專利名稱：一種多步連環(huán)選擇的血清核酸適配子體外篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本項(xiàng)發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種將多步連環(huán)選擇應(yīng)用于核酸適配子篩選和鑒定過(guò)程中的高效率血清核酸適配子體外篩選新技術(shù)。
背景技術(shù)：
核酸適配子是一種生物分子的人工單鏈核酸配體，通過(guò)SELEX (SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment)技術(shù)從隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫(kù)中篩
選獲得。核酸適配子篩選所用文庫(kù)為人工構(gòu)建，其中的單鏈寡核苷酸片段的兩端為固定序 列，中間為隨機(jī)序列。固定序列為PCR引物提供結(jié)合部位，便于SELEX篩選過(guò)程中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制備下一輪篩選的文庫(kù)。隨機(jī)序列使文庫(kù)中核酸序列的多樣性極為豐富，當(dāng)隨機(jī)區(qū)長(zhǎng)度為25個(gè)核苷酸，文庫(kù)中核酸多樣性理論上能達(dá)到IO15 ( 425=1. 12615)。單鏈寡核苷酸的一個(gè)獨(dú)特表現(xiàn)是容易形成各種形狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾、口袋、假結(jié)、凸環(huán)、G-四聚體(G-quartet)等，它們通過(guò)分子構(gòu)象上的“鎖鑰”關(guān)系與靶分子適配，加上氫鍵、范德華力的作用，與靶分子形成穩(wěn)定的復(fù)合物。多樣性達(dá)IO15的巨大庫(kù)容所擁有的豐富的寡核苷酸分子構(gòu)象，可為自然界幾乎所有種類的分子找到匹配的核酸適配子。核酸適配子的功能與抗體類似，但與抗體相比具有許多優(yōu)點(diǎn)①高特異性和高親和性能夠分辨出靶分子結(jié)構(gòu)上細(xì)微的差別，親和力甚至強(qiáng)于天然配體；②靶標(biāo)廣泛從有機(jī)小分子、生物大分子到病毒顆粒、完整細(xì)胞等均可作為篩選靶標(biāo)；③穩(wěn)定性好可長(zhǎng)期保存，通過(guò)人工合成制備而無(wú)批間差異，可在常溫下運(yùn)輸；④改建和修飾容易可在核酸適配子的特定部位進(jìn)行精確的標(biāo)記、修飾或核苷酸替換；⑤應(yīng)用優(yōu)勢(shì)無(wú)免疫原性，可在體內(nèi)反復(fù)使用；分子小，方便于體內(nèi)影像診斷和治療。目前核酸適配子的篩選與應(yīng)用研究已涉及醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，包括基礎(chǔ)研究、臨床診斷、疾病治療和藥物研發(fā)等。SELEX技術(shù)是一種組合化學(xué)新技術(shù)，它利用化學(xué)合成的大容量單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)與靶分子相互作用，從中篩選出能與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸，并借助PCR擴(kuò)增技術(shù)，使之指數(shù)富集，最終獲得高親和力、高特異性的核酸適配子。SELEX技術(shù)自1990年問(wèn)世以來(lái)受到了廣泛關(guān)注，從技術(shù)本身到研究應(yīng)用領(lǐng)域都得到了迅速發(fā)展。除了經(jīng)典的SELEX篩選外，在結(jié)合其它方法的基礎(chǔ)上衍生出多種SELEX篩選方法，例如以熒光磁珠為介質(zhì)衍生的熒光磁珠SELEX技術(shù)，以毛細(xì)管電泳為分離手段的毛細(xì)管電泳SELEX技術(shù)。此外，為適應(yīng)某些特殊需求產(chǎn)生了切換SELEX、表達(dá)盒SELEX、基因組SELEX、消減SELEX、仿進(jìn)化SELEX
坐寸ο用于SELEX篩選的靶標(biāo)遠(yuǎn)比抗體制備的靶標(biāo)豐富，包括無(wú)機(jī)分子、生物小分子、生物大分子、病原微生物、真核細(xì)胞等。目前，通過(guò)SELEX技術(shù)已篩選出各種不同類型靶分子的核酸適配子，包括與基因調(diào)控有關(guān)的核酸結(jié)合蛋白(如噬菌體T4 DNA聚合酶、HIV-I Rev蛋白、核糖體蛋白SI)，非核酸結(jié)合蛋白(如凝血酶、各種細(xì)胞因子、輔因子、緩激肽、IgE抗體)，小分子有機(jī)物(如ATP、茶堿、氨基酸、維生素)，甚至金屬離子、多糖、有機(jī)染料，以及完整的細(xì)胞、病毒、孢子等。然而，盡管核酸適配子的篩選技術(shù)不斷發(fā)展，篩選用的靶標(biāo)也不斷多樣化，但以血清為靶標(biāo)篩選核酸適配子至今尚未見(jiàn)報(bào)道。其原因可能是血清成分過(guò)于復(fù)雜，其中正常組分(如白蛋白)占絕大部分，而與疾病相關(guān)的特異性物質(zhì)(如腫瘤標(biāo)志物)豐度很低，因此以血清為靶標(biāo)進(jìn)行核酸適配子篩選理論上難以獲得理想的篩選效果，篩選出的核酸適配子也難以鑒定，故是一個(gè)鮮有人探索的難題。