專利名稱：調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞生長(zhǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)施方案提供了在體外、體內(nèi)和先體外后體內(nèi)增加或減少造血干細(xì)胞群體的調(diào)節(jié)齊U。背景干細(xì)胞研究擁有于開(kāi)發(fā)療法的非凡潛力，所述療法可以改變患有諸如白血病、糖尿病和貧血的疾病的那些人的未來(lái)。許多研究集中于干細(xì)胞生物學(xué)作為關(guān)于疾病治療的關(guān)鍵的探究。通過(guò)干細(xì)胞在正常發(fā)育中的作用的了解，研究者尋求捕獲且指導(dǎo)干細(xì)胞的先天能力以治療許多狀況。研究在許多區(qū)域中同時(shí)進(jìn)行檢查驅(qū)動(dòng)胚胎干細(xì)胞在各種組織中發(fā)育的遺傳和分子觸發(fā)物；學(xué)習(xí)如何推動(dòng)那些細(xì)胞分裂且形成特化組織；培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞且開(kāi)發(fā)起作用的新系；尋找通過(guò)消除供體需要來(lái)消除或控制移植物抗宿主病的方法；和產(chǎn)生可普遍移植的細(xì)胞系。造血干細(xì)胞(HSCs)在胚胎發(fā)生期間在不同區(qū)域中衍生，其中特異性誘導(dǎo)事件使中胚層轉(zhuǎn)變成血液干細(xì)胞和祖先。仍需要闡明特定生物分子、化學(xué)試劑和其他因子之間在這些誘導(dǎo)事件中的關(guān)聯(lián)。例如，仍需要鑒定何種生物分子或化學(xué)試劑有希望用于處理HSC群體用于所需目的，例如增加HSC群體用于研究或治療。概述本實(shí)施方案的組合物和方法提供了 HSC調(diào)節(jié)劑，其是根據(jù)具體適應(yīng)癥所需增加HSC數(shù)目或減少HSC數(shù)目的試劑。例如，發(fā)現(xiàn)增加HSC數(shù)目的HSC調(diào)節(jié)劑包括前列腺素E2 (PGE2)和刺激PGE2途徑的試劑。相反，阻止PGE2合成的HSC調(diào)節(jié)劑減少HSC數(shù)目。一個(gè)實(shí)施方案提供了用于促進(jìn)受試者中的造血干細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其包括施用至少一種造血干細(xì)胞(HSC)調(diào)節(jié)劑和藥學(xué)上可接受的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，HSC調(diào)節(jié)劑通過(guò)修飾前列腺素途徑來(lái)增加HSCs。通過(guò)修飾前列腺素途徑來(lái)增強(qiáng)HSC群體的HSC調(diào)節(jié)劑可以是選自下述的至少一種化合物PGE2、dmPGE2、PGI2、亞油酸、13 (s)-H0DE、LY171883、Mead 酸(Mead Acid)、二十碳三烯酸、環(huán)氧二十碳三烯酸、0N0-259、Cayl039、PGE2受體激動(dòng)劑、以及這些試劑中的任何一種的衍生物。在更具體的實(shí)施方案中，HSC調(diào)節(jié)劑是選自下述的PGE2衍生物16，16_ 二甲基PGE2、19 (R)-羥基PGE2、16，16- 二甲基PGE2p- (p-乙酰氨基苯甲酰氨基)苯酯、11-脫氧-16，16- 二甲基PGE2、9-脫氧-9-亞甲基-16，16- 二甲基PGE2、9_脫氧_9_亞甲基PGE2、丁環(huán)前列素、硫前列酮、PGE2絲氨醇酰胺、PGE2甲酯、16-苯基四去甲(tetranor)PGE2、15 (S)-15-甲基 PGE2 和 15 (R)-15-甲基 PGE2。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，HSC調(diào)節(jié)劑通過(guò)修飾Wnt途徑來(lái)增加HSCs。通過(guò)修飾Wnt途徑來(lái)增強(qiáng)HSC群體的HSC調(diào)節(jié)劑可以是選自下述的至少一種化合物PGE2、dmPGE2、BI0、LiCl、以及這些化合物的衍生物。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，HSC調(diào)節(jié)劑通過(guò)修飾CAMP/P13K/AKT第二信使來(lái)增加HSCs。通過(guò)修飾CAMP/P13K/AKT第二信使來(lái)增強(qiáng)HSC群體的HSC調(diào)節(jié)劑可以是選自下述的至少一種化合物8_溴-cAMP、毛喉素、以及這些試劑的衍生物。