專利名稱：一種能夠緩解鉛毒性的植物乳桿菌及其用途的制作方法
一種能夠緩解鉛毒性的植物乳桿菌及其用途
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種能夠緩解鉛毒性的植物乳桿菌，本發(fā)明還涉及所述植物乳桿菌的用途。
背景技術(shù)：
鉛是一種對(duì)人體健康極其有害的重金屬。其具有的獨(dú)特理化性質(zhì)使其獲得廣泛的應(yīng)用，在工業(yè)上是一種重要的化學(xué)材料，從而進(jìn)入了人類生活的方方面面；但是，它又是一種對(duì)多個(gè)臟器具有毒性的金屬元素，在人體內(nèi)無(wú)任何生理作用，理想血鉛濃度應(yīng)為零。隨著工業(yè)、農(nóng)業(yè)、交通、油漆、印刷及電子產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，空氣、土壤、水及食物都不同程度地受到了鉛污染。長(zhǎng)期鉛暴露使人們對(duì)鉛的接觸和吸收在逐漸增加，導(dǎo)致體內(nèi)鉛蓄積。鉛能夠作用于全身各個(gè)系統(tǒng)和器官，它的毒性與其化合物的形態(tài)和溶解度有關(guān)，但主要涉及造血、 心血管、消化、泌尿、免疫等系統(tǒng)，直接危害人體的健康，其中對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、造血系統(tǒng)和血管等的損害最為顯著。鉛中毒患者會(huì)出現(xiàn)腹痛、腹瀉、嘔吐、頭痛、頭暈、昏迷等癥狀，并造成血管痙攣，肝腎損傷等生理病癥。對(duì)于由鉛蓄積和鉛中毒引起的各種生理病癥，傳統(tǒng)的療法主要采用依地酸二鈉鈣、二巰基丁二酸鈉等螯合劑進(jìn)行注射治療，以達(dá)到排鉛的目的，例如中國(guó)藥典第二版 (2000年)記載了依地酸二鈉鈣作為鉛和鎘等重金屬中毒的解毒劑。然而，這些藥物都存在著一定的毒副作用。依地酸二鈉鈣是一種廣譜性絡(luò)合劑，具有較強(qiáng)的腎毒性，且用藥時(shí)會(huì)經(jīng)尿排出大量人體不可缺少的微量元素，例如鋅、銅、錳、鐵等，而這些元素與很多酶的活性有關(guān)，因此大量使用依地酸二鈉鈣會(huì)危及人的身體健康。二巰基丁二酸鈉可能導(dǎo)致消化系統(tǒng)功能紊亂，并造成頭痛、惡心、四肢酸痛等癥狀。鑒于傳統(tǒng)治療方法存在的多種問(wèn)題，針對(duì)鉛蓄積和鉛中毒尋找一種新的干預(yù)或治療方法顯得十分必要。乳酸菌是一類能夠使碳水化合物發(fā)酵并產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌的統(tǒng)稱， 廣泛存在于自然發(fā)酵乳制品、發(fā)酵植物食品，如泡菜、酸菜、青貯飼料以及人腸道中。長(zhǎng)期科學(xué)研究結(jié)果表明，以乳酸菌為代表的益生菌是人體必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，其主要生理功能有防治乳糖不耐癥、恢復(fù)人體腸道內(nèi)菌群平衡維護(hù)人體健康、抗腫瘤和預(yù)防癌癥作用、控制人體內(nèi)毒素水平、保護(hù)肝臟并增強(qiáng)肝臟的解毒等功能。因此探索乳酸菌在緩解鉛毒性效應(yīng)中的效果就可以進(jìn)一步地挖掘益生菌的功能，開(kāi)發(fā)具有更高保健價(jià)值的乳酸菌，為利用膳食策略緩解鉛中毒效應(yīng)開(kāi)辟出新的途徑和解決方案。目前，一些專利文獻(xiàn)涉及排鉛保健食品及其制備方法，例如CN101933937A公開(kāi)了一種具有自然螯合功能，而可以將動(dòng)物體內(nèi)的鉛離子排出體外的低分子柑桔果膠； CN101011432涉及蕨菜黃酮提取物在作為排鉛和緩解鉛中毒藥物中的應(yīng)用；CN1506070提供了一種含水蘇糖的排鉛保健品。但是，目前涉及具有緩解鉛中毒效應(yīng)的乳酸菌專利申請(qǐng)文件不多，例如CN101134945A公開(kāi)了一種肺炎克雷伯氏菌Z-KAE15，它對(duì)鉛具有高耐受性、 高吸附性，它應(yīng)用于環(huán)境工程技術(shù)領(lǐng)域中。另外，CN101252943A公開(kāi)了一些植物乳桿菌，它用于促進(jìn)哺乳動(dòng)物吸收鐵、鋅、鈣、鎂離子。
因此，篩選出一種具有緩解鉛毒性功能的乳酸菌，并且證明它們?cè)趧?dòng)物模型中具有良好的緩解鉛中毒作用，同時(shí)研制這些乳酸菌實(shí)際的用途就顯得十分必要。本發(fā)明人在總結(jié)現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究，終于完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容[要解決的技術(shù)問(wèn)題]本發(fā)明的目的是提供一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)CCFM8661。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述植物乳桿菌CCFM8661的用途。[技術(shù)方案]本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明涉及一種乳酸菌，利用形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀和生理生化特征等微生物學(xué)特性對(duì)該乳酸菌鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)CCFM8661,該菌菌株已于 2011年11月29日在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏號(hào)為CGMCC No. 5494。所述的植物乳桿菌CCFM8661具有下述性質(zhì)(I)具有耐酸性，在pH3. 