專利名稱：雙歧桿菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雙歧桿菌原生質(zhì)體制備及再生的優(yōu)化條件，利用PEG融合轉(zhuǎn)化外源基因或載體，尤其涉及雙歧桿菌在基因工程中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雙歧桿菌(Pifidobacteria)是人體重要的腸道益生菌之一，對(duì)人體健康起重要作用，可制備成治療性藥物和功能食品。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)含雙 歧桿菌活菌的制劑及食品發(fā)展迅速，雙歧桿菌產(chǎn)品已投入市場(chǎng)。在國(guó)外，含雙歧桿菌的食品也十分流行，特別是在日本、歐洲和北美。然而，由于雙歧桿菌的細(xì)胞壁較厚，導(dǎo)致了雙歧桿菌的基因操作非常困難，并限制了其在功能食品和藥物中的應(yīng)用。制備雙歧桿菌的原生質(zhì)體可以解除遺傳物質(zhì)交流的最大屏障細(xì)胞壁，它可直接接受外源DNA、質(zhì)粒、病毒后表達(dá)外源基因，提高轉(zhuǎn)化效率。1990，Ishii等人首次用蛋白酶K，α-淀粉酶，溶菌酶等制備了雙歧桿菌的原生質(zhì)體，其回復(fù)率達(dá)到了 10%。1992，Kot用溶菌酶和蛋白酶聯(lián)合酶解得到嗜熱雙岐桿菌原生質(zhì)體，但是未成功回復(fù)。2004年張莉滟等人利用變?nèi)芫貙?duì)雙歧桿菌原生質(zhì)體的制備進(jìn)行了研究，雖然其生成率達(dá)到90 %，然而并未研究其回復(fù)及轉(zhuǎn)化。原生質(zhì)體技術(shù)的關(guān)鍵是細(xì)胞壁的消化，以形成大量原生質(zhì)體,并使原生質(zhì)體能高頻率的再生細(xì)胞壁，恢復(fù)到正常細(xì)胞狀態(tài)。雙歧桿菌是嚴(yán)格厭氧的細(xì)菌，如果處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，即使其原生質(zhì)體的生成率再高，也會(huì)因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間處于有氧的條件下而死亡，導(dǎo)致不能再生。迄今為止，還沒(méi)有雙歧桿菌原生質(zhì)體的回復(fù)率和轉(zhuǎn)化率方面的研究。由于雙歧桿菌的特殊細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，目前雙歧桿菌的轉(zhuǎn)化研究很少。1994，Missich等人首次構(gòu)建了大腸桿菌-雙歧桿菌的穿梭載體，實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)雙歧桿菌的電擊轉(zhuǎn)化。之后Argnani, Rossi和kim等人分別嘗試改進(jìn)了雙歧桿菌的電擊轉(zhuǎn)化條件,但是其電擊轉(zhuǎn)化的效率依然非常低，最高 7· 5X 102CFU/Pg DNA0 聚こニ醇(polyethylene glycol, PEG)有不同聚合度產(chǎn)物，相對(duì)分子質(zhì)量為100(Γ6000的PEG均可用作促融劑。PEG可以使原生質(zhì)體的膜電位降低，原生質(zhì)通過(guò)鈣離子交聯(lián)促進(jìn)凝聚。另外，由于PEG的脫水作用，擾亂了分散在原生質(zhì)膜表面的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的排列，提高了脂質(zhì)顆粒的流動(dòng)性，使DNA分子容易在細(xì)胞表面吸附，提高細(xì)胞對(duì)DNA分子的攝入。目前，還沒(méi)有應(yīng)用PEG轉(zhuǎn)化雙歧桿菌的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之ー是提供ー種雙歧桿菌原生質(zhì)體的制備方法，該方法步驟簡(jiǎn)單，具有較高的生成率，并且，通過(guò)該方法制備的原生質(zhì)體通過(guò)進(jìn)一歩的操作，可具有較高的再生率。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下
ー種雙歧桿菌原生質(zhì)體的制備方法，包括以下步驟(1)將雙歧桿菌接種到MRS瓊脂培養(yǎng)基上，厭氧培養(yǎng)；
(2)從MRS瓊脂培養(yǎng)基上挑單菌落，接種于MRS液體培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)；
(3)將上述培養(yǎng)后的MRS液體培養(yǎng)基以2.5-3. 5% (v/v)的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中，36— 38で，厭氧培養(yǎng)18-20 h;離心收集菌體，用SMM溶液重懸；
(4)加變?nèi)芫刂两K濃度為4.5—5. 5 mg/L，36-38°C酶解，酶解時(shí)間為25 — 35分鐘；酶解結(jié)束后重懸于SMM溶液中，得到雙歧桿菌原生質(zhì)體。優(yōu)選地，所述SMM溶液為含有O. 015 — O. 25 M/L4-羥こ基哌嗪こ磺酸、O. 9 — I. ImM/L氯化鎂、O. 45 一 O. 55 M/L棉子糖的水溶液。優(yōu)選地，步驟(I)和步驟(2)中厭氧培養(yǎng)的溫度分別為36_38°C，時(shí)間分別為22_26h0
優(yōu)選地，步驟(3)中將上述培養(yǎng)后的MRS液體培養(yǎng)基以3% (v/v)的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中，37で，厭氧培養(yǎng)19 h;離心收集菌體，用SMM溶液重懸；步驟(4)中加變?nèi)芫刂两K濃度為5 mg/L，37°C酶解，酶解時(shí)間為30分鐘；酶解結(jié)束后重懸于SMM溶液中，得到雙歧桿菌原生質(zhì)體。本發(fā)明的另ー目的是提供ー種雙歧桿菌原生質(zhì)體的再生方法。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下