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，HSC調(diào)節(jié)劑通過(guò)修飾Ca2+第二信使來(lái)增加HSC群體。通過(guò)修飾Ca2+第二信使來(lái)增強(qiáng)HSC群體的HSC調(diào)節(jié)劑可以是選自下述的至少一種試劑Bapta-ΑΜ,芬地林、尼卡地平、以及這些化合物的衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，HSC調(diào)節(jié)劑通過(guò)修飾NO/血管緊張素信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)增加HSCs。通過(guò)修飾NO/血管緊張素信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)增強(qiáng)HSC群體的HSC調(diào)節(jié)劑可以是選自下述的至少一種化合物L(fēng)-Arg、硝普鈉、釩酸鈉、緩激肽、及其衍生物。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，增強(qiáng)HSC群體的HSC調(diào)節(jié)劑可以是選自下述的至少一種試劑美貝維林、丙酮縮氟氫羥龍、阿替洛爾、吲哚洛爾、加波沙朵(Gaboxadol)、犬尿烯酸、肼屈嗪、噻苯達(dá)唑、比枯枯靈堿(Bicuclline)、Vesamicol、黃夾次苷、丙咪嗪、氯磺丙脲、1，5_亞戊基四唑、4-氨基吡啶、二氮嗪、苯磷硫胺、12-甲氧基十二碳烯酸、N-甲?；?Met-Leu-Phe、加拉碘銨、IAA 94、氯烯雌醚、以及這些化合物的衍生物。另一個(gè)實(shí)施方案提供了通過(guò)使新生干細(xì)胞群體與選自下述的至少一種化合物接觸來(lái)促進(jìn)HSC生長(zhǎng)的方法PGE2、PGI2、亞油酸、13(s)-H0DE、LY171883、Mead酸、二十碳三烯酸、環(huán)氧二十碳三烯酸、0N0-259、Cayl039、PGE2受體激動(dòng)劑、16，16-二甲基PGE2、
19(R)-羥基PGE2、16，16- 二甲基PGE2p-(p-乙酰氨基苯甲酰氨基)苯酯、11_脫氧_16，16-二甲基PGE2、9-脫氧-9-亞甲基-16，16-二甲基PGE2、9-脫氧-9-亞甲基PGE2、丁環(huán)前列素、硫前列酮、PGE2絲氨醇酰胺、PGE2甲酯、16-苯基四去甲PGE2、15 (S)-15-甲基PGE2、15 (R)-15-甲基PGE2、BI0、8-溴-cAMP、毛喉素、Bapta-AM、芬地林、尼卡地平、硝苯地平、匹莫齊特、毒毛旋花子苷原、毛花苷、L-Arg、硝普鈉、釩酸鈉、緩激肽、美貝維林、丙酮縮氟氫羥龍、阿替洛爾、吲哚洛爾、加波沙朵、犬尿烯酸、肼屈嗪、噻苯達(dá)唑、比枯枯靈堿、Vesamicol、黃夾次苷、丙咪嗪、氯磺丙脲、1，5-亞戊基四唑、4-氨基吡啶、二氮嗪、苯磷硫胺、12-甲氧基十二碳烯酸、N-甲?；?Met-Leu-Phe、加拉碘銨、IAA 94、氯烯雌醚、及其衍生物。新生干細(xì)胞群體可以從外周血、臍帶血、絨毛膜絨毛、羊膜液、胎盤(pán)血或骨髓中收集。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了用于促進(jìn)HSC先體外后體內(nèi)擴(kuò)增的方法，其包括在至少一種HSC調(diào)節(jié)劑的存在下溫育HSC。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了用于促進(jìn)HSC先體外后體內(nèi)擴(kuò)增的方法，其包括收集HSC來(lái)源樣品(例如，外周血、臍帶血、羊膜液、胎盤(pán)血、骨髓、絨毛膜絨毛)且在至少一種HSC調(diào)節(jié)劑例如PGE2的存在下貯藏其。具體實(shí)施方案提供了包含適合于HSC來(lái)源樣品貯藏的容器的試劑盒，其中所述容器預(yù)裝入增加HSCs的至少一種HSC調(diào)節(jié)劑。另外的實(shí)施方案提供了試劑盒，其包含適合于HSC來(lái)源樣品貯藏的容器和包含合適量的增加HSCs的至少一種HSC調(diào)節(jié)劑的小瓶。本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案提供了用于促進(jìn)HSC先體外后體內(nèi)擴(kuò)增的方法，其中使新生HSC來(lái)源在最初收集時(shí)、在加工期間、在貯藏時(shí)、在解凍后、或在輸液期間與PGE2或其衍生物接觸。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，HSC調(diào)節(jié)劑通過(guò)修飾前列腺素途徑來(lái)抑制HSCs。