21為Ap6與HepG2肝癌細(xì)胞孵育后流式細(xì)胞儀分析圖；圖22為Ap7與HepG2肝癌細(xì)胞孵育后流式細(xì)胞儀分析圖；圖23為Ap8與HepG2肝癌細(xì)胞孵育后流式細(xì)胞儀分析圖；圖24為Ap9與HepG2肝癌細(xì)胞孵育后流式細(xì)胞儀分析圖；圖25為AplO與H印G2肝癌細(xì)胞孵育后流式細(xì)胞儀分析圖。圖26 圖33為熒光標(biāo)記的圖11 圖17命名的核酸適配子與淋巴細(xì)胞孵育后流式細(xì)胞儀分析圖。其中，圖26為淋巴細(xì)胞對照的流式細(xì)胞儀分析圖；圖27為Ap4與淋巴細(xì)胞孵育后流式細(xì)胞儀分析圖；圖28為Ap5與淋巴細(xì)胞孵育后流式細(xì)胞儀分析圖；圖29為Ap6與淋巴細(xì)胞孵育后流式細(xì)胞儀分析圖；圖30為Ap7與淋巴細(xì)胞孵育后流式細(xì)胞儀分析圖；圖31為Ap8與淋巴細(xì)胞孵育后流式細(xì)胞儀分析圖；圖32為Ap9與淋巴細(xì)胞孵育后流式細(xì)胞儀分析圖；圖33為AplO與淋巴細(xì)胞孵育后流式細(xì)胞儀分析圖。
具體實施例方式以下通過本文庫及配套引物的設(shè)計、分析和應(yīng)用的具體過程，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。文庫的5'端序列與上游引物相同，3'端序列與下游引物互補(bǔ)。因此，文庫的設(shè)計可先確定好兩端固定序列和隨機(jī)序列的長度，然后根據(jù)兩端固定序列的長度擬定上、下游引物的序列，引物序列確定后文庫序列也就確定了。文庫兩端固定序列長些，有利于提聞引物的特異性，但不利于文庫的多樣性，因此本文庫以引物設(shè)計的最低要求為前提進(jìn)行設(shè)計，設(shè)定兩端文庫為19個核苷酸。文庫中間的隨機(jī)序列理論上30個核 苷酸即可達(dá)到1014_15，但為了獲得更好的多樣性，本文庫設(shè)定隨機(jī)序列為40個核苷酸，通過獨特的固定序列設(shè)計來降低因更長的隨機(jī)序列增加引物錯配和寡核苷酸之間雜交的可能性。I、上游引物最終確定的序列為 5' -ACC GAC CGT GCT GGA CTC T-3'。Oligo6. 71分析的主要數(shù)據(jù)如下長度為19-mer, GC%為63. 2%，Tm值為67. (TC ;5' Λ G較高，達(dá)-9.5 kcal/mol 以上，3' AG 較低，為-6.1 kcal/mol，總 AG(25°C )為-38. 2 kcal/mol ;沒有大于2bp的莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成；3'端沒有二聚體形成。2、下游引物最終確定的序列為 5' -CGC CAG GCT CGC TCA TAG T-3'。Oligo6. 71分析的主要數(shù)據(jù)如下長度為19-mer，GC%S 63. 2%，與上游引物相同，Tm值為68. 2V;5' AG 較高，達(dá)-11. 5 kcal/mol 以上，3' AG 較低，為-5. 8kcal/mol，總 AG(25 °C )為-39. 9 kcal/mol ;沒有大于2bp的莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成；3'端沒有二聚體形成。3、上下游引物聯(lián)合分析01igo 6. 71分析顯示，上下游引物之間存在2個能導(dǎo)致延伸的3 '端2bp或3bp匹配的引物二聚體，但能值低，分別-I. 6kcal/mol和-2. 9kcal/mol，對PCR反應(yīng)無實質(zhì)性影響，另一個引物二聚體不能引發(fā)延伸反應(yīng)。4、文庫序列最終確定的文庫序列為5' -ACC GAC CGT GCT GGA CTC T (N40) AGTATG AGC GAG CGT TGC G-3'。Oligo 6. 71分析顯示，文庫序列所形成的3個二聚體中，2個為3'端只有2bp匹配的二聚體,能值低，分別為-I. 3kcal/mol和-3. 6kcal/mol,另一個二聚體有3bp匹配，但離3'端較遠(yuǎn)，能值為-4.7kcal/mol，也不能引發(fā)延伸反應(yīng)。有3個連續(xù)堿基匹配的發(fā)卡結(jié)構(gòu)有4個，但最可能影響PCR反應(yīng)者其能值只有O. 5 kcal/mol, Tm值只有16°C，對文庫的PCR擴(kuò)增無實質(zhì)性影響。5、文庫的對稱PCR擴(kuò)增特性及條件優(yōu)化反應(yīng)總體積20 μ 1，含KPCR緩沖液，
