專利名稱：一種與鴨生長(zhǎng)和屠宰性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于畜禽基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與鴨生長(zhǎng)和屠宰性狀相關(guān)的分子標(biāo)記、其制備方法及應(yīng)用，該分子標(biāo)記可應(yīng)用于鴨標(biāo)記輔助選擇育種。
背景技術(shù)：
鴨肉屬紅肉，低膽固醇，低脂肪，高蛋白含量，具有更高的營養(yǎng)價(jià)值，在歐美日等國，屬高檔肉類，價(jià)格昂貴；在國內(nèi)，人們的飲食觀念正在發(fā)生著變化，隨著肉鴨烹飪水平不斷提高，鴨肉消費(fèi)呈上升趨勢(shì)。培育生長(zhǎng)速度快、肉質(zhì)優(yōu)良的鴨品種是滿足消費(fèi)者對(duì)鴨肉需求增長(zhǎng)的有效途徑。生長(zhǎng)性狀和屠宰性狀均屬于數(shù)量性狀，由多基因控制。根據(jù)表型生長(zhǎng)性狀進(jìn)行選擇雖然取得了較大的遺傳進(jìn)展，但是隨著表型值的提高，通過直接表型選擇進(jìn)一步提高鴨生長(zhǎng)速度取得的遺傳進(jìn)展有限，而且表型選擇存在遺傳改良時(shí)距長(zhǎng)的缺點(diǎn)，抑制了鴨生長(zhǎng)速度改良的遺傳進(jìn)展。另外，有研究表明，隨著生長(zhǎng)速度的提高，鴨肉品質(zhì)存在下降的趨勢(shì)，主要表現(xiàn)在肌內(nèi)脂肪含量下降、水分含量上升，鴨生長(zhǎng)速度和肌肉品質(zhì)性狀間存在負(fù)相關(guān)。因此，如何在進(jìn)一步提高鴨生長(zhǎng)速度的同時(shí)，使肌肉品質(zhì)保持在一定水平，是目前亟需解決的問題。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們可以通過尋找控制生長(zhǎng)或肉質(zhì)性狀的主基因(major gene) 或與其連鎖的分子標(biāo)記，從而通過分子標(biāo)記實(shí)施早期選擇及間接選擇。同時(shí)，基因的多效性也決定了通過基因型的選擇達(dá)到選擇鴨生長(zhǎng)速度的同時(shí)，使肉質(zhì)性狀保持在一定的水平具有可行性。目前，盡管在鴨肌肉生長(zhǎng)和肉質(zhì)性狀相關(guān)候選基因鑒定和應(yīng)用方面取得了一些進(jìn)展，但能夠真正用于育種實(shí)踐的影響生長(zhǎng)和肉質(zhì)的分子標(biāo)記還很有限，進(jìn)一步尋找鴨生長(zhǎng)和肉質(zhì)相關(guān)的候選基因及分子標(biāo)記是非常必要的。GH基因是位于腦垂體生長(zhǎng)通路中又一個(gè)關(guān)鍵基因，處于腦垂體生長(zhǎng)軸上游發(fā)揮作用，能促進(jìn)細(xì)胞的增生與分化、提高動(dòng)物瘦肉率以及降低脂肪沉積。到目前為止，現(xiàn)有技術(shù)沒有研究鴨GH基因功能的報(bào)道。由于生長(zhǎng)激素對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義，因此研究 GH基因在鴨生長(zhǎng)中的作用關(guān)系，并尋找其與鴨生長(zhǎng)和屠宰相關(guān)的DNA分子標(biāo)記，具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過克隆鴨GH基因部分序列(內(nèi)含子2與部分外顯子序列)， 提供一種與鴨生長(zhǎng)和屠宰性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其制備方法，從而實(shí)現(xiàn)為鴨標(biāo)記輔助育種提供分子標(biāo)記。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)—種與鴨生長(zhǎng)和屠宰性狀相關(guān)的分子標(biāo)記,它的核苷酸序列為SEQ ID N0:1。所述的與鴨生長(zhǎng)和屠宰性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，其中SEQ ID NO :1所示序列的第170位堿基處有一個(gè)C170-T170的堿基突變，導(dǎo)致BsmFI-RFLP酶切多態(tài)性。一種擴(kuò)增權(quán)利要求2所述分子標(biāo)記的引物對(duì)，它的核苷酸序列為如下所示正向引物5’ -GTACAAAGAGTTCGTAAGTGTC-3，反向引物5’ -GGGAATTTCTTTTGGTGTG-3，。一種上述與鴨生長(zhǎng)和屠宰性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的制備方法，包括如下步驟根據(jù)已克隆的鴨GH基因cDNA序列，與雞GH基因基因組序列進(jìn)行比對(duì)，劃分外顯子與內(nèi)含子區(qū)域，然后根據(jù)劃分的鴨GH基因外顯子2和外顯子3序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行鴨外顯子2、3與內(nèi)含子2序列的擴(kuò)增；對(duì)擴(kuò)增后所得目的片段進(jìn)行回收測(cè)序、查找突變位點(diǎn)與相應(yīng)的內(nèi)切酶；然后對(duì)實(shí)驗(yàn)群體每個(gè)個(gè)體的DNA進(jìn)行擴(kuò)增與酶切鑒定；最后分析酶切多態(tài)位點(diǎn)與生長(zhǎng)與屠宰性狀之間的相關(guān)性，獲得SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。