通過(guò)修飾前列腺素途徑來(lái)抑制HSC群體的HSC調(diào)節(jié)劑可以是選自下述的至少一種化合物吲哚美辛、芬布芬、NS398、SC560、舒林酸、琥丁唑酮、阿司匹林、萘普生、布洛芬、塞來(lái)昔布、PGJ2、馬兜鈴酸、AH6809、AH23848、以及這些的衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，HSC調(diào)節(jié)劑通過(guò)修飾Wnt途徑來(lái)抑制HSCs。通過(guò)修飾Wnt途徑來(lái)抑制HSC群體的HSC調(diào)節(jié)劑可以是選自下述的至少一種試劑前列腺素抑制劑、Kenpaul lone、丙戍酸、或其衍生物 。在本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施方案中，HSC調(diào)節(jié)劑通過(guò)修飾CAMP/P13K/AKT第二信使來(lái)抑制HSCs。通過(guò)修飾CAMP/P13K/AKT第二信使來(lái)抑制HSC群體的HSC調(diào)節(jié)劑可以是選自下述的一種或多種化合物Η)98059、KT5720、H89、U0126、渥曼青霉素、及其衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，HSC調(diào)節(jié)劑通過(guò)修飾Ca2+第二信使來(lái)抑制HSCs。通過(guò)修飾Ca2+第二信使來(lái)抑制HSC群體的HSC調(diào)節(jié)劑可以是選自下述的至少一種試劑=BayK 8644、硫利噠嗪、以及這些試劑的衍生物。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，HSC調(diào)節(jié)劑通過(guò)修飾NO/血管緊張素信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)抑制HSCs。通過(guò)修飾NO/血管緊張素信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)抑制HSC群體的HSC調(diào)節(jié)劑可以是選自下述的至少一種化合物L(fēng)-NAME、依那普利、卡托普利、AcSDKP、氯沙坦、AcSDKP、氯沙坦、Telimasartan、組胺、氨溴索、白楊黃素、環(huán)己酰亞胺、亞甲藍(lán)、腎上腺素、地塞米松(Dexamethazone)、普羅地芬、異硫氰酸節(jié)酯、麻黃堿、及其衍生物。在本發(fā)明的一個(gè)另外實(shí)施方案中，抑制HSC群體的HSC調(diào)節(jié)劑是選自下述的至少一種化合物P ar a g y I i n e、普萘洛爾、依他硝唑、甲巰咪唑、西諾沙星、青霉胺、呋塞米、Eburnamininone、阿柔比星、華法林、Y -氨基丁酸、炔諾酮、鷹爪豆堿、二氫奎尼丁、乙肼苯噠嗪、甲氧明、羥基脲、雙氫麥角胺、安他唑林、3-硝基丙酸、N-苯氨茴酸、非那吡啶、二氯犬尿烯酸、3-雌二醇、L-Leu、酚芐明、美芬丁胺、四氫煙酸、愈創(chuàng)蘭油烴、咪唑、β-胡蘿卜素、氯苯丁酯、以及這些化合物的衍生物。另一個(gè)實(shí)施方案提供了用于抑制受試者中的HSC生長(zhǎng)的方法，其包括施用至少一種HSC調(diào)節(jié)劑和藥學(xué)上可接受的載體。在具體實(shí)施方案中，HSC調(diào)節(jié)劑是選自下述的一種或多種化合物吲哚美辛、塞來(lái)昔布、芬布芬、前列腺素(Prosteglandin) J2、琥丁唑酮、舒林酸、及其衍生物。另一個(gè)實(shí)施方案提供了通過(guò)使新生干細(xì)胞群體與選自下述的至少一種化合物接觸用于減少HSC生長(zhǎng)的方法吲哚美辛、芬布芬、NS398、SC560、舒林酸、琥丁唑酮、阿司匹林、萘普生、布洛芬、塞來(lái)昔布、PGJ2、馬兜鈴酸、ΑΗ6809、ΑΗ23848、Kenpaullone、丙戊酸、PD98059、KT5720、H89、U0126、渥曼青霉素、BayK 8644、硫利噠嗪(Thiridazine)、L-NAME、依那普利、卡托普利、AcSDKP、氯沙坦、AcSDKP、氯沙坦、Telimasartan、組胺、氨溴索、白楊黃素、環(huán)己酰亞胺、亞甲藍(lán)、腎上腺素、地塞米松、普羅地芬、異硫氰酸芐酯、麻黃堿、Paragyline、普萘洛爾、依他硝唑、甲巰咪唑、西諾沙星、青霉胺、呋塞米、Eburnamininone、阿柔比星、華法林、Y -氨基丁酸、炔諾酮、鷹爪豆堿、二氫奎尼丁、乙肼苯噠嗪、甲氧明、羥基脲、雙氫麥角胺、安他唑林、3-硝基丙酸、N-苯氨茴酸、非那吡啶、二氯犬尿烯酸、3-雌二醇、L-Leu、酚芐明、美芬丁胺、四氫煙酸、愈創(chuàng)蘭油烴、咪唑、β-胡蘿卜素、氯苯丁酯、PGE2受體拮抗劑、以及這些化合物的衍生物。