I.25mM MgCl2,0. 145 mM dNTP，Taq DNA 聚合酶 O. 5U，上下游引物各 O. 625 μ M，文庫液 2 μ I(拷貝數(shù)109)，用滅菌注射用水定容至20 μ I。陰性對照以滅菌注射用水代替文庫液。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性3min，94°C變性40s，68°C退火延伸90s。退火溫度及循環(huán)次數(shù)依實驗?zāi)康亩?。最?2°C延伸7min。結(jié)果顯示，文庫在較低退火溫度時(60°C )，隨著循環(huán)次數(shù)增加，雜帶不斷增多(圖I )，而在高退火溫度時(72°C )，雜帶不隨循環(huán)次數(shù)增加而增多(圖2)。文庫具有良好的擴(kuò)增效率，在循環(huán)次數(shù)為4時目的條帶就很濃，目測達(dá)到最大量，引物被耗盡(圖1、2)，當(dāng)循環(huán)次數(shù)增加，低退火溫度條件下目的條帶不斷減少(圖I )，而高退火條件下目的條帶不減少但也不增加(圖2)。本文庫固定序列設(shè)計中有意將GC的百分比提聞到63%左右,籍此可以大幅度提聞退火溫度，既使對稱PCR擴(kuò)增中的非特異性產(chǎn)物能很好地被抑制，又能保持高擴(kuò)增效率，可以很好滿足SELEX篩選過程中制備文庫的雙鏈產(chǎn)物。6、文庫不對稱PCR擴(kuò)增特性及條件優(yōu)化反應(yīng)總體積20μ 1，含rPCR緩沖液，I. 25mM MgCl2,0. 145mM dNTP，Taq DNA 聚合酶 O. 5U，文庫液 2μ I (拷貝數(shù) 109)，上游引物濃度O. 625 μ Μ，下游引物根據(jù)實驗?zāi)康恼{(diào)整，滅菌注射用水定容至20 μ I。陰性對照以滅菌注射用水代替文庫液。
PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性3min，94°C變性40s，68°C退火及延伸90s，最后72°C延伸7min。循環(huán)次數(shù)據(jù)實驗?zāi)康亩?。結(jié)果顯示，不對稱PCR擴(kuò)增文庫隨上下游引物比增大，單、雙鏈產(chǎn)物不斷減少，20 I時產(chǎn)物量最多(圖3);不對稱PCR擴(kuò)增的效率低于對稱PCR擴(kuò)增，2(Γ25個循環(huán)時，單鏈產(chǎn)物才接近飽和狀態(tài)(圖4)。另外，本文庫不對稱PCR擴(kuò)增有良好的特異性，只有在高循環(huán)次數(shù)時才有非特異性產(chǎn)物形成，低于20個循環(huán)時無明顯雜帶。通過條件優(yōu)化，本文庫很容易通過不對稱PCR擴(kuò)增出單鏈產(chǎn)物，便于SELEX篩選過程中制備出滿意的亞文庫。7、文庫實時熒光定量PCR擴(kuò)增特性以梯度稀釋的文庫液為模板，觀察實時熒光定量PCR能否準(zhǔn)確定量文庫溶液。反應(yīng)總體積50 μ 1，其中含 2XEvaGreen qPCR Master Mix 25 μ 1，上、下游引物各lOpmol，文庫溶液5μ I (含倍比稀釋的單鏈寡核苷酸ΙΟ9、108、IO7UO6個拷貝)，加無菌去離子水定容至50 μ 1，無菌石蠟油20 μ I封閉反應(yīng)管。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性3min，94°C 40s、68°C 90s、20 次熱循環(huán)。結(jié)果顯示，以倍比稀釋的文庫液為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR，其CT值與模板濃度有良好的一致性(圖5)，能繪制出符合要求的標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)r=0. 9913 (圖6)，熔解度曲線顯示擴(kuò)增產(chǎn)物均一性好，無副產(chǎn)物形成(圖7)。