然而，血清中含有已知和未知的各種疾病標(biāo)志物，蘊(yùn)藏著極為豐富的疾病發(fā)生、發(fā)展、診斷、治療、預(yù)后相關(guān)的信息。由于取材容易、對(duì)患者的創(chuàng)傷小，血清也是目前最為常用且十分理想的臨床標(biāo)本。因此，建立可行、實(shí)用的以血清為靶標(biāo)的核酸適配子篩選技術(shù)，有效篩選疾病標(biāo)志物相關(guān)的特異性核酸適配子，建立基于核酸適配子的血清標(biāo)本檢測(cè)和分析技術(shù)，對(duì)于探索疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和獲取疾病的臨床診療相關(guān)信息，都具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的創(chuàng)建一種血清核酸適配子體外篩選技術(shù)，不受血清個(gè)體差異和非特異性組分的影響，能高效率、高通量篩選出疾病特異的血清核酸適配子群，為建立基于核酸適配子的血清特性系統(tǒng)性分析技術(shù)奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案通過(guò)以混合血清為篩選靶標(biāo)，消除個(gè)體差異；通過(guò)先以陰性混合血清進(jìn)行反篩去除文庫(kù)中與非特異性血清成分結(jié)合的核酸序列并留下和富集不與非特異性血清成分結(jié)合的核酸序列，再以陽(yáng)性混合血清正篩更有效地獲取特異性血清成分的核酸適配子；通過(guò)核酸適配子文庫(kù)PCR產(chǎn)物直接克隆測(cè)序分離單個(gè)核酸適配子；通過(guò)結(jié)構(gòu)分析選擇代表性核酸適配子做后續(xù)鑒定，減少無(wú)意義工作；通過(guò)與陽(yáng)性和陰性混合血清結(jié)合情況的對(duì)比分析選出高特異性的代表性適子；通過(guò)測(cè)定與陽(yáng)性混合血清結(jié)合反應(yīng)的解離常數(shù)選出高親和力的高特異性代表性核酸適配子；通過(guò)與陽(yáng)性和陰性單個(gè)臨床血清標(biāo)本結(jié)合情況的測(cè)定選出具有應(yīng)用價(jià)值的特異性強(qiáng)、親和力大的核酸適配子。最終建立起將多步連環(huán)選擇貫穿于篩選和鑒定全過(guò)程的高效率血清核酸適配子體外篩選新技術(shù)。本發(fā)明的方法包括以下步驟。a.制備混合血清作為篩選靶標(biāo)收集一組患有被研究疾病的患者的血清標(biāo)本，等量混合制備成陽(yáng)性混合血清；同時(shí)收集一組不患有被研究疾病的受試者的血清標(biāo)本，等量混合制備成陰性混合血清。將混合血清用作核酸適配子篩選的靶標(biāo)。b.核酸文庫(kù)及引物的設(shè)計(jì)與合成設(shè)計(jì)單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)和引物序列，人工合成。使用前用結(jié)合緩沖液分別配制成文庫(kù)和引物溶液。c.用陰性混合血清進(jìn)行反向篩選將步驟a制備的陰性混合血清與步驟b制備的文庫(kù)(原始文庫(kù))孵育，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并切膠回收游離核酸，以游離核酸為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增并回收和純化單鏈寡核苷酸，重復(fù)若干輪上述孵育-回收-制備，當(dāng)凝膠電泳顯示結(jié)合核酸條帶明顯減弱、游離核酸條帶明顯增強(qiáng)時(shí)，停止篩選，定量后作為下一輪篩選的亞文庫(kù)；重復(fù)若干輪上述孵育-回收-制備，當(dāng)凝膠電泳顯示結(jié)合核酸條帶明顯減弱、游離核酸條帶明顯增強(qiáng)時(shí)，停止篩選。d.用陽(yáng)性混合血清正向篩選將步驟a制備的陽(yáng)性混合血清與步驟c最后一輪反向篩選后制備的亞文庫(kù)(二級(jí)文庫(kù))孵育，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并切膠回收結(jié)合核酸，以結(jié)合核酸為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收和純化單鏈寡核苷酸，定量后作為下一輪篩選的亞文庫(kù)；重復(fù)若干輪上述孵育-回收-制備，并逐輪增加核酸與血清的量比，當(dāng)凝膠電泳顯示結(jié)合核酸條帶明顯、游離核酸條帶明顯減弱趨于消失時(shí)，停止篩選。e.克隆測(cè)序分離單個(gè)核酸適配子以步驟d最后一輪正向篩選后制備的亞文庫(kù)(核酸適配子文庫(kù))為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行克隆分離和核酸測(cè)序；將測(cè)序結(jié)果與所設(shè)計(jì)文庫(kù)的序列進(jìn)行比對(duì)，將兩端固定序列區(qū)與文庫(kù)相同、中間隨機(jī)序列區(qū)長(zhǎng)度與文庫(kù)相同的核酸序列確定為核酸適配子。