0-9. O環(huán)境條件下生長(zhǎng)良好，在pH2. 5環(huán)境下存活良好；(2)在體外含鉛培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)鉛離子有良好的耐受能力；(3)在體外含鉛水溶液中孵育，對(duì)鉛離子有良好的吸附能力；(4)具有降低鉛暴露小鼠體內(nèi)鉛含量與緩解鉛暴露小鼠鉛毒性的作用。本發(fā)明還涉及所述的植物乳桿菌CCFM8661在制備緩解鉛中毒的藥物組合物與發(fā)酵食品中的用途。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的藥物組合物是由植物乳桿菌CCFM8661 菌劑與在藥學(xué)上可接受的載體組成的。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的植物乳桿菌CCFM8661菌劑是將含有所述植物乳桿菌CCFM8661的菌液通過(guò)常規(guī)冷凍干燥工藝或其它工藝制備所得到的粉劑， 它含有106CFU/g以上的活性植物乳桿菌CCFM8661。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在藥學(xué)上可接受的載體是一種或多種選自在藥學(xué)上通常使用的填充劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑或矯味劑的載體。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的藥物組合物是顆粒劑、膠囊劑、片劑、 丸劑或口服液劑型。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的發(fā)酵食品是使用含有植物乳桿菌 CCFM8661囷種的發(fā)酵劑生廣的乳制品、 制品與果蔬制品。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的發(fā)酵劑是通過(guò)下述制備步驟得到的Α、培養(yǎng)基的制備使用以所述培養(yǎng)基總重量計(jì)87. 7%水將10%酶水解脫脂乳、
O.5%葡萄糖、I. 5%胰蛋白胨與O. 3%酵母浸膏溶解，然后調(diào)整其pH為6. 8，這樣得到所述的培養(yǎng)基；B、保護(hù)劑的制備使用水與保護(hù)劑原料混合制備得到含有100g/L脫脂奶粉、 30mL/L甘油、100g/L麥芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸鈉的保護(hù)劑；C、將植物乳桿菌CCFM8661菌種按照以所述培養(yǎng)基的重量計(jì)2_4%接種量接種到在溫度110-120°C下滅菌8-12min的所述培養(yǎng)基中，在溫度37°C的條件下培養(yǎng)18h，用 PH7. 2磷酸鹽緩沖液清洗2-4次，用所述保護(hù)劑重懸達(dá)到濃度101(lCFU/ml ;接著，讓該懸浮液在溫度37°C的條件下預(yù)培養(yǎng)60min，再進(jìn)行冷凍干燥得到所述的發(fā)酵劑。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的乳制品是牛奶、酸奶油或干酪；所述的豆制品是豆奶、豆豉或豆醬；所述的果蔬制品是黃瓜、胡蘿卜、甜菜、芹菜或圓白菜制品。下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。本發(fā)明涉及一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) CCFM8661,該菌菌株已于2011年11月29日在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏號(hào)為CGMCC No. 5494。本發(fā)明人根據(jù)下述篩選標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)大量篩選實(shí)驗(yàn)與分析驗(yàn)證，從我國(guó)傳統(tǒng)食品，例如泡菜，發(fā)酵奶酒中篩選出的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) CCFM8661具有下述性質(zhì)(I)具有耐酸性，在pH3. 0-9. O環(huán)境條件下生長(zhǎng)良好，在pH2. 5環(huán)境下存活良好；(2)在體外含鉛培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)鉛離子有較好的耐受能力；(3)在體外含鉛水溶液中孵育，對(duì)鉛離子有良好的吸附能力；(4)具有降低鉛暴露小鼠體內(nèi)鉛含量與緩解鉛暴露小鼠鉛毒性的作用。下面將詳細(xì)描述這些實(shí)驗(yàn)與分析認(rèn)證結(jié)果。I、具有耐酸性，在pH3. 0-9. O環(huán)境條件下生長(zhǎng)良好，在pH2. 5環(huán)境下存活良好將冷凍保存的本發(fā)明植物乳桿菌CCFM8661接種于MRS培養(yǎng)基(例如青島海博生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品)中，在溫度37°C的條件下培養(yǎng)24h，再經(jīng)MRS培養(yǎng)液傳代培養(yǎng) 2 3次后，取ImL植物乳桿菌CCFM8661培養(yǎng)液，分別接種于19mL不同pH值(3. 0-9. O) 的MRS液體培養(yǎng)基中，在溫度37°C的條件下培養(yǎng)24h，測(cè)定初始和培養(yǎng)結(jié)束后的OD6tltl值，利用這個(gè)值測(cè)量在細(xì)菌培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度，從而估計(jì)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。