所述的與鴨生長(zhǎng)和屠宰性狀相關(guān)的分子標(biāo)記可以應(yīng)用于鴨標(biāo)記輔助選擇育種中。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和顯著的進(jìn)步(I)為鴨標(biāo)記輔助育種提供了一種新的分子標(biāo)記。(2)提供了一種與鴨生長(zhǎng)和屠宰性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的制備方法及引物對(duì)，便于鴨標(biāo)記輔助育種，豐富了現(xiàn)有技術(shù)。


圖I :是本發(fā)明分子標(biāo)記的BsmF I-RFLPs的三種基因型(TT、CT、CC)電泳檢測(cè)結(jié)果圖。其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DS 2000)，1、3、7均為突變純合子個(gè)體，4、6、9、10為野生型純合子個(gè)體，5、8為雜合子個(gè)體。此檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全相符。圖2 :是本發(fā)明中鴨GH基因內(nèi)含子2區(qū)T170C多態(tài)位點(diǎn)測(cè)序峰圖。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例形式對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例IGH基因內(nèi)含子2SNP位點(diǎn)的檢測(cè)及PCR-RFLP診斷方法建立(I)引物設(shè)計(jì)根據(jù)已克隆的鴨GH基因序列(GenBank accession no. AB158760. 2)與雞GH基因基因組序列進(jìn)行比對(duì)，劃分出鴨GH基因的不同外顯子區(qū)域；根據(jù)劃分的外顯子2和外顯子 3序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增內(nèi)含子2序列，設(shè)計(jì)的引物序列如下F5’ -GTACAAAGAGTTCGTAAGTGTC-3’R5’ -GGGAATTTCTTTTGGTGTG-3’該引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度763bp。(2) PCR擴(kuò)增條件PCR 反應(yīng)總體積 15 μ I，其中鴨基因組 DNA 約 lOOng，含 I X buffer, I. 5mmol/ LMgCl2，dNTP 終濃度為 O. 25mmol/L，引物終濃度為 O. 2ymol/L，2U Taq DNA 聚合酶。PCR 擴(kuò)增程序是95°C 5min，然后再循環(huán) 34 次 94°C 30s, 53°C 35s，72°C 45s，最后 72°C延伸 lOmin。 PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并拍照。(3)PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測(cè)序
隨機(jī)抽取100個(gè)個(gè)體所提的DNA，每個(gè)樣本吸取I μ I混勻組成池DNA，以該DNA為模板，按照上述(2)中的擴(kuò)增條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。PCR產(chǎn)物的純化用凝膠回收純化試劑盒通過切膠純化PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟是在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入I. 5mL離心管中，稱重，然后向膠塊中加入3倍體積的溶膠液，70°C水浴放置10分鐘至膠完全溶解。將所得溶液加入一個(gè)吸附柱中，12，OOOrpm離心30秒，棄廢液。吸附柱放回收集管并加入700 μ L漂洗液，12000rpm離心30秒，棄廢液。再次向吸附柱中加入500 μ L漂洗液， 12000rpm離心30秒，倒掉廢液后將吸附柱放回收集管中，12，OOOrpm離心I分鐘。將吸附柱放入一干凈的離心管中，向吸附柱膜中間加入洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘后，12，OOOrpm 離心I分鐘收集純化產(chǎn)物。連接反應(yīng)將純化PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體的連接，連接反應(yīng)總體積是5 μ 1，其中包括2·5μ I 2 X buffer, O. 5 μ I的T載體，O. 5μ I的純化PCR產(chǎn)物，O. 5 μ I的T4連接酶， 最后加入I μ I滅菌水置4°C水浴過夜。