f.單個(gè)核酸適配子的結(jié)構(gòu)分析對(duì)步驟e確定的核酸適配子的核苷酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)模擬分析，按序列同源性進(jìn)行聚類分析和家族劃分，對(duì)同一家族核酸適配子通過(guò)同源性比對(duì)找出主要基序。根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬分析及同源性分析結(jié)果選出代表性核酸適配子。g.核酸適配子的特異性分析將步驟f選出的代表性核酸適配子分別與陰性混合血清和陽(yáng)性混合血清孵育，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳及核酸染色，觀察游離核酸適配子帶的強(qiáng)弱，采集圖像并用凝膠分析軟件測(cè)定游離核酸適配子帶的灰度值，計(jì)算陰性混合血清與陽(yáng)性混合血清的游離核酸適配子帶的灰度比值，選出特異性強(qiáng)的核酸適配子(灰度比值越大，核酸適配子的特異性越強(qiáng))。h.核酸適配子的親和力分析將步驟g選出的特異性強(qiáng)的代表性核酸適配子配成梯度濃度，與陽(yáng)性混合血清孵育后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳和核酸染色，采集圖像并測(cè)定各梯度點(diǎn)結(jié)合核酸適配子帶的灰度值，計(jì)算解離常數(shù)Kd，選出親和力大的核酸適配子(Kd值越小,親和力越大)。i.核酸適配子應(yīng)用價(jià)值分析將步驟h選出的特異性強(qiáng)、親和力大的核酸適配子分別與單個(gè)陽(yáng)性血清標(biāo)本和陰性血清標(biāo)本孵育，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳和核酸染色，測(cè)定各標(biāo)本的游離核酸適配子帶的灰度值，計(jì)算各標(biāo)本與核酸適配子對(duì)照(以結(jié)合緩沖液代替血清標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn))的灰度比值，統(tǒng)計(jì)分析兩類標(biāo)本之間的灰度比值差異以及核酸適配子對(duì)陽(yáng)性和陰性標(biāo)本的判別能力。選出應(yīng)用價(jià)值大的核酸適配子(鑒別兩類標(biāo)本的能力越強(qiáng)，核酸適配子的應(yīng)用價(jià)值越大)供后續(xù)研究應(yīng)用。其中上述步驟中所述的血清標(biāo)本為抽取患者空腹?fàn)顟B(tài)下的外周靜脈血標(biāo)本,凝固后常規(guī)離心分離血清，_80°C保存?zhèn)溆谩Ｈ?0例左右患有所研究疾病的患者的血清等量混合制成陽(yáng)性混合血清。取20例左右不患有所研究疾病的患者或正常人的血清等量混合制成陰性混合血清。其中上述步驟中所述的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)是指用于SELEX篩選的人工設(shè)計(jì)并化學(xué)合成的文庫(kù)。文庫(kù)中的寡核苷酸為單鏈，兩端為固定序列(為PCR擴(kuò)增時(shí)提供引物結(jié)合部位)，中間為隨機(jī)序列(使單鏈寡核苷酸鏈能形成各種不同的分子構(gòu)象)。上游引物與文庫(kù)的5’端固定序列相同，下游引物與文庫(kù)的3’端固定序列互補(bǔ)。結(jié)合緩沖液的成分為20mM Hepes-Na,120mM NaCl,5mM KCl,ImM CaCl2,1 mM MgCl20其中上述步驟中所述的聚丙烯酰胺凝膠及核酸染色具體如下血清與文庫(kù)(或核酸適配子)孵育后觀察核酸與血清的結(jié)合情況、目的條帶的灰度測(cè)定和切膠回收使用含10%甘油的10°/Γ12%中性聚丙烯酰胺凝膠；不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收使用含7Μ尿素的8%變性聚丙烯酰胺凝膠；核酸染色采用硝酸銀染色(觀察時(shí))或核酸熒光染料GelRed染色(觀察或切膠回收時(shí))。其中上述步驟中所述的從凝膠中回收核酸采用冷凍壓榨法，或采用電洗脫法；純化核酸采用酚-氯仿抽提后使用市售核酸沉淀劑共沉淀法。其中上述步驟中所述的核酸PCR擴(kuò)增具體如下亞文庫(kù)制備使用不對(duì)稱PCR擴(kuò)增后尿素變性膠回收單鏈寡核酸，或使用對(duì)稱PCR擴(kuò)增后變性雙鏈產(chǎn)物再選擇回收單鏈寡核苷酸；亞文庫(kù)的核酸定量采用熒光定量PCR法；核酸適配子克隆測(cè)序所用的核酸采用常規(guī)對(duì)稱PCR擴(kuò)增。其中上述步驟中所述的核酸適配子二級(jí)結(jié)構(gòu)摸擬分析采用RNA structure 4. 6軟件或具有類似功能的軟件完成，核酸適配子同源性的家族聚類分析、各家族的主要基序?qū)ふ也捎肅lustal X軟件或具有類似功能的軟件完成。
其中上述步驟中所述的灰度測(cè)定是凝膠電泳和核酸染色完成后，借助紫外透射儀及其紫外濾光配件用數(shù)碼相機(jī)拍攝圖像，或通過(guò)電泳凝膠分析系統(tǒng)采集圖像，再通過(guò)電泳凝膠分析軟件測(cè)定目的條帶的灰度值。其中上述步驟中所述的核酸適配子與陽(yáng)性混合血清結(jié)合的解離常數(shù)(Kd)分析使用Graphpad prism 5軟件或具有類似功能的軟件完成。其中上述步驟中所述的核酸適配子對(duì)照是以結(jié)合緩沖液代替血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每塊凝膠設(shè)一個(gè)核酸適配子對(duì)照。各標(biāo)本的游離核酸適配子帶的灰度值分別除以同一塊凝膠的核酸適配子對(duì)照的灰度值，即得到各標(biāo)本的游離核酸適配子帶的灰度比值。