OD6tltl值是采用分光光度法在波長(zhǎng)600nm處測(cè)定的細(xì)菌培養(yǎng)液的吸光值，它通常用于表示在細(xì)菌培養(yǎng)液中細(xì)胞濃度，以確定液體培養(yǎng)物中細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。這些試驗(yàn)結(jié)果證明，植物乳桿菌CCFM8661在 PH3. 0-9. O的環(huán)境中生長(zhǎng)良好，因此得以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用與前面所述的同樣培養(yǎng)方式培養(yǎng)得到植物乳桿菌CCFM8661培養(yǎng)物。其菌體用I. OmL pH7. 2PBS (磷酸鹽緩沖液)清洗兩次，再用I. OmL pH7. 2磷酸鹽緩沖液重懸，其重懸液與9. OmL pH 2. 5人工胃液混合，然后在溫度37°C的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，分別在開(kāi)始(Oh) 和3h時(shí)取樣，用MRS瓊脂培養(yǎng)基澆注培養(yǎng)進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，測(cè)定活菌數(shù)并計(jì)算其存活率。 存活率是在該培養(yǎng)液中在第3h時(shí)的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值與在第Oh時(shí)活菌數(shù)對(duì)數(shù)值之比，以％表示。本發(fā)明篩選存活率在80%以上的菌株進(jìn)行后續(xù)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，植物乳桿菌CCFM8661在pH2. 5的人工胃液環(huán)境中的存活率在90% 以上。由此可見(jiàn)，植物乳桿菌CCFM8661具有耐酸性，在pH2. 5的環(huán)境下存活良好。2、在體外含鉛培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)鉛離子有良好的耐受能力通過(guò)乳桿菌在不同鉛含量培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線可以研究其在體外對(duì)鉛離子的耐受能力。在無(wú)菌條件下，向IL水中加入O. 20g氯化鉛，即得到濃度為150mg/L的鉛離子水溶液。使用這種鉛離子水溶液溶解MRS固體培養(yǎng)基干粉得到含150mg/L鉛離子的MRS液體培養(yǎng)基。同樣地，分別配制50mg/L、500mg/L鉛離子濃度的MRS液體培養(yǎng)基。按照以含鉛離
5子的MRS液體培養(yǎng)基重量計(jì)2 %接種量將進(jìn)入穩(wěn)定期的植物乳桿菌CCFM8661菌液接種于所述含鉛離子的MRS液體培養(yǎng)基中。在其培養(yǎng)過(guò)程中，分別在0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、20h、 24h時(shí)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)，從而得到如附圖I所示的植物乳桿菌CCFM8661生長(zhǎng)曲線。附圖I的結(jié)果表明，本發(fā)明植物乳桿菌CCFM8661對(duì)鉛離子的具有良好的耐受能力。3、在體外含鉛水溶液中孵育，對(duì)鉛離子有良好的吸附能力在無(wú)菌條件下，按照耐酸性(在pH3. O能夠生長(zhǎng))的篩選標(biāo)準(zhǔn)，從我國(guó)傳統(tǒng)食品，例如泡菜，發(fā)酵奶酒中篩選出7株乳酸菌。這7株乳酸菌及作為對(duì)照菌株的I株大腸桿菌、I株枯草芽孢桿菌進(jìn)行了純化和活化培養(yǎng)。將上述菌株轉(zhuǎn)移至150mg/L鉛溶液中， 使菌體最終濃度達(dá)到lg/L。將含有上述菌株的樣品在37°C下培養(yǎng)lh，使用Beckman離心機(jī)以6000r/min離心20min,再用無(wú)菌水洗漆、離心一次。分離除去上清液，向得到的菌體中加入純硝酸，放入微波消解爐中消解20min，得到的消解液使用原子吸收光譜分析儀(Spectr AA 220, Varian, USA),按照 Yeager 等人所述方法(Yeager D. ff. , Cholak J., Henderson E.W.Determination of lead in biological and related materials by atomic absorption spectrometry. Environmental Science and Technology 1971 ；5 1020-1022.)測(cè)定鉛離子含量，以確定各菌株對(duì)鉛離子的吸附能力。這些測(cè)定結(jié)果列于附圖 2中。附圖2清楚地表明，與其它試驗(yàn)菌株和對(duì)照菌株相比，本發(fā)明植物乳桿菌 CCFM8661對(duì)鉛離子的吸附量最大，因此，對(duì)鉛離子具有良好的吸附能力。4、對(duì)鉛暴露小鼠具有緩解鉛毒性的效應(yīng)取20_25g健康雄性昆明小鼠40只，隨機(jī)分為4組陰性對(duì)照組，醋酸鉛模型對(duì)照組，植物乳桿菌CCFM8661治療組與依地酸二鈉鈣陽(yáng)性治療對(duì)照組。陰性對(duì)照組進(jìn)水為普通飲用水；其余3組的進(jìn)水為lg/L醋酸鉛溶液，在造成鉛暴露染毒模型后，植物乳桿菌 CCFM8661治療組每日灌喂本說(shuō)明書(shū)實(shí)施例3制備的濃度2. OX 109cfu/mLCCFM8661脫脂乳懸液，陽(yáng)性對(duì)照治療組每日腹腔注射5g/L依地酸二鈉鈣藥劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取血并處死小鼠，分別取肝、胃、腎，在按照與前面所述的相同消化處理后，采用上述Yeager等人描述的原子吸收分光光度法測(cè)定鉛含量。