圖I表示關(guān)于使用斑馬魚(yú)胚胎影響AGM中的干細(xì)胞的化學(xué)藥品的篩選示意。圖2Α和2Β涉及前列腺素激動(dòng)劑和拮抗劑,其改變r(jià)unxl/cmyb表達(dá)而不影響血管發(fā)育。圖2A顯示在原始(gatal和lmo2)和永久(lmo2和cd41)血細(xì)胞生成期間分離的FACS分選細(xì)胞群體的微陣列表達(dá)概況。顯示了與GFP-細(xì)胞相比較，每個(gè)GFP+分選級(jí)分中的coxl (淡灰色)和cox-2 (深灰色)的相對(duì)表達(dá)。圖2B顯示與對(duì)照相比較(每個(gè)三重峰中的第I條)，在暴露于長(zhǎng)效dmPGE2 (10 μ Μ,每個(gè)三重峰中的第2條，深灰色)或非特異性cox抑制劑吲哚美辛(10 μ Μ，每個(gè)三重峰中的第3條)后的內(nèi)皮和HSC特異性基因表達(dá)的qPCR概況。2種處理都導(dǎo)致與關(guān)于檢查的每種基因的對(duì)照相比較統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異(AN0VA, P < O. 05，η = 8)。圖3描述了指出前列腺素激動(dòng)劑和拮抗劑改變r(jià)unxl/cmyb表達(dá)的數(shù)據(jù)，其通過(guò)經(jīng)由共焦顯微鏡術(shù)檢測(cè)到的雙基因(bigenic)斑馬魚(yú)胚胎中的HSC數(shù)目的定量分析DMSO 23. 3±5. 0(平均值土SD)，dmPGE2 (10 μ Μ) 38. 0±2. 2，吲哚美辛(10 μ M) (ANOVA, p
<O. 00001，η = 10/ 處理)。圖4A和4B顯示用dmPGE2處理增強(qiáng)亞致死照射的成年斑馬魚(yú)中的造血恢復(fù)。執(zhí)行斑馬魚(yú)全KM照射恢復(fù)實(shí)驗(yàn)。星號(hào)(*)指示統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異* = 50 μ M對(duì)對(duì)照，#=50 μ M對(duì)10 μ M和50 μ M對(duì)對(duì)照，*** =所有顯著的變量(ANOVA，ρ < O. 05，η = 15/變量)。圖4Α顯示了在DMSO和dmPGE2處理的(50 μ Μ)斑馬魚(yú)中照射恢復(fù)的第0、4、7、10和14天時(shí)在KM中的造血細(xì)胞譜系的代表性F SC/SSC FACS概況。圖4Β顯示在對(duì)照魚(yú)(三角形)和dmPGE2處理的魚(yú)(正方形，10 μ M ;圓圈，50 μ M)中前體細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞和髓樣細(xì)胞的KM重構(gòu)的動(dòng)力學(xué)。圖5Α和5Β描述了改變亞致死照射的成年斑馬魚(yú)中的HSC相關(guān)基因表達(dá)和恢復(fù)的PG途徑的調(diào)節(jié)。圖5Α顯示如通過(guò)對(duì)于照射后第3天分離的全KM的qPCR測(cè)量的，dmPGE2處理對(duì)干細(xì)胞和內(nèi)皮標(biāo)記的作用。星號(hào)(*)指出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異(雙尾t檢驗(yàn)，η = 15，runxl p = O. 0001 ；lmo2 p = 0. 014 ；flil p = 0. 049)。圖 5B 描述了 coxl (SC560,10 μ Μ)和cox2 (NS398,10 μ M)抑制對(duì)于照射恢復(fù)(η = 5/處理)的作用。對(duì)于用SC560或NS398處理的魚(yú)，由于在這些處理組中的過(guò)量死亡，在第14天時(shí)無(wú)法獲得分析。圖6A和6B顯示dmPGE2調(diào)節(jié)小鼠ES細(xì)胞中的集落數(shù)目和造血分化。進(jìn)行M3434和0P9ES細(xì)胞集落形成測(cè)定；計(jì)數(shù)是鋪平板的每100，000個(gè)細(xì)胞。條指出對(duì)照處理的ES細(xì)胞和用漸增劑量的dmPGE2 (10 μ Μ、20 μ Μ、100 μ Μ)的處理或吲哚美辛處理的(10 μ Μ、100 μ Μ)ES細(xì)胞。星號(hào)(*)指出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異(雙尾t檢驗(yàn)，η = 5/變量)。