其中上述步驟中所述的核酸適配子對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本和陰性標(biāo)本的鑒別能力采用受試者工作特征(ROC)曲線進(jìn)行分析，觀察曲線下面積(AUC)，并確定最佳界值后計(jì)算鑒別的敏感度、特異度和準(zhǔn)確度。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明方法有效解決了以血清為靶標(biāo)的核酸適配子篩選技術(shù)問(wèn)題，能高效率篩選出疾病特異性的血清核酸適配子。目前篩選單一靶分子(如純化的某種蛋白質(zhì))或單一靶標(biāo)(如均一的某種細(xì)胞)的核酸適配子目前并不存在技術(shù)問(wèn)題，而血清是成分十分復(fù)雜的液態(tài)系統(tǒng)，其中含有大量非特異性成分，而與疾病相關(guān)的特異性生物標(biāo)志物含量很低，要以血清為靶標(biāo)篩選出這些低豐度的疾病特異性標(biāo)志物的核酸適配子，必須解決血清中大量非特異性組分對(duì)篩選的干擾這個(gè)技術(shù)難題。本發(fā)明方法通過(guò)新穎的技術(shù)思路和設(shè)計(jì)方案，從篩選、鑒定直到應(yīng)用價(jià)值驗(yàn)證，多步驟連環(huán)選擇，形成一個(gè)嚴(yán)謹(jǐn)而高效的篩選系統(tǒng)，最終達(dá)到克服血清大量非特異性成分的干擾而有效篩選出特異性的核酸適配子的目的。血清中含有各種已知和未知的疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物，是探討疾病的發(fā)生、發(fā)展、診斷、治療和/或預(yù)后的重要靶分子。本發(fā)明方法直接以血清為靶標(biāo)進(jìn)行篩選，高通量篩選出各種標(biāo)志物的核酸適配子，為建立基于核酸適配子的血清分析技術(shù)進(jìn)而系統(tǒng)性探索疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律和獲取臨床診療相關(guān)信息奠定了良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明方法可用于各種疾病血清中特異性成分(標(biāo)志物)的核酸適配子篩選，特別是腫瘤新的生物標(biāo)志物的研究和應(yīng)用，實(shí)用價(jià)值大，應(yīng)用前景廣闊。


圖I為本發(fā)明方法的技術(shù)流程圖。
圖2為切膠回收的核酸不對(duì)稱PCR擴(kuò)增后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳及硝酸銀染色的結(jié)果。泳道Γ4為擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行12%中性聚丙烯酰胺凝膠電泳，可見(jiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物中的單鏈DNA (紅色smear)和雙鏈DNA (深色條帶)混在一起。泳道M為20bp DNA marker 圖3為與圖2對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行含7M尿素的8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及硝酸銀染色的結(jié)果?？梢?jiàn)單鏈DNA (紅色條帶)和雙鏈DNA (深色條帶)已很好地分開(kāi)，便于切膠回收；泳道1^為20bp DNA marker ο
圖Γ圖6為克隆分離出的陽(yáng)性血清核酸適配子之一。其中圖4為該核酸適配子的核酸預(yù)序圖，圖5為該核酸適配子的核酸序列，圖6為該核酸適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬圖。圖疒圖9為克隆分離出的核酸適配子進(jìn)行序列同源性分析后幾個(gè)不同家族的保守序列。其中，圖7為第一家族中以T/GGGT為保守序列的核酸適配子；圖8為第二家族中以GT-TGT為保守序列的核酸適配子；圖9為第三家族中以T(C/T)GG為保守序列的核酸適配子。圖10、圖11為核酸適配子與陽(yáng)性混合血清結(jié)合的特異性分析結(jié)果。其中，圖10為將梯度濃度的核酸適配子分別與陽(yáng)性和陰性混合血清孵育，然后進(jìn)行12%中性聚丙烯酰胺凝膠電泳和GelRed染色，第I、3、5、7、9泳道對(duì)應(yīng)的核酸適配子量為2、3、4、5、6pmol，與之孵育的血清均為2 μ I陽(yáng)性混合血清，第2、4、6、8、10泳道對(duì)應(yīng)的核酸適配子量為2、3、4、5、6pmol，與之孵育的血清均為2 μ I陰性混合血清；圖11為圖10中相同核酸適配子量點(diǎn)的陰性與陽(yáng)性混合血清的游離核酸適配子帶的灰度比值。圖12、圖13為核酸適配子與陽(yáng)性混合血清結(jié)合的親和力測(cè)定結(jié)果。其中，圖12為將梯度核酸適配子量與陽(yáng)性混合血清孵育后進(jìn)行中性聚丙烯酰胺凝膠電泳及GelRed染色，泳道Γ8分別對(duì)應(yīng)l、2、3、4、5、6、7、8pmol的核酸適配子量(濃度O. 083 O. 667 μ M)，陽(yáng)性混合血清2 μ I ;圖13為測(cè)定各泳道結(jié)合帶的灰度值并計(jì)算其構(gòu)成比,Graphpad prism 5軟件作圖計(jì)算核酸適配子與陽(yáng)性混合血清結(jié)合的解離常數(shù)(Kd)。圖14、圖15為核酸適配子與臨床血清標(biāo)本結(jié)合程度分析。