ー種雙歧桿菌原生質(zhì)體的再生方法，包括以下步驟，
(O用預(yù)冷的SMM將上述制備的雙歧桿菌原生質(zhì)體充分重懸,將原生質(zhì)體懸液涂布于雙層再生培養(yǎng)基上，36-38で培養(yǎng)23 — 25 h。本發(fā)明的另ー目的是提供ー種雙歧桿菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化方法。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下
ー種雙歧桿菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟
(1)構(gòu)建穿梭表達(dá)載體；
(2)在上述制備到的雙歧桿菌的原生質(zhì)體中加入冰預(yù)冷的穿梭表達(dá)載體；
(3)加入40 - 45 °C預(yù)熱的 38 — 42% 的 PEG6000 溶液，40 — 45°C融合 8 — 12 min ；立即加入SMMP溶液洗滌2遍，所述SMMP溶液為液體再生培養(yǎng)基與SMM溶液體積比為2 —4:1的混合溶液；
(4)再加入SMMP復(fù)蘇O.8 — I. 2小時(shí)；復(fù)蘇之后將菌液涂布在氨芐青霉素抗性的固體再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3天，得到轉(zhuǎn)化后平板上的雙歧桿菌菌落。優(yōu)選地，該轉(zhuǎn)化方法中所述SMMP溶液為液體再生培養(yǎng)基與SMM溶液體積比為3:1的混合溶液。步驟(4)中，所述固體再生培養(yǎng)基中的氨芐青霉素的濃度為24 — 26Pg/mL。步驟(3)加入42で預(yù)熱的濃度為40%的PEG6000溶液，42°C融合10 min ;立即加入SMMP溶液洗滌2遍。本發(fā)明提供了ー種雙歧桿菌原生質(zhì)體的制備、再生和轉(zhuǎn)化的方法，利用變?nèi)芫靥幚黼p歧桿菌，并優(yōu)化了雙歧桿菌原生質(zhì)體的制備和再生的條件，在此基礎(chǔ)上，利用PEG促融的作用原理，優(yōu)化出轉(zhuǎn)化效率較高的雙歧桿菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明所述的雙歧桿菌原生質(zhì)體的制備、再生和轉(zhuǎn)化,具有原生質(zhì)體的生成率高(達(dá)到81 %以上)，再生率高(48%以上)、可成功導(dǎo)入外源基因的等特點(diǎn)。本發(fā)明所述的雙歧桿菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立，實(shí)現(xiàn)了穿梭表達(dá)載體的融合轉(zhuǎn)化，提高了雙歧桿菌轉(zhuǎn)化的成功率，轉(zhuǎn)化效率為2. 3 X IO3CFU^g DNA。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明制備的雙歧桿菌原生質(zhì)體，可高頻率的再生細(xì)胞壁，即較高的生成率和再生率,并提高了外源DNA導(dǎo)入的成功率，從而建立了雙歧桿菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。本發(fā)明為雙歧桿菌基因操作奠定了基礎(chǔ)。


圖I為不冋培養(yǎng)時(shí)期制備雙歧桿囷原生質(zhì)體結(jié)果；
圖2為酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體形成的影響結(jié)果；
圖3為變?nèi)芫孛笣舛葘?duì)原生質(zhì)體形成的影響結(jié)果；
圖4為酶作用時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成的影響結(jié)果；
圖5為滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)制備原生質(zhì)體的影響結(jié)果；
圖6為原生質(zhì)體形成的過(guò)程 圖7為pBEX轉(zhuǎn)化后平板上的雙歧桿菌；
圖8為PCR篩選pBEX陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，其中，I :雙歧桿菌空對(duì)照組；2 :雙歧桿菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，目的條帶為IOOObp左右的復(fù)制子片段；3 :陰性空白對(duì)照；M :wide range marker500-15000 bp ；
圖9為pBEX陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒提取及酶切驗(yàn)證；
圖10為pDG-Hup轉(zhuǎn)化后平板上的雙歧桿菌；
圖11為菌落PCR篩選pDG-Hup陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，其中，1，2，3 :雙歧桿菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，目的條帶為340bp左右的啟動(dòng)子片段；M DL2000 ；
圖12為pDG-Hup陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒提取及酶切驗(yàn)證；其中，I: λ HindIII，2:pDG7雙酶切(BamHI Sal I)，3 :pDG_Hup 雙酶切(BamHI Sal I)，4:DL2000.