感受態(tài)細(xì)胞的制備 從37°C培養(yǎng)了 16 20h的新鮮平板上挑取一個(gè)DH5 α單菌落接種于2ml LB中，于37°C振蕩培養(yǎng)3h，轉(zhuǎn)接Iml菌液于含有30ml LB的鹽水瓶中，繼續(xù)在37 °C振蕩培養(yǎng)約4h，待OD6tltl達(dá)到O. 3 O. 4時(shí)將鹽水瓶從搖床取出置冰浴冷卻10 15min，然后將菌液轉(zhuǎn)入離心管中于4°C 4，OOOg離心IOmin以收集細(xì)胞，將離心管倒置以棄凈培養(yǎng)液，用IOml冰預(yù)冷的O. lmol/L的CaCl2重懸沉淀，冰浴30min,重復(fù)4°C 4，OOOg離心IOmin —次，用4ml冰預(yù)冷的O. lmol/L的CaCl2重懸沉淀，置4°C保存?zhèn)溆谩＾D(zhuǎn)化無菌狀態(tài)下取100 120 μ I感受態(tài)細(xì)胞于I. 5ml Ependorff管中，將5 μ I 的連接產(chǎn)物加入混勻，在冰上放置30min，42°C熱激90s，其間不要搖動(dòng)Ependorff管，取出后冰浴3 4min，加入400 μ I無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)45min。取100 μ I 涂布于已提前4h涂布了 IPTG(Isopropylthio-β -D-galactoside,異丙基硫代-β -D-半乳糖苷)和X-gal的瓊脂平板上，37°C平放Ih后倒置培養(yǎng)。陽性克隆鑒定序列測(cè)定策略是每個(gè)片段均同時(shí)采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序和克隆測(cè)序兩種方法。克隆測(cè)序是挑取單個(gè)克隆子用于測(cè)序，序列測(cè)定由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。(4) SNP位點(diǎn)檢測(cè)通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI, National Center for Biotechnology Information, http://www. ncbi. nlm. nih. gov)網(wǎng)站 StJ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)軟件，將測(cè)序后獲得的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的基因序列進(jìn)行序列同源性比較，以鑒定該DNA序列是否為目的序列。利用BioEdit軟件根據(jù)測(cè)序結(jié)果的峰圖查找雙峰，出現(xiàn)雙峰即有可能該位點(diǎn)存在突變；針對(duì)突變前后的序列，利用在線軟件NBEcutter V2. O查找合適的酶切位點(diǎn)。(5) RFLP 檢測(cè)條件PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體積是10 μ 1，其中IOXbuffer I μ 1，PCR產(chǎn)物3 5 μ 1，限制性內(nèi)切酶BsmFI為101用H2O補(bǔ)足10 μ 1，將樣品混勻后離心，65°C水浴4h，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，記錄基因型，在紫外燈下拍照。送不同基因型個(gè)體進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)分析。
(6)結(jié)果與分析PCR擴(kuò)增所得的產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)均為特異的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物回收純化后克隆測(cè)序，進(jìn)行比對(duì)分析及酶切位點(diǎn)查找分析后發(fā)現(xiàn)，在所測(cè)的序列中共發(fā)現(xiàn)一個(gè)突變位點(diǎn)C —T，位于該序列第170bp處，該位點(diǎn)可被BsmF I內(nèi)切酶識(shí)別。測(cè)序結(jié)果見核苷酸序列表SEQ ID NO =I0對(duì)鴨群體進(jìn)行BsmF I-RFLP分析發(fā)現(xiàn)，在肉鴨群體中出現(xiàn)三條電泳條帶，詳見圖