表明以退火溫度68°C進(jìn)行實時熒光定量PCR，能穩(wěn)定、可靠地進(jìn)行模板定量，可用于SELEX篩選過程中所涉及的文庫定量。8、文庫的實際應(yīng)用效果通過篩選肝癌細(xì)胞株HepG2核酸適配子對文庫的實際應(yīng)用效果進(jìn)行考察。人工合成上述文庫和相應(yīng)的引物各2 0D，用杜氏磷酸鹽緩沖液(D-PBS)將文庫和引物配制成濃度為lOpmol/μ I的溶液備用。常規(guī)體外培養(yǎng)H印G2肝癌細(xì)胞，取I X IO6個肝癌細(xì)胞與文庫溶液4°C孵育lh，常規(guī)離心沉淀細(xì)胞，收集上清液備測。用D-PBS洗滌細(xì)胞沉淀2次后重懸細(xì)胞，95°C加熱IOmin洗脫與細(xì)胞結(jié)合的寡核苷酸并進(jìn)行不對稱PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行含7M尿素的8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，GelRed染色，切膠回收并純化單鏈DNA產(chǎn)物作為下一輪篩選的亞文庫。采用實時熒光定量PCR測定上清液和亞文庫的單鏈寡核苷核酸濃度。計算每輪篩選的結(jié)合率(結(jié)合率=上清液中核酸的測定量/投入反應(yīng)的文庫量X 100%)。重復(fù)進(jìn)行上述孵育、分離、洗脫、擴(kuò)增、純化過程，當(dāng)結(jié)合率連續(xù)兩輪不再升高時停止篩選。同時，隨篩選輪數(shù)增加，文庫與細(xì)胞的量比不斷增大，以增加篩選的嚴(yán)謹(jǐn)性。當(dāng)肝癌細(xì)胞篩選結(jié)束后，再以健康人外周血淋巴細(xì)胞為靶標(biāo)進(jìn)行2輪反向篩選(其過程與用肝癌細(xì)胞篩選相同，但回收純化并擴(kuò)增上清液中的核酸，棄去與淋巴細(xì)胞結(jié)合的核酸)。取反向篩選結(jié)束后所制備的亞文庫進(jìn)行對稱PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物送生物公司進(jìn)行克隆及測序。將測序結(jié)果與文庫的核酸序列進(jìn)行比對，其中長度和兩端固定序列與文庫相同、中間的隨機(jī)序列各異者確定為核酸適配子。以RNA Structure 4. 6軟件對各核酸適配子的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬分析。選取二級結(jié)構(gòu)各異的核酸適配子進(jìn)行人工合成，并5'端標(biāo)記異硫氰酸熒光素(FITC)，并分別與H印G2肝癌細(xì)胞及淋巴細(xì)胞進(jìn)行孵育，流式細(xì)胞儀測定陽性細(xì)胞率。結(jié)果顯示，經(jīng)過10輪篩選，文庫與!fepG2細(xì)胞的結(jié)合率由3. 46%上升為49. 13%，表明能與HepG2細(xì)胞結(jié)合的單鏈寡核苷酸得到較大程度的富集。對最后一輪篩選后所制備的亞文庫進(jìn)行克隆及測序，分離出10個核酸適配子，分別命名為Apf 10。二級結(jié)構(gòu)分析顯示Apf3、Ap7呈高度相似的大環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其余核酸適配子呈各不相同的二級結(jié)構(gòu)(圖8 圖17)。4個大環(huán)狀結(jié)構(gòu)的核酸適 配子中選取Ap7為代表與其他核酸適配子一起進(jìn)行后續(xù)分析。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，核酸適配子ΑρΓ Ο與HepG2肝癌細(xì)胞作用后陽性細(xì)胞率分別為 52. 21%,61. 90%,40. 01%,63. 19%,38. 60%,61. 64% 和 47. 19%(圖 18 圖 25)，是淋巴細(xì)胞陽性率的4. 15,4. 82,4. 05,15. 08,10. 00,13. 70和2. 22倍(圖26 圖33)。上述結(jié)果顯示，使用本文庫成功篩選出肝癌細(xì)胞的核酸適配子。
權(quán)利要求