核酸適配子與血清孵育后進(jìn)行12%中性聚丙烯酰胺凝膠電泳及GelRed染色。其中，圖14中泳道f 8為不同肝癌血清標(biāo)本，AP為核酸適配子對(duì)照；圖15中泳道廣7為不同正常血清標(biāo)本，AP為核酸適配子對(duì)照。從圖14、15中可見(jiàn)核酸適配子與肝癌血清標(biāo)本的結(jié)合帶明顯強(qiáng)于正常血清標(biāo)本，而游離帶則明顯弱于正常血清標(biāo)本。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)肝癌血清核酸適配子篩選的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的方法作進(jìn)一步說(shuō)明。I.靶血清收集與處理。收集20例手術(shù)及病理確診的原發(fā)性肝癌患者術(shù)前外周血非抗凝標(biāo)本，每例2ml左右，性別、年齡不限。同時(shí)收集20例正常體檢人員的外周血非抗凝標(biāo)本，性別、年齡不限，B超肝臟未見(jiàn)異常，乙肝表面抗原、HCV抗體、AFP均為陰性，肝腎功能正常。血標(biāo)本常規(guī)離心，分離血清，分裝后置_80°C冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们皩⑺占?0例肝癌血清各取50 μ I混勻，瞬間離心，制備成肝癌混合血清，50μ I/管分裝，-20°C冰箱保存?zhèn)溆?。以同樣的方法制備并保存正?；旌涎濉?br> 2.文庫(kù)與引物的設(shè)計(jì)與合成。自行設(shè)計(jì)文庫(kù)，兩端固定序列19nt，中間隨機(jī)序列為40nt，具體序列如下5' -ACCGAC CGT GCT GGA CTC T (N40) AGT ATG AGC GAG CGT TGC G-3/。上游引物與文庫(kù)的5'端固定序列相同，下游引物與文庫(kù)的3'端固定序列互補(bǔ)，具體序列如下5' -ACCGAC CGTGCT GGA CTC T-3'，5' -CGC AAC GCT CGC TCA TAC T-3'。文庫(kù)與引物均由上海Sangon公司合成，合成量為2 OD。3.以正?；旌涎鍨榘袠?biāo)的反向篩選。將正?；旌涎迮c合成的隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫(kù)孵育，切膠回收不與血清結(jié)合的游離核酸，不對(duì)稱PCR擴(kuò)增制備亞文庫(kù)，用于下一輪篩選。具體步驟如下。( I)文庫(kù)與正?；旌涎宸跤?。 I) 將200 μ I結(jié)合緩沖液加入20D合成文庫(kù)，震蕩混勻，瞬間離心。2) 將文庫(kù)溶液置99°C變性5min，冰浴5min。3) 加入600 μ I正?；旌涎澹?0 μ I甘油。4) 37°C水浴60min，期間不時(shí)搖動(dòng)。(2 )聚丙烯酰胺凝膠電泳。I) 配制含10%甘油的12%中性聚丙烯酰胺凝膠溶液。2) 裝配垂直電泳膠模，灌膠，室溫下放置60min以上，凝固后備用。3) 將膠板裝配于垂直電泳槽中，加入預(yù)冷O. 5 ΤΒΕ，預(yù)電泳lOmin。4) 將上述文庫(kù)與正常血清孵育后的反應(yīng)液上樣電泳，200V，40min。(3) GelRed 凝膠染色。I) 取 46ml ddH20 于平皿中。2) 加入I. 25M氯化鈉溶液4ml，再加入GelRed染料15 μ 1，混勻。3) 電泳結(jié)束后取下凝膠片，放入染液中染色20min。4) 紫外燈下觀看結(jié)果，拍照存檔。(4)切膠回收游離單鏈寡核苷酸(ssDNA)。I) 用手術(shù)刀片切下游離ssDNA條帶(40bp lOObp)。2)將膠條移至5ml規(guī)格的一次性注射器內(nèi)，搗碎凝膠條并加壓由注射器針頭擠出，1.5ml EP管收集。3) 加 IXTE 緩沖液(ρΗ8·0) 400μ 1，置于-20°C 30min 后，立即 48°C水浴30mino4) 重復(fù)上一步驟2次。5) 將上清移至新的EP管中。6) 12000r/min 4°C離心5min,將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管。(5)酚/氯仿抽提純化ssDNA。I) 在上一步驟得到的上清液中加入等體積Tris飽和酚，充分混勻后，12000r/min 4。。離心 lOmin。2) 小心吸取上層液體至新的EP管。3) 加入等體積氯仿，振蕩，充分混勻后，12000 r/min 4°C離心lOmin。4) 小心吸取上層液體至新的EP管。
(6)核酸共沉淀劑沉淀ssDNA。I) 在上一步驟得到的溶液中加入1/10體積3M NaAc溶液，混勻。2) 加入DNAmate溶液，混勻(當(dāng)溶液體積小于400 μ I時(shí)，DNAmate用量均為4 μ I,大于400 μ I時(shí)，按每100 μ I增加I μ I的比例增加DNAmate用量)。3) 加入2. 5倍體積_20°C預(yù)冷的無(wú)水乙醇，充分混勻。4) 12000 r/min 4 離心 15min。5) 棄上清，沉淀用-20°C預(yù)冷的70%乙醇清洗一次，室溫下干燥。6) 用60 μ I TE Buffer溶解沉淀，作為不對(duì)稱PCR擴(kuò)增的模板。(7)不對(duì)稱PCR擴(kuò)增回收的ssDNA。I) 設(shè)25管平行管,反應(yīng)體系50 μ I,包括如下成分
2IPCRMIX25 μ I
上游引物1·5μ1(0·75μΜ)
下游引物L(fēng) 5μ 1 (0. 0375μΜ)