這些測(cè)定結(jié)果列于附圖3中。通過(guò)對(duì)鉛暴露染毒模型組及共同喂食鉛及植物乳桿菌CCFM8661組小鼠體內(nèi)血液、肝臟、腎臟、胃中的鉛含量，以及機(jī)體抗氧化指標(biāo)(SOD、MDA)的比較，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明植物乳桿菌CCFM8661能夠降低小鼠血液、肝臟、腎臟、胃中的鉛含量，并顯著改善小鼠機(jī)體的抗氧化指標(biāo)。環(huán)境中的鉛通常經(jīng)食物和呼吸途徑進(jìn)入人體，對(duì)消化、神經(jīng)、呼吸和免疫系統(tǒng)造成急性或慢性毒性影響，往往導(dǎo)致腸絞痛、貧血和肌肉癱瘓等病癥，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生腦病，甚至導(dǎo)致死亡。因此，通常根據(jù)職業(yè)性慢性鉛中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)GBZ37-2002確定人體是否鉛中毒。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“緩解鉛毒性”應(yīng)該理解是能夠使機(jī)體內(nèi)的鉛中毒現(xiàn)象減輕或消失的過(guò)程。依據(jù)衛(wèi)生部在2003年頒布的《保健食品檢驗(yàn)和評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究證明，使用含有本發(fā)明植物乳桿菌CCFM8661菌劑的藥物組合物能夠降低鉛中毒小鼠的血、肝臟、腎組織中的鉛含量，緩解機(jī)體氧化應(yīng)激減輕鉛中毒小鼠的病理癥狀，提高小鼠體內(nèi)谷胱甘肽含量，降低丙二醛含量，具有促進(jìn)排鉛的保健功能。
研究結(jié)果表明，本發(fā)明的植物乳桿菌CCFM8661具有下述性能(I)具有耐酸性，在pH3. 0-9. O環(huán)境條件下生長(zhǎng)良好，在pH2. 5環(huán)境下存活良好；(2)在體外含鉛培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)鉛離子有良好的耐受能力；(3)在體外含鉛水溶液中孵育，對(duì)鉛離子有良好的吸附能力；(4)具有降低鉛暴露小鼠體內(nèi)鉛含量與緩解鉛暴露小鼠鉛毒性的作用。本發(fā)明的植物乳桿菌CCFM8661具有下述生物學(xué)特性菌體特征呈革蘭氏染色陽(yáng)性，細(xì)胞桿狀，菌體約O. 5-1. O μ m寬，2-4 μ m長(zhǎng)，成單、 成對(duì)或者成鏈，不形成芽孢，兩端圓形。菌落特征在MRS培養(yǎng)基上形成明顯的菌落，直徑在O. 3-2. Omm之間，圓形，邊緣整齊，乳白色，不透明，表面濕潤(rùn)光滑，不產(chǎn)生色素。生長(zhǎng)特性該菌株的最低生長(zhǎng)溫度為20°C，最高生長(zhǎng)溫度為40°C，在溫度30_37°C 下生長(zhǎng)最佳，最高和最低初始生長(zhǎng)pH為9. O和2. 5，最適生長(zhǎng)初始pH為6. O ;本發(fā)明植物乳桿菌CCFM8661菌株的延遲期相對(duì)較短，4h左右開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12h就達(dá)到穩(wěn)定期。本發(fā)明植物乳桿菌保存方法所述植物乳桿菌CCFM8661原始菌種在溫度_75°C下以30%重量百分?jǐn)?shù)的甘油懸液形式保存，或者在溫度4°C下以冷凍干燥菌粉的形式保存?zhèn)溆?。本發(fā)明植物乳桿菌CCFM8661培養(yǎng)方法與培養(yǎng)條件在MRS培養(yǎng)基中在兼性厭氧條件與溫度37°C的條件下培養(yǎng)18-36h即可使用。本發(fā)明還涉及所述的植物乳桿菌CCFM8661在制備緩解鉛毒性的藥物組合物與發(fā)酵食品中的用途。所述的藥物組合物是植物乳桿菌CCFM8661菌劑與在藥學(xué)上可接受的載體組成的。根據(jù)本發(fā)明，所述的植物乳桿菌CCFM8661菌劑是采用通常的冷凍干燥制備技術(shù)將含有所述的植物乳桿菌的菌液制成的凍干粉劑，或是采用其它方法如噴霧干燥法制備得到的粉劑。所述的植物乳桿菌CCFM8661菌劑含有106CFU/mL以上的活性植物乳桿菌 CCFM8661。植物乳桿菌CCFM8661含量測(cè)定方法是本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的MRS平板菌落計(jì)數(shù)法。在所述的藥物組合物中，所述植物乳桿菌CCFM8661菌劑的量是所述藥物組合物重量的15-35%，優(yōu)選地是18-32%，更優(yōu)選地是20-30 %。根據(jù)本發(fā)明，在藥學(xué)上可接受的載體應(yīng)該是指在藥學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)藥物載體，例如是一種或多種選自在藥學(xué)上通常使用的填充劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑或矯味劑的載體。根據(jù)本發(fā)明，所述的填充劑應(yīng)該理解是用來(lái)增加片劑重量和體積而便于壓片的輔料稀釋劑；或者應(yīng)該理解是用以吸收原料中多余液體成分的輔料吸收劑。所述的填充劑選自淀粉、蔗糖、乳糖、硫酸鈣或微晶纖維素。優(yōu)選地，所述的填充劑選自淀粉、蔗糖或微晶纖維素。更優(yōu)選地，所述的填充劑選自淀粉或微晶纖維素。