1.一個核酸適配子篩選文庫，其特征在于文庫及其PCR擴(kuò)增引物具有特定的核苷酸序列 文庫序列:5' -ACC GAC CGT GCT GGA CTC T(MO)ACT ATG AGC GAG CCT GGC G-3' 上游引物序列:5' -ACC GAC CGT GCT GGA CTC T-3' 下游引物序列5' -CGC CAG GCT CGC TCA TAG T-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸適配子篩選文庫，其特征在于通過人工合成或其他生物學(xué)技術(shù)，制備5'端含19個特定核苷酸組成的固定序列ACC GAC CGT GCT GGA CTC T、中間含40個核苷酸組成的隨機(jī)序列、3'端含19個特定核苷酸組成的固定序列ACT ATGAGC GAG CCT GGC G的隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫，用于任何靶標(biāo)的核酸適配子的篩選。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸適配子篩選文庫，其特征在于通過人工合成或其他生 物學(xué)技術(shù)，制備序列為 5' -ACC GAC CGT GCT GGA CTC T-3'和 5' -CGC CAG GCT CGC TCATAG T-3'的引物對，使用PCR技術(shù)或其他生物技術(shù)擴(kuò)增文庫序列，應(yīng)用于核酸適配子的篩選以及適配子的檢測、分析及應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸適配子篩選文庫，其特征在于對文庫兩端的固定序列的個別核苷酸進(jìn)行替換、顛倒、移位，或?qū)ζ溟L度進(jìn)行小幅延長或縮短，或?qū)ξ膸熘虚g的隨機(jī)序列進(jìn)行延長或縮短，或?qū)U(kuò)增文庫的引物作相應(yīng)的簡單改造，然后制備簡單改造后的文庫和引物進(jìn)行適配子篩選、PCR擴(kuò)增和適配子分析與應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸適配子篩選文庫，其特征在于隨機(jī)改變文庫中間的隨機(jī)序列區(qū)，通過計算機(jī)軟件模擬寡核苷酸序列的二級結(jié)構(gòu)或三級結(jié)構(gòu)，設(shè)計出適配子或改造從本文庫篩選出的適配子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的核酸適配子篩選文庫，其特征在所述的核酸適配子篩選文庫為ssDNA文庫或RNA文庫。
7.利用權(quán)利要求f5項中所述的任何一項進(jìn)行適配子的篩選、分析、改造和應(yīng)用。
全文摘要
一個核酸適配子篩選文庫，屬生物分析與生物工程技術(shù)領(lǐng)域。具有以下特定的核苷酸序列文庫為5′-ACCGACCGTGCTGGACTCT(N40)ACTATGAGCGAGCCTGGCG-3′；上游引物為5′-ACCGACCGTGCTGGACTCT-3′；下游引物為5′-CGCCAGGCTCGCTCATAGT-3′。本文庫具有接近長度下限的短固定序列和較長的隨機(jī)序列，充分保證了文庫中單鏈寡核苷酸的多樣性；文庫固定序列(引物序列)的獨特設(shè)計能使用高退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，既能有效抑制非特異性產(chǎn)物，又不影響擴(kuò)增目的產(chǎn)物，在對稱PCR擴(kuò)增、不對稱PCR擴(kuò)增和實時熒光定量PCR擴(kuò)增中均得到證實。本發(fā)明設(shè)計出的隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫，性能優(yōu)秀，為成功篩選生物靶標(biāo)的核酸適配子提供了保證。
文檔編號C12N15/10GK102732972SQ201210045270
公開日2012年10月17日 申請日期2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月27日
發(fā)明者呂農(nóng)華, 張吉翔, 張慧卿, 張焜和, 張貝, 方念, 譚新穎, 鄔芳玉 申請人:南昌大學(xué)