ssDNA 模板2 μ I
ddH2020 μ Io2)PCR 擴(kuò)增條件94°C 3min,94°C 45s，68°C 90s, 20 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸7min。(6 )不對(duì)稱PCR產(chǎn)物銀染色鑒定。I) 配制12%中性聚丙烯酰胺凝膠溶液。2) 裝配垂直電泳凝膠模板，灌膠，室溫下放置60min以上，凝固后備用。3) 將膠板裝配于電泳槽中，加入 ΤΒΕ緩沖液。4) 將5 μ I PCR產(chǎn)物與I μ I上樣緩沖液混勻上樣。5) 200V電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)泳動(dòng)至凝膠底端即停止電泳。6) 小心取下凝膠片，標(biāo)記好左右，置于IOOml銀染固定液中，l(Tl5min。7) ddH20 沖洗 2 次，IOs/次。8) 加入O. 2%硝酸銀溶液100ml，染色I(xiàn)Omin。9) ddH20 沖洗 3 次，IOs/次。10)加100ml DNA銀染顯色液，直至出現(xiàn)清晰的DNA條帶。11)判讀結(jié)果，當(dāng)在dsDNA條帶上下見(jiàn)到smear,即為ssDNA。12)掃描圖像，保存于電腦。(7)尿素變性膠電泳回收ssDNA。I) 配制含7M尿素的8%聚丙烯酰胺凝膠溶液。2) 裝配垂直電泳膠模板，灌膠，室溫下放置60min以上待凝固。3) 將膠板裝配于電泳槽中，加入 ΤΒΕ緩沖液。4) 將5 μ I PCR產(chǎn)物與I μ I上樣緩沖液混勻，上樣，200V電泳40min。5) 小心取下凝膠片，GelRed核酸染料染色10 30min。6) 紫外燈下觀察，ssDNA條帶泳動(dòng)速度慢于dsDNA。7) 用手術(shù)刀片切下ssDNA條帶，擠壓、反復(fù)凍融法回收ssDNA (步驟同前)。8) 酚-氯仿純化ssDNA (步驟同前)。
9) 核酸共沉淀劑沉淀ssDNA (步驟同前)。(8)實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量回收純化的ssDNA。將回收的ssDNA溶液作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。I) 反應(yīng)體系20 μ I,包括如下成分
2iEvagreen PCR MIX 10 μ I
上游引物I μ 1(10 μ Μ)
下游引物I μ 1(10 μ Μ)
ssDNA 模板2 μ I
ddH206 μ I ο2) 0 擴(kuò)增條件9413111丨11;941458，681908，20個(gè)循環(huán)；最后721 7min。3) 同時(shí)以倍比稀釋的原始文庫(kù)溶液(含單鏈寡核苷酸ΙΟ5、ΙΟ6、ΙΟ7、108、IO9個(gè)拷貝)為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。4) 將ssDNA拷貝數(shù)濃度換算成摩爾濃度，計(jì)算回收的ssDNA總量，作為亞文庫(kù)，用于下一輪篩選。 經(jīng)3輪篩選后在電泳凝膠上見(jiàn)結(jié)合帶明顯減弱，游離帶明顯增強(qiáng)，反篩結(jié)束。4.以肝癌混合血清進(jìn)行正向篩選。將肝癌混合血清與上述3輪消減SELEX后的亞文庫(kù)進(jìn)行孵育，切膠回收與血清結(jié)合的核酸，不對(duì)稱PCR擴(kuò)增，切膠回收純化后用作下一輪篩選的文庫(kù)。具體步驟如下。(I)肝癌混合血清與上述亞文庫(kù)孵育將亞文庫(kù)液99°C熱變性5min，冰浴5min，按預(yù)定比例加入肝癌混合血清(核酸/血清比從2pmol : I μ I開(kāi)始，兩者比例隨篩選輪次增加而逐步增加)，37°C孵育3(T60min (孵育時(shí)間隨篩選輪次增加而逐步縮短)，期間不時(shí)搖動(dòng)。(2)聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟同前述正常混合血清反向篩選。(3) GelRed凝膠染色步驟同前述正?；旌涎宸聪蚝Y選。(4)切膠回收結(jié)合ssDNA :切取核酸與血清的結(jié)合條帶，步驟同前述正?；旌涎宸聪蚝Y選。(5)酚-氯仿抽提純化ssDNA :步驟同前述正?；旌涎宸聪蚝Y選。(6)核酸共沉淀劑沉淀ssDNA :步驟同前述正?；旌涎宸聪蚝Y選。(7)不對(duì)稱PCR擴(kuò)增回收的ssDNA :步驟同前述正?；旌涎宸聪蚝Y選。(8)不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物銀染色鑒定步驟同前述正?；旌涎宸聪蚝Y選。(9) 7M尿素變性膠電泳回收ssDNA條帶步驟同前述正?；旌涎宸聪蚝Y選。(10)回收純化ssDNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量步驟同前述正?；旌涎宸聪蚝Y選。以肝癌混合血清進(jìn)行正向SELEX篩選過(guò)程中，隨著篩選輪次的增加，文庫(kù)與肝癌混合血清的結(jié)合不斷增多，表明能與肝癌血清結(jié)合的核酸不斷被富集，至第9輪時(shí)，文庫(kù)與血清的結(jié)合已非常明顯，故而終止篩選。5.克隆法分離單個(gè)核酸適配子
以第9輪篩選后制備的亞文庫(kù)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得dsDNA，送上海Sangon公司克隆分離單個(gè)核酸適配子，并測(cè)定核酸序列。(I)亞文庫(kù)的對(duì)稱PCR擴(kuò)增。