圖6Α，顯示了漸增劑量的dmPGE2和經(jīng)由吲哚美辛抑制環(huán)加氧酶活性對(duì)甲基纖維素中的造血分化的作用；終末類(lèi)紅細(xì)胞(E)、混合粒細(xì)胞/單核細(xì)胞(GM)和多能(GEMM)祖先集落的數(shù)目(10 μ MdmPGE2 GM ρ = O. 005,GEMM ρ = O. 017 ；20μΜ dmPGE2 dE ρ = O. 04,GM ρ = O. 007,GEMMO. 016 ； 100 μ M吲哚美辛GM ρ = O. 024)。圖6B, dmPGE2和吲哚美辛對(duì)0P9造血集落數(shù)目的作用(20 μ M :p = O. 047)。圖7A和7B描述了 PGE2對(duì)集落數(shù)目的影響。更具體而言，圖7A和7B舉例說(shuō)明了在(A)甲基纖維素和(B) 0P9測(cè)定中集落形成的吲哚美辛(100 μ M)抑制的dmPGE2介導(dǎo)的(10 μ M)援救。圖8Α-圖8F指出鼠BM暴露于dmPGE2增加CFU-S和再增殖HSCs的數(shù)目。星號(hào)㈩指出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異。圖8A和SB，WBM(在冰上2小時(shí))用EtOH對(duì)照或dmPGE2 (I μ Μ/106個(gè)細(xì)胞)的先體外后體內(nèi)處理對(duì)CFU-S8和CFU-S12 (60, 000個(gè)細(xì)胞/受體；CFU-S12 :雙尾t檢驗(yàn)，η = 10，ρ < O. 0001)的作用。圖8C，在用吲哚美辛(I μ Μ/106個(gè)細(xì)胞)先體外后體內(nèi)處理后對(duì)CFU-S12的作用(100，000個(gè)細(xì)胞/受體，雙尾t檢驗(yàn)，η=10，ρ = O. 0002)。圖8D，ckit+scal+譜系-干細(xì)胞在用dmPGE2或EtOH對(duì)照處理后的CFU-S 12 評(píng)估(雙尾 t 檢驗(yàn)，100 個(gè)細(xì)胞n = 10，ρ = O. 013 ；300 個(gè)細(xì)胞ρ = O. 0003)。圖SE和8F，有限稀釋競(jìng)爭(zhēng)再增殖測(cè)定。顯示了在12周時(shí)如通過(guò)FACS分析(e)測(cè)定的，與對(duì)照(正方形)或dmPGE2處理的(圓圈)細(xì)胞樣品移植的細(xì)胞總數(shù)目相關(guān)的陰性受體數(shù)目。在移植后6、12和24周時(shí)通過(guò)Poisson統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算的，在EtOH對(duì)dmPGE2處理的WBM的受體中的移入頻率(小圖F) (ANOVA, η = 10/變量，6周ρ = O. 005 ;12周ρ = O. 002 ；24周ρ = O. 05);在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上對(duì)分析存活的受體數(shù)目顯示于表6-表8中。圖9A-9N描述了顯示鼠BM暴露于dmPGE2增加脾重量和I次HSC移入的數(shù)據(jù)。圖9A和9B，在第(a) 8和(b) 12天時(shí)用EtOH對(duì)照或dmPGE2先體外后體內(nèi)處理WBM和分離的HSCs對(duì)脾重量的作用(雙尾 t 檢驗(yàn)，CFU-S8 n = 5, ρ = O. 339 ；CFU-S12 n = 9,p < O. 00001)。圖9C，與對(duì)照比較，在吲哚美辛處理(綠色)后的脾重量(雙尾t檢驗(yàn)n = 10，p = O. 00026)。圖9D，在KSL細(xì)胞的dmPGE2處理后的脾集落數(shù)目(雙尾t檢驗(yàn)，100個(gè)細(xì)胞n = 4，ρ =O. 0013 ；300個(gè)細(xì)胞n = 5,p = O. 009)。圖9E，舉例說(shuō)明在對(duì)照和dmPGE2暴露的BM細(xì)胞的受體中的⑶45. I移入水平(左上象限)的代表性FACS圖。圖9F-9J，在dmPGE2處理的WBM(圓圈)對(duì)對(duì)照(正方形)的受體中的平均嵌合狀態(tài)(F、H、I)和計(jì)算的移入頻率(圖9G 和 9J)。圖 9K 和 9L，在 CFU-S12 測(cè)定中用 coxl (SC560,10 μ M)和 cox2 (NS398,10 μ Μ)抑制劑先體外后體內(nèi)處理WBM對(duì)集落數(shù)目(配對(duì)t檢驗(yàn)，η = 10，SC560p = O. 00016，NS398p