根據(jù)本發(fā)明，所述的潤(rùn)濕劑應(yīng)該理解是藥物本身無(wú)粘性，但可潤(rùn)濕其藥物原輔料并誘發(fā)其粘性而制成顆粒的液體。所述的潤(rùn)濕劑選自水、乙醇、淀粉或糖漿。優(yōu)選地，所述的潤(rùn)濕劑選自水、乙醇或淀粉。本發(fā)明使用潤(rùn)濕劑的量是以所述藥物組合物總重量計(jì)O. 1-3. 0%。根據(jù)本發(fā)明，所述的粘合劑應(yīng)該理解是當(dāng)原料藥物本身無(wú)粘性或粘性不足時(shí)，需加入粘性物質(zhì)以便于制粒，這種粘性物質(zhì)稱為粘合劑。所述的粘合劑選自纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠或聚乙烯吡咯烷酮。優(yōu)選地，所述的粘合劑選自纖維素衍生物、明膠或聚乙烯吡咯烷酮。更優(yōu)選地，所述的粘合劑選自明膠或聚乙烯吡咯烷酮。本發(fā)明使用粘合劑的量是以所述藥物組合物總重量計(jì)O. 5-5. 0%。根據(jù)本發(fā)明，所述的崩解劑應(yīng)該理解是一種能夠加入片劑中而促進(jìn)其片劑在胃腸液中快速崩解成細(xì)小粒子的輔料。人們知道，片劑經(jīng)過(guò)壓縮后的硬度大，如果其中不含有可以促進(jìn)崩解作用的輔料，它在胃腸道中崩解很慢，影響療效。所述的崩解劑選自羧甲基淀粉鈉、羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素、瓊脂、碳酸鈣或碳酸氫鈉。優(yōu)選地，所述的崩解劑選自羧甲基淀粉鈉、羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素、瓊脂或碳酸氫鈉。更優(yōu)選地，所述的崩解劑選自羧甲基淀粉鈉、羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素或碳酸氫鈉。本發(fā)明使用崩解劑的量是以所述藥物組合物總重量計(jì)5. 0-15. 0%。根據(jù)本發(fā)明，所述的潤(rùn)滑劑應(yīng)該理解是一種有利于提高片劑在制粒過(guò)程中的流動(dòng)性，防止片劑材料粘附在制片機(jī)模子上，有利于片劑脫模的化學(xué)物質(zhì)。所述的潤(rùn)滑劑選自滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、微粉硅膠或聚乙二醇。優(yōu)選地，所述的潤(rùn)滑劑選自滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂或聚乙二醇。更優(yōu)選地，所述的潤(rùn)滑劑選自滑石粉或硬脂酸鈣。本發(fā)明使用潤(rùn)滑劑的量是以所述藥物組合物總重量計(jì)O. 5-3. 0%。根據(jù)本發(fā)明，所述的矯味劑應(yīng)該理解是在藥品中用以改善或屏蔽藥物不良?xì)馕逗臀兜?，使病人難以覺(jué)察藥物強(qiáng)烈苦味或其它異味，例如辛辣、刺激等的藥用輔料。所述的矯味劑例如選自單糖漿、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖漿或櫻桃糖漿的甜味劑；檸檬、茴香或薄荷油的芳香劑；海藻酸鈉、阿拉伯膠、明膠、甲基纖維素或羧甲基纖維素鈉的膠漿劑；檸檬酸、酒石酸與碳酸氫鈉混合物的泡騰劑。優(yōu)選地，所述的矯味劑選自單糖漿、蔗糖、橙皮糖漿或櫻桃糖漿的甜味劑；檸檬或薄荷油的芳香劑；海藻酸鈉、阿拉伯膠、明膠或羧甲基纖維素鈉的膠漿劑；酒石酸與碳酸氫鈉混合物的泡騰劑。更優(yōu)選地，所述的矯味劑選自蔗糖、橙皮糖漿或櫻桃糖漿的甜味劑；檸檬油芳香劑；海藻酸鈉或阿拉伯膠的膠漿劑；酒石酸與碳酸氫鈉混合物的泡騰劑。本發(fā)明使用矯味劑的量是以所述藥物組合物總重量計(jì)O. 5% -2. 0%。本發(fā)明的植物乳桿菌CCFM8661菌劑可以與在藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑組合制成各種劑型，例如顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑或口服液，其中在藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑可以根據(jù)不同劑型進(jìn)行選擇，所使用的這些載體或賦形劑及其用量對(duì)于制藥技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都是容易確定的，也是顯而易見(jiàn)的。在本發(fā)明中，采用制藥技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的普遍使用的方法和設(shè)備制備本發(fā)明藥物顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑或口服液。所述的“劑型”一般應(yīng)該理解是適用于人的單劑量藥物形式，單個(gè)劑型含有為達(dá)到所需藥量的預(yù)定活性物質(zhì)，例如本發(fā)明的植物乳桿菌CCFM8661菌劑。在本發(fā)明中，所述的發(fā)酵食品是使用含有植物乳桿菌CCFM8661菌種的發(fā)酵劑生廣的乳制品、 制品與果蔬制品。。所述發(fā)酵劑的制備方法如下Α、培養(yǎng)基的制備使用以所述培養(yǎng)基總重量計(jì)87. 7%水將10%酶水解脫脂乳、