I) 設(shè)平行管10管，反應(yīng)體系50 μ 1，包括如下成分
2IPCRMIX25 μ I
上游引物1·5μ1(0·75μΜ)
下游引物1·5μ1(0·75μΜ)
核酸適配子文庫(kù)模板2μ1 ddH2020 μ Io2) PCR擴(kuò)增條件94°C 3min, 94°C 45s，68°C 90s, 8 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 7min。(2) 12%中性膠鑒定PCR產(chǎn)物。I) 配制12%中性聚丙烯酰胺凝膠溶液。2) 裝配垂直電泳膠模板，灌膠，室溫下放置60min以上待凝固。3) 將膠板裝配于泳槽中，加入 ΤΒΕ緩沖液。4) 將5 μ I的PCR產(chǎn)物與I μ I上樣緩沖液混勻，上樣，200V電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)泳至凝膠底端時(shí)結(jié)束電泳。5) 取下膠片GelRed染色，紫外燈下觀察結(jié)果。(3)克隆測(cè)序。將PCR產(chǎn)物送上海Sangon公司，回收目的片段，克隆測(cè)序。前后共分離出200多條核酸序列，經(jīng)與文庫(kù)序列比對(duì)，去除序列重復(fù)者，成功分離到182個(gè)肝癌血清核酸適配子。6.核酸適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬分析。(I)將核酸適配子的測(cè)序圖譜用Chromas軟件打開(kāi)，導(dǎo)出意義序列到文本文件并保存。(2)打開(kāi)RNA structure 4. 6軟件，點(diǎn)擊file,在下拉菜單中點(diǎn)擊“newsequence",出現(xiàn)一個(gè)分析新序列的對(duì)話框，將(I)中保存的序列粘貼到對(duì)話框中的sequence 欄中。(3)點(diǎn)擊 “Fold as DNA”，出現(xiàn) “the sequence has been edited. Savechanges ”，點(diǎn)擊 “Yes”。(4)將文件保存到文件夾中，出現(xiàn)對(duì)話框，點(diǎn)擊“Start”，出現(xiàn)對(duì)話框，點(diǎn)擊“drawstructures”,出現(xiàn)軟件模擬的核酸適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)和折疊所需最低能量。(5)將核酸適配子二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)制、保存。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示所分離出的核酸適配子有豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)，包括發(fā)夾、假結(jié)、凸環(huán)、口袋、棒形和球拍形等多種構(gòu)象，二級(jí)結(jié)果折疊所需的最低能量從-19. 6到-7. 3不等。7.核酸適配子的同源性分析。(I)將所有核酸適配子序列整理成FASTA格式保存為txt文檔。(2)打開(kāi)Clustal X軟件，點(diǎn)擊“file”,在下拉菜單中點(diǎn)擊“l(fā)oad sequences”,選取(I)中保存的文檔，此時(shí)文檔中多條序列會(huì)導(dǎo)入到主界面上。(3)打開(kāi)Clustal X軟件，點(diǎn)擊“tree”,在下拉菜單中點(diǎn)擊“draw tree”,系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。 (4)根據(jù)進(jìn)化樹(shù)親緣關(guān)系將核酸適配子劃分家族。(5)將同一家族的核酸適配子整理成FASTA格式，按照(2)方法導(dǎo)入軟件中，點(diǎn)擊“Alignment”,在下拉菜單中點(diǎn)擊“Do complete alignment”。(5)序列會(huì)根據(jù)軟件提供的參數(shù)進(jìn)行全序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)在主界面上，保守序列用*標(biāo)記，同時(shí)軟件會(huì)自動(dòng)保存與txt相同文件名的比對(duì)結(jié)果到txt所在的文件夾中。經(jīng)同源性分析，全部核酸適配子可聚類成3個(gè)大家族。第一家族中以GGT為主流基序，同時(shí)還有TGA和GATG等基序，第二個(gè)家族主要是C(G/A)GT、GCAGT等，第3家族只有一個(gè)基序T(C/T)GG。從不同家族中選出15個(gè)代表性核酸適配子進(jìn)行后續(xù)分析。8.核酸適配子與肝癌血清結(jié)合的特異性分析。采用中性聚丙烯酰胺凝膠電泳及灰度測(cè)定方法分析15個(gè)代表性核酸適配子與肝 癌血清結(jié)合的特異性。具體步驟如下。(I)配制12%中性聚丙烯酰胺凝膠溶液，裝配垂直電泳膠模，灌膠，室溫下放置60min以上待凝固，使用前200V預(yù)電泳lOmin。(2)按下表配制核酸適配子的梯度混合液、變性及與血清孵育。
權(quán)利要求