<O. 00001 和脾重量(配對(duì) t 檢驗(yàn)，n = 10，SC560p = O. 025,NS398p = O. 00075)的作用。圖9M和9N，在5-FU骨髓損傷后的外周血(處理后第14天)和骨髓(處理后第16天)WBC計(jì)數(shù)；體內(nèi)暴露于SC560或NS398顯著抑制WBC恢復(fù)，而dmPGE2增強(qiáng)WBC計(jì)數(shù)。圖10呈現(xiàn)了 Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的圖解。圖IlA和IlB描述了 wnt活性的調(diào)節(jié)影響成體穩(wěn)態(tài)的數(shù)據(jù)。圖IlA顯示了照射測(cè)定的示意圖；圖IlB呈現(xiàn)了在wt,hs wnt8,hs :dkk和hs dnTCF成體中在照射后第10天時(shí)整個(gè)腎髓的FACS分析。圖12顯示了在體內(nèi)Top :dGFP測(cè)定中在由前列腺素信號(hào)傳導(dǎo)引起的發(fā)育胚胎中的wnt活性中的改變的qPCR定量。 圖13呈現(xiàn)了描述PG和wnt途徑的相互作用的潛在點(diǎn)的模型。(1)PGE2不能援救dkk、axin、dnTCF ;卩引哚美辛不能阻斷wnt8。(2)PGE2援救dkk,但不援救axin和dnTCF ;口引哚美辛可以阻斷wnt8 ；PGE2援救dkk和axin,但不援救dnTCF ;Π引哚美辛可以阻斷wnt8。
(4)PGE2援救dkk、axin和dnTCF ;卩引哚美辛可以阻斷wnt8。
圖14顯示了在照射以及用dmPGE2或吲哚美辛處理后第3天時(shí)，在Top :dGFP成體的腎髓中的GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比。詳述除非本文另有定義，與本申請(qǐng)結(jié)合使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)具有由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。此外，除非上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括復(fù)數(shù)，且復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括單數(shù)。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于本文描述的具體方法、規(guī)程和試劑等，并且同樣可以改變。本文使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述具體實(shí)施方案的目的，并且不意欲限制完全由權(quán)利要求限定的本發(fā)明的范圍。 除了在操作實(shí)施例中或另有說(shuō)明時(shí)，表示本文使用的成分或反應(yīng)條件的量的所有數(shù)目應(yīng)理解為在所有情況下由術(shù)語(yǔ)“約”修飾。術(shù)語(yǔ)“約”當(dāng)與百分比結(jié)合使用時(shí)可以意指± I %。鑒定的所有專利和其他出版物為了描述和公開(kāi)例如此種出版物中描述的方法的目的特別引入本文作為參考，所述方法可以與本發(fā)明結(jié)合使用。這些出版物僅在本申請(qǐng)的提交日期前提供其公開(kāi)內(nèi)容。在這點(diǎn)上任何事情不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明人由于在先發(fā)明或由于任何其他原因無(wú)權(quán)在時(shí)間上先于此種公開(kāi)內(nèi)容。關(guān)于日期的所有聲明或關(guān)于這些文件內(nèi)容的陳述基于對(duì)于申請(qǐng)人可用的信息，并且不構(gòu)成關(guān)于這些文件的日期或內(nèi)容的正確性的任何承認(rèn)。造血干細(xì)胞(HSC)穩(wěn)態(tài)受生長(zhǎng)因子、信號(hào)傳導(dǎo)分子和轉(zhuǎn)錄因子的緊密控制。在主動(dòng)脈-生殖腺-中腎(AGM)區(qū)中在胚胎發(fā)生期間衍生的終末HSCs隨后定居在胎兒和成體造血器官中的小生境。Dzierzak, 12Curr. Opin. Hematol. 197-202 (2004) ； Ga I Ioway & Zon,53Curr. Top. Devel. Biol. 139-58(2003)。本發(fā)明提供了用于在體外、體內(nèi)或先體外后體內(nèi)調(diào)節(jié)HSC生長(zhǎng)和更新的方法。該方法包括使新生干細(xì)胞群體與至少一種HSC調(diào)節(jié)劑接觸。