O.5%葡萄糖、I. 5%胰蛋白胨與O. 3%酵母浸膏溶解，然后調(diào)整其pH為6. 8，這樣得到所述的培養(yǎng)基；B、保護(hù)劑的制備使用水與保護(hù)劑原料制備得到含有100g/L脫脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麥芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸鈉的保護(hù)劑；C、將植物乳桿菌CCFM8661按照以所述培養(yǎng)基的重量計(jì)2_4%接種量接種到在溫度110-120°C下滅菌8-12min的所述培養(yǎng)基中，然后在溫度37°C的條件下培養(yǎng)18h，用 PH7. 2磷酸鹽緩沖液清洗2-4次，用所述保護(hù)劑重懸達(dá)到濃度101(lCFU/ml ;接著，讓該懸浮液在溫度37°C的條件下預(yù)培養(yǎng)60min，再采用凍干法制成所述的發(fā)酵劑。所述的乳制品是牛奶、酸奶油或干酪。在本發(fā)明中，所述的牛奶應(yīng)該理解是牛乳、馬乳或還原乳。所述的還原乳是用以還原乳總重量計(jì)10-15%奶粉與85-90%軟化水配制的。所述的奶粉是目前市場(chǎng)上廣泛銷售的產(chǎn)品。所述的酸奶油是稀奶油經(jīng)乳酸菌發(fā)酵制成的奶油。酸奶油比甜奶油有更多的優(yōu)越性，香味更濃郁，奶油產(chǎn)量也更高；另外由于乳酸菌抑制了有害微生物，所以消毒殺菌后再次污染微生物的風(fēng)險(xiǎn)也較低。所述的干酪是由牛奶經(jīng)發(fā)酵制成的一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的食品。所述的豆制品是豆奶、豆豉或豆醬。它們都是我國(guó)的傳統(tǒng)食品或調(diào)味品。所述的果蔬制品是黃瓜、胡蘿卜、甜菜、芹菜或圓白菜制品。在生產(chǎn)乳制品、豆制品與果蔬制品時(shí)，按照下述方法使用本發(fā)明的植物乳桿菌 CCFM8661菌劑發(fā)酵劑通常，在生產(chǎn)乳制品、豆制品和果蔬制品的常規(guī)生產(chǎn)過(guò)程中，把本發(fā)明的植物乳桿菌CCFM8661菌劑發(fā)酵劑按照常規(guī)使用量接種到待處理的原料中，在能夠使所述植物乳桿菌CCFM8661繁殖的溫度、壓力下進(jìn)行發(fā)酵或存活，其代謝產(chǎn)物使發(fā)酵制品具有一定的酸度、香味等優(yōu)異特性，同時(shí)使產(chǎn)品延長(zhǎng)了保藏時(shí)間，改善了產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和消化性。[有益效果]本發(fā)明的植物乳桿菌CCFM8661具有耐酸性，在體外對(duì)鉛離子有良好的耐受能力， 能夠耐受起始濃度為150mg/L的鉛離子溶液。并且對(duì)鉛離子有較強(qiáng)的吸附作用，可降低小鼠血液、肝臟、腎臟、胃中的鉛含量，顯著改善小鼠機(jī)體的抗氧化指標(biāo)，緩解鉛中毒小鼠的病理癥狀。所述的植物乳桿菌CCFM8661用于制備緩解鉛中毒的藥物組合物與發(fā)酵食品，具有非常廣泛的應(yīng)用前景。

圖I是植物乳桿菌CCFM8661于含起始濃度為50mg/L，150mg/L, 500mg/L的鉛離子培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線；圖2是乳酸菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌對(duì)鉛離子的吸附情況。其中CCFM8661、14、ST_3為植物乳桿菌；2_2為加氏乳桿菌；2_3為鼠李糖乳桿菌 LGG ;22為兩歧雙歧乳桿菌；2-3為德氏乳桿菌。Bacillus subtilis (枯草芽孢桿菌)及 E. coli (大腸桿菌)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照菌株。圖3是植物乳桿菌CCFM8661對(duì)鉛暴露小鼠血液，肝臟，腎臟，胃中鉛水平的降低作用；a, b，c，d表示不同字母所代表的組別都存在顯著性差異(P < O. 05)。
具體實(shí)施方式實(shí)施例I :植物乳桿菌CCFM8661對(duì)鉛離子的耐受能力實(shí)驗(yàn)在無(wú)菌條件下，向IL水中加入O. 20g氯化鉛，得到150mg/L的鉛離子水溶液。使用這種鉛離子水溶液溶解MRS培養(yǎng)基固體配料，得到含150mg/L鉛離子的MRS液體培養(yǎng)基。 MRS培養(yǎng)基是本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的培養(yǎng)基，它含有胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、醋酸鈉、檸檬酸二銨、吐溫80、硫酸鎂、硫酸錳，pH 6. 2 6. 4。以與前面描述的同樣方式配制含有50mg/L與500mg/L鉛離子濃度的MRS液體培養(yǎng)基。將進(jìn)入穩(wěn)定期的植物乳桿菌CCFM8661按照以含鉛的MRS液體培養(yǎng)基重量計(jì)2%接種量接種于所述的含鉛MRS液體培養(yǎng)基中，在溫度37°C的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，分別在0h、2h、 4h、6h、8h、12h、16h、20h、24h時(shí)取樣，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)，得到如附圖I所示的植物乳桿菌 CCFM8661生長(zhǎng)曲線。另外，將ImL所述的菌液接入不含鉛的MRS液體培養(yǎng)基中，在同樣條件下進(jìn)行培養(yǎng)并計(jì)數(shù)，其結(jié)果作為空白對(duì)照結(jié)果，這些試驗(yàn)結(jié)果也列于附圖I中。由附圖I可以看出，在150mg/L鉛離子濃度下，植物乳桿菌CCFM8661雖然在開(kāi)始時(shí)生長(zhǎng)受到抑制，但隨后其生長(zhǎng)量迅速增加，在24h時(shí)生長(zhǎng)量甚至超過(guò)了空白對(duì)照組，因此，其結(jié)果表明植物乳桿菌CCFM8661對(duì)鉛離子具有良好的耐受能力。