1.一種多步連環(huán)選擇的血清核酸適配子體外篩選方法，其特征是包括以下步驟 a.收集一組患有被研究疾病的患者的血清標(biāo)本,等量混合制備成陽(yáng)性混合血清；同時(shí)收集一組不患有被研究疾病的受試者的血清標(biāo)本，等量混合制備成陰性混合血清； b.設(shè)計(jì)單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)和引物序列，人工合成，用結(jié)合緩沖液分別配制成文庫(kù)和引物溶液； c.將陰性混合血清與步驟b制備的文庫(kù)溶液孵育，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并切膠回收游離核酸，以游離核酸為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增并回收和純化單鏈寡核苷酸，定量后作為下一輪篩選的亞文庫(kù)；重復(fù)若干輪上述孵育-回收-制備，當(dāng)凝膠電泳顯示結(jié)合核酸條帶明顯減弱、游離核酸條帶明顯增強(qiáng)時(shí)，停止篩選； d.將陽(yáng)性混合血清與步驟c最后一輪篩選后制備的亞文庫(kù)孵育，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并切膠回收結(jié)合核酸，以結(jié)合核酸為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收和純化單鏈寡核苷酸，定量后作為下一輪篩選的亞文庫(kù)；重復(fù)若干輪上述孵育-回收-制備，并逐輪增加核酸與血清的量比，當(dāng)凝膠電泳顯示結(jié)合核酸條帶明顯、游離核酸條帶明顯減弱趨于消失時(shí)，停止篩選； e.以步驟d最后一輪篩選后制備的亞文庫(kù)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行克隆分離和核酸測(cè)序；將測(cè)序結(jié)果與所設(shè)計(jì)文庫(kù)的序列進(jìn)行比對(duì)，將兩端固定序列區(qū)與文庫(kù)相同、中間隨機(jī)序列區(qū)長(zhǎng)度與文庫(kù)相同的核酸序列確定為核酸適配子； f.對(duì)步驟e確定的核酸適配子的核苷酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)模擬分析，按序列同源性進(jìn)行聚類分析和家族劃分，對(duì)同一家族核酸適配子通過(guò)同源性比對(duì)找出主要基序，選出代表性核酸適配子； g.將步驟f選出的代表性核酸適配子分別與陰性混合血清和陽(yáng)性混合血清孵育，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳及核酸染色，觀察游離核酸適配子帶的強(qiáng)弱，采集圖像并用凝膠分析軟件測(cè)定游離核酸適配子帶的灰度值，計(jì)算陰性混合血清與陽(yáng)性混合血清的游離核酸適配子帶的灰度比值，選出特異性強(qiáng)的核酸適配子； h.將步驟g選出的特異性強(qiáng)的代表性核酸適配子配成梯度濃度，與陽(yáng)性混合血清孵育后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳和核酸染色，采集圖像并測(cè)定各梯度點(diǎn)結(jié)合核酸適配子帶的灰度值，計(jì)算解離常數(shù)Kd，選出親和力高的核酸適配子； i.將步驟h選出的核酸適配子分別與單個(gè)陽(yáng)性血清標(biāo)本和陰性血清標(biāo)本孵育，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳和核酸染色，測(cè)定各標(biāo)本的游離核酸適配子帶的灰度值，計(jì)算各標(biāo)本與核酸適配子對(duì)照的灰度比值，統(tǒng)計(jì)分析兩類標(biāo)本之間的灰度比值差異以及核酸適配子對(duì)陽(yáng)性和陰性標(biāo)本的判別能力，選出應(yīng)用價(jià)值大的核酸適配子。
2.利用權(quán)利要求I項(xiàng)中所述的任一步驟建立的血清核酸適配子篩選技術(shù)。
全文摘要
一種多步連環(huán)選擇的血清核酸適配子體外篩選方法，屬生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域，其特征是通過(guò)以混合血清為篩選靶標(biāo)消除個(gè)體差異，先以正常血清反篩去除文庫(kù)中能與非特異性血清成分結(jié)合的核酸序列，再以混合血清正篩繼而克隆測(cè)序分離核酸適配子，通過(guò)對(duì)核酸適配子的結(jié)構(gòu)模擬分析、特異性分析、親和力分析和應(yīng)用價(jià)值分析，優(yōu)選出應(yīng)用價(jià)值大的核酸適配子。本發(fā)明克服了血清中大量非特異性成分的干擾，可以直接以血清為靶標(biāo)高通量篩選出血清中疾病特異性成分的核酸適配子，既高效又經(jīng)濟(jì)，可為建立基于核酸適配子的分析技術(shù)并系統(tǒng)性探索疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律和獲取臨床診療相關(guān)的生物信息奠定基礎(chǔ)，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102732505SQ20121004541
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月27日
發(fā)明者呂農(nóng)華, 張吉翔, 張焜和, 徐國(guó)峰, 曾琴, 王婷, 陳文學(xué), 魏淑琴 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)