這種群體可以包含在外周血、臍帶血、骨髓、羊膜液、絨毛膜絨毛、胎盤(pán)或其他造血干細(xì)胞小生境內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于促進(jìn)細(xì)胞群體中的造血干細(xì)胞生長(zhǎng)和更新的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于抑制細(xì)胞群體中的造血干細(xì)胞生長(zhǎng)和更新的方法。本發(fā)明部分基于PGE2和增強(qiáng)PGE2合成的試劑引起HSC數(shù)目中的增加的發(fā)現(xiàn)。相反，阻斷PGE2合成的試劑減少HSCs。在這點(diǎn)上，影響PGE2合成的試劑可以視為HSC調(diào)節(jié)齊U。例如，負(fù)責(zé)PGE2合成的環(huán)加氧酶(cox)可能是HSC形成所需的。此外，血管舒張劑促進(jìn)HSC擴(kuò)增，相反，血管收縮劑減少HSC數(shù)目。例如，肼屈嗪——抗高血壓血管舒張劑增加HSCs,而芬布芬——非類(lèi)固醇類(lèi)抗炎藥血管收縮劑減少HSCs。這些試劑因此也視為HSC調(diào)節(jié)劑。如本文所使用的，HSC調(diào)節(jié)劑可以促進(jìn)或抑制HSC生長(zhǎng)和更新。HSC調(diào)節(jié)劑影響細(xì)胞群體中的HSC數(shù)目。HSC調(diào)節(jié)劑影響培養(yǎng)中(在體外)、在短期溫育期間(先體外后體內(nèi))或在體內(nèi)的HSC擴(kuò)增。參見(jiàn)下表I。增加HSC數(shù)目的HSC調(diào)節(jié)劑包括上調(diào)PGE2合成的試齊U。HSC數(shù)目中的增加可以是比治療前由受試者顯示出的HSC數(shù)目多約10%、約20%、約 30%、約 40%、約 50%、約 60%、約 70%、約 80%、約 90%、約 100%、約 150%、約 200%或更多的增加。
引起HSC數(shù)目中的減少的HSC調(diào)節(jié)劑下調(diào)PGE2合成和/或促進(jìn)血管收縮。參見(jiàn)例如下表2。HSC數(shù)目中的減少可以是比治療前由受試者顯示出的HSC數(shù)目少約10%、約20%、約 30%、約 40%、約 50%、約 60%、約 70%、約 80%、約 90%、約 100%、約 150%、約200 %或更多的減少。HSC數(shù)目可以通過(guò)疾病癥狀的減輕進(jìn)行評(píng)估,例如增加的血小板計(jì)數(shù)、增加的血細(xì)胞比容,其中血小板計(jì)數(shù)或血細(xì)胞比容增加約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%、約150%、約200%或更多。對(duì)HSC數(shù)目的作用可以通過(guò)疾病癥狀的減輕進(jìn)行評(píng)估，例如增加的血小板計(jì)數(shù)、增加的血細(xì)胞比容，其中血小板計(jì)數(shù)或血細(xì)胞比容增加約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約 80%、約 90%、約 100%、約 150%、約 200%或更多。在一個(gè)實(shí)施方案中，PGE2或dmPGE2用作HSC調(diào)節(jié)劑以增加HSC群體。本發(fā)明的HSC調(diào)節(jié)劑還包括HSC調(diào)節(jié)劑的衍生物。如本文所使用的，衍生物包括化學(xué)修飾的化合物，其中所述修飾由熟練的化學(xué)家視為常規(guī)的，例如另外的化學(xué)部分(例如，酸的酯或酰胺，保護(hù)基團(tuán)，例如用于醇或硫醇的苯基、和用于胺的叔丁氧基羰基)。衍生物還包括放射性標(biāo)記的HSC調(diào)節(jié)劑，HSC調(diào)節(jié)劑的綴合物(例如，生物素或抗生物素蛋白、使用 酶例如辣根過(guò)氧化物酶等、使用生物發(fā)光劑、化學(xué)發(fā)光劑或熒光劑)。此外，可以給HSC調(diào)節(jié)劑或其部分添加部分以增加體內(nèi)半衰期。如本文所使用的,衍生物還包含類(lèi)似物,例如包含化學(xué)修飾形式的特定化合物或其類(lèi)別的化合物，和維持所述化合物或類(lèi)別的藥學(xué)和/或藥理學(xué)活性特征的化合物，也包含在本發(fā)明中。如本文所使用的，衍生物還包含HSC調(diào)節(jié)劑的前體藥物，這已知增強(qiáng)藥物的所需性質(zhì)(例如，可溶性、生物利用率、制備等)。HSC調(diào)節(jié)劑的直接先體外后體內(nèi)施用可以使造血干細(xì)胞能夠顯著體內(nèi)擴(kuò)增，從而使得甚至更小量的造血干細(xì)胞隨后在移植中可以是足夠的。