實(shí)施例2 :植物乳桿菌CCFM8661對(duì)鉛離子的吸附能力實(shí)驗(yàn)按照耐酸性(在pH3. O環(huán)境中能夠生長(zhǎng))的篩選標(biāo)準(zhǔn)，從我國(guó)傳統(tǒng)食品，例如泡菜，發(fā)酵奶酒中篩選出7株乳酸菌，將這7株乳酸菌與作為對(duì)照菌株的I株大腸桿菌和I 株枯草芽孢桿菌在無(wú)菌條件下進(jìn)行純化和活化，純化和活化時(shí)乳酸菌使用MRS培養(yǎng)基，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌使用LB培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基是本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的培養(yǎng)基，它含有胰蛋白胨、酵母浸膏、NaCl、瓊脂，pH7.0。另外，所述的大腸桿菌和枯草芽孢桿菌還需置于搖床中在溫度37°C的條件下分別進(jìn)行好氧培養(yǎng)12h和16h。將這些活化菌液振蕩均勻，以轉(zhuǎn)速6000r/min進(jìn)行離心15min。得到的菌體轉(zhuǎn)移到裝有150mg/L鉛離子濃度溶液的容器中，而空白組則轉(zhuǎn)移到去離子水中。根據(jù)菌體質(zhì)量確定藍(lán)蓋瓶中液體的體積，使菌體的最終濃度達(dá)到lg/L。將以上樣品于溫度37°C下培養(yǎng)lh。使用Beckman離心機(jī)以轉(zhuǎn)速6000r/min離心20min,再用無(wú)菌水洗漆、離心一次。分離除去上清液，向得到的菌體中加入純硝酸，放入微波消解爐中消解20min，得到的消解液使用原子吸收光譜分析儀(Spectr AA 220, Varian, USA)按照 Yeager 等人所述方法(Yeager D. ff. , Cholak J., Henderson E. ff. Determination of lead in biological and related materials by atomic absorption spectrometry. Environmental Science and Technology 1971 ；5 1020-1022.)測(cè)定鉛離子含量，以確定不同菌株吸附鉛離子的能力。其試驗(yàn)結(jié)果如附圖2所示。由附圖2可以看出，不同的菌種對(duì)鉛離子的吸附能力差異較大。其中植物乳桿菌CCFM8661的吸附能力最強(qiáng)，可吸附4955. I μ g/g鉛離子，而大腸桿菌對(duì)鉛離子的吸附能力較差，只能吸附398 μ g/g的鉛離子，其吸附能力遠(yuǎn)低于本發(fā)明的植物乳桿菌CCFM8661。實(shí)施例3 :植物乳桿菌CCFM8661灌喂小鼠的耐受劑量實(shí)驗(yàn)將植物乳桿菌CCFM8661凍干菌粉重懸于脫脂乳粉中，制成濃度為2. O X 109cfu/mL 的懸液。取約20g健康雄性昆明小鼠10只，每日給予該濃度懸液灌胃一次，觀察一周，記錄死亡和體重情況。這些試驗(yàn)結(jié)果列于表I中。表I :喂食濃度2. OX 109cfu/mL的植物乳桿菌CCFM8661對(duì)小鼠體重的變化情況
時(shí)間(天)I234567體重(g) 死亡情況21.2±1.521.9±2.122.5±2.223.5±2.124.2±1.924.9±1.925.7±1.8注_:小鼠無(wú)死亡表I中的這些結(jié)果表明，喂食濃度2. OX 109cfu/mL的植物乳桿菌CCFM8661未對(duì)小鼠造成明顯影響，體重明顯上升，無(wú)死亡現(xiàn)象產(chǎn)生。小鼠外觀無(wú)明顯病理癥狀。實(shí)施例4 :植物乳桿菌CCFM8661對(duì)鉛暴露小鼠體內(nèi)鉛水平的降低作用取20_25g健康雄性昆明小鼠40只，隨機(jī)分為4組陰性對(duì)照組，醋酸鉛模型對(duì)照組，植物乳桿菌CCFM8661治療組與依地酸二鈉鈣陽(yáng)性治療對(duì)照組。陰性對(duì)照組進(jìn)水為普通飲用水；其余3組的進(jìn)水為lg/L醋酸鉛溶液。在造成鉛暴露染毒模型后，植物乳桿菌 CCFM8661治療組小鼠每日灌喂實(shí)施例3制備的濃度2. O X 109cfu/mLCCFM8661脫脂乳懸液， 陽(yáng)性對(duì)照治療組小鼠每日腹腔注射5g/L依地酸二鈉鈣藥劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取血并處死小鼠， 分別取肝、胃、腎，采用實(shí)施例I描述的消化方法進(jìn)行消化后，按照實(shí)施例2采用的原子吸收分光光度法測(cè)定其鉛含量。這些試驗(yàn)結(jié)果如附圖3所示。由附圖3可以看出，本發(fā)明的植物乳桿菌CCFM8661 治療組和依地酸二鈉鈣陽(yáng)性治療對(duì)照組中小鼠血液、肝臟、胃、腎臟中的鉛含量均比陰性對(duì)照組高，但均低于鉛模型對(duì)照組。本發(fā)明植物乳桿菌CCFM8661治療組相對(duì)于鉛模型對(duì)照組，其血液及各器官中的鉛含量明顯低，均具有顯著性(P <0.05)，這也說(shuō)明植物乳桿菌 CCFM8661干預(yù)確實(shí)具有降低鉛暴露小鼠體內(nèi)鉛含量的作用。實(shí)施例5 :植物乳桿菌CCFM8661對(duì)鉛暴露導(dǎo)致氧化損傷的恢復(fù)作用
取20_25g的健康雄性昆明小鼠40只，隨機(jī)分為4組陰性對(duì)照組，醋酸鉛模型對(duì)照組，本發(fā)明植物乳桿菌CCFM8661治療組與依地酸二鈉鈣鹽(EDTANa2Ca)陽(yáng)性治療對(duì)照組。陰性對(duì)照組進(jìn)水為普通飲用水；其余3組的進(jìn)水為lg/L醋酸鉛溶液，在造成鉛染毒模型后，本發(fā)明植物乳桿菌CCFM8661治療組每日灌喂實(shí)施例3制備的濃度2. O X 109cfu/mL的 CCFM8661脫脂乳懸液，陽(yáng)性對(duì)照治療組每日腹腔注射5g/L依地酸二鈉鈣鹽藥劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取血并處死小鼠，取肝，采用Ellmam的方法(ElImam, G. C. Tissue sulfhydryl groups. Archives of biochemistry and biophysics 82(1) :70-77.)及南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的丙二醛試劑盒測(cè)定谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的水平。這些試驗(yàn)結(jié)果列于下表2中。表2 :本發(fā)明植物乳桿菌CCFM8661對(duì)鉛中毒導(dǎo)致氧化損傷的恢復(fù)作用