圖13合成的啟動(dòng)子序列(共283 bp) (SEQ ID. NO. 5)
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :雙歧桿菌原生質(zhì)體的制備和再生
I.原生質(zhì)體的制備
將長(zhǎng)雙桿菌NCC2705從-70 °C保藏的甘油管轉(zhuǎn)接到常規(guī)的MRS瓊脂培養(yǎng)基上(MRS瓊脂培養(yǎng)基蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，Tween-80 I g，K2HPO4 2 g，CH3COONa · 3H20 5 g,枸櫞酸三銨 2 g, MgSO4. 7H20 0. 2 g, MnSO4.H2O 0. 05 g，瓊脂 15 g,葡萄糖20 g,加蒸懼水至1000 mL,調(diào)pH 6.2- 6.4,121 °C高壓滅菌15 min),37°C厭氧培養(yǎng)24 h。從平板上挑ー單菌落，接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基(MRS液體培養(yǎng)基成分同上不加瓊脂)中，37で厭氧培養(yǎng)24 h;以3% (v/v)(原培養(yǎng)菌懸液體積新鮮培養(yǎng)基體積)的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的25 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37で，厭氧培養(yǎng)19 h;離心收集菌體，用10mL SMM (Hepes (4-羥こ基哌嗪こ磺酸)O. 02 M/L、氯化鎂I mM/L、棉子糖O. 5 M/L)重懸；加變?nèi)芫刂两K濃度為5mg/L，37°C酶解，每隔5 min取一次樣，鏡檢觀察原生質(zhì)體形成情況，酶解時(shí)間為30分鐘；酶解結(jié)束，加入10 mL SMM洗滌一次后重懸于SMM中備用。2.原生質(zhì)體的再生
用冰預(yù)冷的SMM將原生質(zhì)體充分重懸，取200 μ L原生質(zhì)體懸液涂布于雙歧桿菌常用的雙層再生培養(yǎng)基平板(常規(guī)的再生固體培養(yǎng)基胰胨5.0 g，酵母提取物5.0 g，半胱胺酸鹽酸鹽 O. 4 g,葡萄糖 5. O g, KH2PO4 2. 5 g, CH3COONa 10. O g, CaCl2 · 2H20 5. O g,MgCl2 · 6H20 5. O g，agar 15. 0 g，棉子糖 0.2 -0.3M/L，調(diào) pH 6.5，115 °C 高壓滅菌 20 min。再生半固體培養(yǎng)基配制方法同再生固體培養(yǎng)基，但瓊脂成分僅含0.6%。液體再生培養(yǎng)基配制方法同再生固體培養(yǎng)基，但不含瓊脂成份。雙層再生培養(yǎng)基先將再生固體培養(yǎng)基傾入平皿作為底層，再將再生半固體培養(yǎng)基成分傾入底層上即可)，37で培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。同時(shí)取等量蒸餾水稀釋原生質(zhì)體作對(duì)照，以消除因菌體殘片形成菌落所產(chǎn)生的誤差。再生率計(jì)算公式為原生質(zhì)體的再生率(％) =(C-B)/(A-B) X 100% C :再生菌落數(shù)，即酶解混合液經(jīng)高滲溶液稀釋后涂布雙層再生培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)。本發(fā)明雙歧桿菌原生質(zhì)體在制備過(guò)程中，按照上述制備方法，考察了菌體生長(zhǎng)期、變?nèi)芫貪舛取⒚附鈺r(shí)長(zhǎng)、酶解溫度、滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體形成及再生的影響(即其它參數(shù)不變，然后分別變動(dòng)菌體生長(zhǎng)期、變?nèi)芫貪舛取⒚附鈺r(shí)長(zhǎng)、酶解溫度、滲透壓穩(wěn)定劑參數(shù))。原生質(zhì)體形成率的測(cè)定將酶處理前的細(xì)胞和酶處理后的原生質(zhì)體分別用無(wú)菌蒸餾水作適當(dāng)稀釋，然后分別涂布在固體MRS平板上。于37で培養(yǎng)48 h，計(jì)算各自的菌落數(shù)，再計(jì)算原生質(zhì)體形成率原生質(zhì)體形成率(％) = (A-B)/AX 100%其中A :總菌落數(shù)，即未經(jīng)變?nèi)芫靥幚淼木鷳乙和坎加贛RS固體平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)；B :未原生質(zhì)體化的細(xì)胞數(shù)，即酶解混合液經(jīng)蒸餾水稀釋后涂布于MRS固體平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)。3.