因此，例如，臍帶血干細(xì)胞移植現(xiàn)在不僅可以應(yīng)用于兒童還可以應(yīng)用于成年人。此種干細(xì)胞可以從包括例如外周血、臍帶血、骨髓、羊膜液或胎盤(pán)血的來(lái)源進(jìn)行收集?？商娲?，包含HSC的來(lái)源樣品可以進(jìn)行收獲，然后立即在HSC調(diào)節(jié)劑例如PGE2的存在下進(jìn)行貯藏，并且在引入受試者內(nèi)之前在HSC調(diào)節(jié)劑的存在下進(jìn)行最初溫育(在分化前)。此外，一種或多種HSC調(diào)節(jié)劑可以在體內(nèi)用于增加骨髓或其他來(lái)源(例如臍帶血)中的干細(xì)胞數(shù)目。通過(guò)增加干細(xì)胞的數(shù)目，來(lái)自受試者的干細(xì)胞總收獲可以得到顯著改善。進(jìn)一步地，通過(guò)增加由受試者收獲的干細(xì)胞數(shù)目，可用于移植回該受試者內(nèi)或另一個(gè)受試者內(nèi)的干細(xì)胞數(shù)目也可以得到顯著改善，從而有效減少移入的時(shí)間，且隨后導(dǎo)致受試者在其間具有不足的嗜中性粒細(xì)胞和血小板的時(shí)間中的減少，從而防止感染、出血或其他并發(fā)癥。此外，本發(fā)明可以減少其否則不能轉(zhuǎn)移足夠細(xì)胞用于干細(xì)胞收獲以繼續(xù)進(jìn)行關(guān)于其最初疾病的治療的受試者比例，所述治療例如化學(xué)治療和其他骨髓切除治療。因此，還可以減少具有延遲的最初移入的受試者數(shù)目的比例。此外，本發(fā)明還可以通過(guò)增加HSC數(shù)目促進(jìn)骨髓切除治療后的恢復(fù)。HSC調(diào)節(jié)劑例如表I和本文公開(kāi)的那些可以在體內(nèi)用于增加HSC生產(chǎn)和先體外后體內(nèi)增加HSC數(shù)目。這通過(guò)將一種或多種化合物施用于受試者或干細(xì)胞來(lái)完成。HSC調(diào)節(jié)劑還可以用于給受試者提供自體的HSCs。一般地，這涉及下述步驟給有此需要的受試者施用HSC調(diào)節(jié)劑，以增強(qiáng)骨髓內(nèi)的干細(xì)胞群體擴(kuò)增和/或轉(zhuǎn)移外周循環(huán)中的干細(xì)胞；收獲一種或多種骨髓干細(xì)胞或外周循環(huán)中的一種或多種干細(xì)胞；且將一種或多種收獲的干細(xì)胞移植回受試者內(nèi)。此外，得自根據(jù)上文描述的本發(fā)明方法收獲的干細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域已知用于干細(xì)胞深低溫保藏的技術(shù)進(jìn)行深低溫保藏。因此，使用深低溫保藏，干細(xì)胞可以這樣維持，從而使得一旦確定受試者需要干細(xì)胞移植，那么干細(xì)胞可以進(jìn)行解凍且移植回受試者內(nèi)。如前所述，在深低溫保藏技術(shù)期間一種或多種HSC調(diào)節(jié)劑例如PGE2的使用可以增強(qiáng)HSC群體。更具體而言，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了從臍帶血或等價(jià)新生兒或胎兒干細(xì)胞來(lái)源收集的HSCs的增強(qiáng)，這可以進(jìn)行深低溫保藏用于此種干細(xì)胞在解凍后的治療用途。此種血液可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的幾種方法進(jìn)行收集。例如，因?yàn)槟殠а荋SCs的豐富來(lái)源(參見(jiàn) Nakahata & Ogawa, 70 J. Clin. Invest. 1324-28 (1982) ;Prindull 等人，67Acta.Paediatr. Scand. 413-16 (1978) ；Tchernia 等人，97 (3) J. Lab. Clin. Med. 322-31 (1981))，所以關(guān)于新生兒血液的極佳來(lái)源是臍帶和胎盤(pán)。新生兒血液可以通過(guò)從臍帶中直接引流和/或通過(guò)在根和擴(kuò)張靜脈處從分娩胎盤(pán)中針抽吸來(lái)獲得。參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)7，160,714 ;5，114,672 ;5，004，681 ;美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào) 10/076180，
發(fā)明者L·I·宗, T·E·諾思, W·戈斯林 申請(qǐng)人:兒童醫(yī)療中心有限公司, 通用醫(yī)療公司