權(quán)利要求
1.一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) CCFM8661,該菌株已于 2011 年 11 月 29日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心保藏，其保藏號(hào)為CGMCC 5494。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的植物乳桿菌CCFM8661，其特征在于它具有下述性質(zhì)(1)具有耐酸性，在PH3.0-9. O環(huán)境條件下生長(zhǎng)良好，在pH2. 5環(huán)境下存活良好；(2)在體外含鉛培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)鉛離子有良好的耐受能力；(3)在體外含鉛水溶液中孵育，對(duì)鉛離子有良好的吸附能力；(4)具有降低鉛暴露小鼠體內(nèi)鉛含量與緩解鉛暴露小鼠鉛毒性的作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的植物乳桿菌CCFM8661在制備緩解鉛毒性的藥物組合物與發(fā)酵食品中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述的藥物組合物是由植物乳桿菌 CCFM8661菌劑與在藥學(xué)上可接受的載體組成的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述的植物乳桿菌CCFM8661菌劑是將含有所述植物乳桿菌CCFM8661的菌液通過(guò)常規(guī)冷凍干燥工藝或其它工藝制備所得到的粉劑， 它含有106CFU/g以上的活性植物乳桿菌CCFM8661。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于在藥學(xué)上可接受的載體是一種或多種選自在藥學(xué)上通常使用的填充劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑或矯味劑的載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的用途，其特征在于所述的藥物組合物是顆粒劑、膠囊劑、 片劑、丸劑或口服液劑型。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述的發(fā)酵食品是使用含有植物乳桿菌 CCFM8661囷種的發(fā)酵劑生廣的乳制品、 制品與果蔬制品。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于所述的發(fā)酵劑是通過(guò)下述制備步驟得到的Α、培養(yǎng)基的制備使用以所述培養(yǎng)基總重量計(jì)87. 7%的水將10%酶水解脫脂乳、 O. 5%葡萄糖、I. 5%胰蛋白胨與O. 3%酵母浸膏溶解，然后調(diào)整其pH為6. 8，這樣得到所述的培養(yǎng)基；B、保護(hù)劑的制備使用水與保護(hù)劑原料混合制備得到含有100g/L脫脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麥芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸鈉的保護(hù)劑；C、將植物乳桿菌CCFM8661菌種按照以所述培養(yǎng)基的重量計(jì)2_4%接種量接種到在溫度110-120°C下滅菌8-12min的所述培養(yǎng)基中，然后在溫度37°C的條件下培養(yǎng)18h，用 PH7. 2磷酸鹽緩沖液清洗2-4次，用所述的保護(hù)劑重懸達(dá)到濃度101(lCFU/ml ;接著，讓該懸浮液在溫度37°C的條件下預(yù)培養(yǎng)60min，再進(jìn)行冷凍干燥得到所述的發(fā)酵劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于所述的乳制品是牛奶、酸奶油或干酪；所述的豆制品是豆奶、豆豉或豆醬；所述的果蔬制品是黃瓜、胡蘿卜、甜菜、芹菜或圓白菜制品O
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能夠緩解鉛毒性的植物乳桿菌及其用途。本發(fā)明的植物乳桿菌CCFM8661具有耐酸性，在體外對(duì)鉛離子有良好的耐受能力，能夠耐受起始濃度為150mg/L的鉛離子溶液，并且對(duì)鉛離子有較強(qiáng)的吸附作用，能降低鉛暴露小鼠血液、肝臟、腎臟、胃中的鉛含量，顯著改善鉛暴露小鼠機(jī)體的抗氧化指標(biāo)，緩解鉛暴露小鼠的病理癥狀。所述的植物乳桿菌CCFM8661用于制備緩解鉛毒性的藥物組合物與發(fā)酵食品，具有非常廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A23C13/16GK102586148SQ20121004632
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月28日
發(fā)明者劉小鳴, 宋元達(dá), 張灝, 張秋香, 王剛, 田豐偉, 翟齊嘯, 范大明, 趙建新, 郭敏, 陳衛(wèi) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)