I。M為Marker由廣州東盛生物科技有限公司提供，從上至下的條帶依次為100bp、250bp、 500bp、750bp、IOOObp和2000bp ;三條目的條帶由下至上分別為170bp、593bp和763bp ;結(jié)果表明，對(duì)群體中個(gè)體的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全相符，其中1、3、7均為突變純合子個(gè)體，4、6、9、10為野生型純合子個(gè)體，5、8為雜合子個(gè)體。實(shí)施例2本發(fā)明克隆的分子標(biāo)記在與鴨生長(zhǎng)和屠宰性狀關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用在由櫻桃谷鴨、荊江鴨和番鴨共393只個(gè)體組成的群體中進(jìn)行了 GH基因內(nèi)含子2 區(qū)BsmFI-RFLP與部分生長(zhǎng)和屠宰性狀的關(guān)聯(lián)分析，所分析的性狀包括0、2、4、6、8周齡重、 屠體重、全凈膛重、胸肌重、腿肌重、腹脂重、皮脂重，并計(jì)算屠宰率、全凈膛率、胸肌率、腿肌率、腹脂率、皮脂率等生長(zhǎng)和屠宰性狀?；蛐蜋z測(cè)結(jié)果表明，在檢測(cè)的393個(gè)個(gè)體重，CC基因型較少，有97個(gè)個(gè)體，TT 和CT基因型占多數(shù)，分別為157和139。不同基因型間性狀的分析結(jié)果見表1，分析結(jié)果表明，TT和CT基因型個(gè)體在4周齡體重、腹脂重、屠宰率上呈極顯著差異(P < O. 01)，CC與 TT基因型在8周齡體重、腿肌重、瘦肉率、全凈膛率和胸肌率幾個(gè)性狀上呈極顯著差異(P < O. 01)。同時(shí)，TT與CT基因型在2周齡體重、6周齡體重、屠體重、胸肌重、全凈膛重等性狀上呈顯著差異(P < O. 05)。上述分析說明該位點(diǎn)的多態(tài)性與上述性狀間存在顯著或極顯著的關(guān)聯(lián)。表IGH基因內(nèi)含子2區(qū)多態(tài)與生長(zhǎng)及屠宰性狀的關(guān)聯(lián)分析
權(quán)利要求
1.一種與鴨生長(zhǎng)和屠宰性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，它的核苷酸序列為SEQ ID N0:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的與鴨生長(zhǎng)和屠宰性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，其特征在于SEQID NO 1所示序列的第170位堿基處有一個(gè)C170 - T170的堿基突變，導(dǎo)致^s /Y-RFLP酶切多態(tài)性。
3.擴(kuò)增權(quán)利要求2所述分子標(biāo)記的引物對(duì)，它的核苷酸序列為如下所示正向引物5’ - GTACAAAGAGTTCGTAAGTGTC - 3’反向引物:5’ - gggaatttcttttggtgtg - 3’。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的分子標(biāo)記的制備方法，包括如下步驟根據(jù)已克隆的鴨GH基因cDNA序列，與雞GH基因基因組序列進(jìn)行比對(duì)，劃分外顯子與內(nèi)含子區(qū)域，然后根據(jù)劃分的鴨GH基因外顯子2和外顯子3序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行鴨外顯子2、3與內(nèi)含子2序列的擴(kuò)增；對(duì)擴(kuò)增后所得目的片段進(jìn)行回收測(cè)序、查找突變位點(diǎn)與相應(yīng)的內(nèi)切酶；然后對(duì)實(shí)驗(yàn)群體每個(gè)個(gè)體的DNA進(jìn)行擴(kuò)增與酶切鑒定；最后分析酶切多態(tài)位點(diǎn)與生長(zhǎng)與屠宰性狀之間的相關(guān)性，獲得SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
5.權(quán)利要求I或2所述的分子標(biāo)記在鴨標(biāo)記輔助選擇育種中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求3所述的引物對(duì)在鴨標(biāo)記輔助選擇育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種作為鴨標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用的與鴨生長(zhǎng)和屠宰性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。所述的分子標(biāo)記由GH基因內(nèi)含子2克隆得到，它的DNA序列如序列表SEQIDNO1所述。在序列表SEQIDNO1的第170bp處有一個(gè)C170-T170的堿基替換，將該位點(diǎn)命名為C170T，該替換導(dǎo)致BsmFI-RFLP酶切多態(tài)性。本發(fā)明還公開了擴(kuò)增GH基因部分DNA序列所用的引物以及用于多態(tài)性檢測(cè)的方法，為肉鴨的標(biāo)記輔助選擇提供了一個(gè)新的分子標(biāo)記。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102604939SQ201210046938
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月28日
發(fā)明者吳艷, 孫靜, 杜金平, 梁振華, 潘愛鑾, 申杰, 皮勁松, 蒲躍進(jìn), 陳志華 申請(qǐng)人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所