圖I表明了菌體生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)雙歧桿菌原生質(zhì)體制備的影響分別取對(duì)數(shù)前、中、后、穩(wěn)定期各時(shí)間段的菌體制備原生質(zhì)體，研究菌體生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)原生質(zhì)體形成的影響，結(jié)果如圖I所示。對(duì)數(shù)后期即傳代培養(yǎng)19 h的菌體處理后可使原生質(zhì)體生成率達(dá)到80%，再生率達(dá)到46%。因此以下實(shí)驗(yàn)中，均選擇在此條件下培養(yǎng)19 h的長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2705菌液進(jìn)行原生質(zhì)體制備。4.圖2表明原生質(zhì)體化時(shí)溫度對(duì)反應(yīng)有極大影響。分別以35°C、37°C、40°C、42°C四個(gè)溫度梯度，5 Pg/mL酶解30 min進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。在35 40で溫度范圍內(nèi)，原生質(zhì)體生成量隨溫度升高而升高，在37 °C下酶解30 min，原生質(zhì)體生成率達(dá)到87 %，再生率49 %。因此本發(fā)明確定37で為長(zhǎng)雙歧桿菌制備原生質(zhì)體的最佳酶解溫度。5.圖3表明變?nèi)芫孛笣舛葘?duì)原生質(zhì)體形成的影響。收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)前期19 h的菌體，用 SMM 重懸,分別以 I Pg/mL、2. 5 Pg/mL、5 Pg/mL、7. 5 Pg/mL、10 Kg/mL 五個(gè)不同濃度酶在37で下酶解30 min。結(jié)果如圖3所示，當(dāng)變?nèi)芫氐臐舛葹? Pg/mL時(shí)，原生質(zhì)體生成率達(dá)到84%，再生率達(dá)到46%。6.圖4表明酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成的影響。收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)前期19 h的菌體，用SMM重懸，在5 Pg/mL變?nèi)芫孛?7°C酶解，原生質(zhì)體形成率如圖4所示。原生質(zhì)體形成率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，酶解30 min時(shí)，原生質(zhì)體形成率達(dá)到81 %，再生率達(dá)到49% ;延長(zhǎng)酶解時(shí)間，原生質(zhì)體形成率增加不大，再生率大大降低。繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，原生質(zhì)體形成率未繼續(xù)增加，再生率繼續(xù)降低。主要原因可能是酶繼續(xù)作用于膜系統(tǒng)使膜破裂所致，導(dǎo)致菌體死亡所致。7.圖5表明滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體形成的影響。收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)前期19 h的菌體，分別用原生質(zhì)體穩(wěn)定液SMM，0. 5M/L的山梨醇，O. 5M/L蔗糖，O. 5M/L甘露醇重懸，在5 Pg/mL變?nèi)芫孛?7で酶解30 min，原生質(zhì)體形成情況如圖5所示。圖5可以看出，滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)于原生質(zhì)體的生成率沒(méi)有明顯的影響，然而SMM作為緩沖液時(shí)再生率最高，可達(dá)48 %。
8.圖6表明原生質(zhì)體的形成過(guò)程。按照優(yōu)化條件制備長(zhǎng)雙歧桿菌的原生質(zhì)體，并在100倍光學(xué)顯微鏡下，觀察。(圖A)長(zhǎng)雙歧桿菌在酶解初始階段，部分菌體縮短，部分菌體的細(xì)胞壁分離剝離，釋放出少量由細(xì)胞膜包住的類似球狀的細(xì)胞，即為原生質(zhì)體(圖B)。最終酶解結(jié)束時(shí)，視野中只剩下很少的桿狀菌體，大量原生質(zhì)體形成(圖C)。
實(shí)施例2 :雙歧桿菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化與驗(yàn)證
I、雙歧桿菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化
O穿梭表達(dá)載體PBEX由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，具體構(gòu)建方法參照馬永平的專利(
發(fā)明者萬(wàn)翠香, 魏華, 夏慧玲, 章昭琳, 熊勇華, 許恒毅, 徐鋒, 賴衛(wèi)華, 王報(bào)貴 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)