專利名稱：用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基及其用途。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞(stem cells)是人體及其各種組織細(xì)胞的初始來源,其最顯著的生物學(xué)特征是既有自我更新和不斷增殖的能力，又有多向分化的潛能。干細(xì)胞根據(jù)不同的來源分為成體干細(xì)胞(somatic stem cells)和胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ES細(xì)胞)。成體干細(xì)胞包括神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞等。目前除對造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的研究較多外，對神經(jīng)干細(xì)胞的研究也比較深入。1992年,Reynolds和Weiss等首次成功地從成年小鼠的紋狀體分離出了神經(jīng)干細(xì)胞，這種細(xì)胞具有自我更新和分裂增殖能力，可以分化為神經(jīng)系統(tǒng)大部分類型的細(xì)胞，對損傷和疾病具有反應(yīng)能力。1998年，日本學(xué)者Okano和美國康內(nèi)爾大學(xué)的Goldman合作，證實了成人腦組織中神經(jīng)干細(xì)胞的存在。目前，人們通過不斷的實踐證明了神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)多潛能干細(xì)胞的存在并分離成功，為神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)和退行性病變的細(xì)胞替代治療帶來了新希望。因為神經(jīng)元不可再生修復(fù)的特性一直是醫(yī)學(xué)科學(xué)難以超越的障礙，兼之中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織結(jié)構(gòu)的脆弱易損性和它決定智能活動的重要性，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及其后遺癥始終是影響人類生命健康和生存質(zhì)量的頑疾之一，神經(jīng)干細(xì)胞的研究成為干細(xì)胞研究領(lǐng)域中最積極和最活躍的部分，臨床方面擁有光明的應(yīng)用前景。然而，目前對于神經(jīng)干細(xì)胞的相關(guān)研究仍有待改進。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種能夠有效制備神經(jīng)干細(xì)胞的手段。為此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提出了一種用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基。 根據(jù)本發(fā)明的實施例，該用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基適于干細(xì)胞生長；以及細(xì)胞信號通路抑制劑，所述細(xì)胞信號通路抑制劑為選自GSK抑制劑、 MEK抑制劑、TGF- β抑制劑、ROCK抑制劑和BMP抑制劑至少一種。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過使用該培養(yǎng)基對體細(xì)胞進行培養(yǎng)，尤其是對表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的體細(xì)胞進行培養(yǎng)，能夠有效地使得體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞(在本文中有時也稱為“誘導(dǎo)性神經(jīng)干細(xì)胞”)，并且時間大大縮短。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該試劑盒含有細(xì)胞信號通路抑制劑，所述細(xì)胞信號通路抑制劑為選自GSK 抑制劑、MEK抑制劑、TGF- β抑制劑、ROCK抑制劑和BMP抑制劑的至少一種。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)， 通過使用該試劑盒對體細(xì)胞進行培養(yǎng)，尤其是表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的體細(xì)胞進行培養(yǎng)，能夠有效地使得體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞，并且時間大大縮短。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的試劑盒，該試劑盒包含前述的培養(yǎng)基。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過使用該試劑盒對體細(xì)胞進行培養(yǎng)，尤其是表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的體細(xì)胞進行培養(yǎng)，能夠有效地使得體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞，并且時間大大縮短。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提出了前面所述的試劑盒在制備神經(jīng)干細(xì)胞中的用途。利用根據(jù)本發(fā)明實施例的試劑盒，能夠有效地對體細(xì)胞進行培養(yǎng)，尤其是表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的體細(xì)胞進行培養(yǎng)，能夠有效地使得體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞，并且時間大大縮短。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了前面所述的培養(yǎng)基在制備神經(jīng)干細(xì)胞中的用途。由此，能夠有效地通過對體細(xì)胞尤其是表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的體細(xì)胞進行體外培養(yǎng)，能夠有效地使得體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞，并且時間大大縮短。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括以下步驟利用前面所述的培養(yǎng)基，培養(yǎng)體細(xì)胞，所述體細(xì)胞攜帶編碼選自0ct4、Sox2、Klf4以及miR302的至少一種多功能干細(xì)胞因子的核酸序列，以便誘導(dǎo)所述體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過利用根據(jù)本發(fā)明實施例的培養(yǎng)基，對攜帶編碼特定轉(zhuǎn)錄因子即多功能干細(xì)胞因子的核酸序列的體細(xì)胞進行培養(yǎng)，能夠有效地使得體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞，并且時間可以大大縮短。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提出了一種神經(jīng)干細(xì)胞或其衍生物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該神經(jīng)干細(xì)胞是根據(jù)前面所述的方法獲得的。此外，根據(jù)本發(fā)明實施例的神經(jīng)干細(xì)胞或其衍生物能夠在適當(dāng)?shù)臈l件下有效地分化成神經(jīng)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了前面所述的神經(jīng)干細(xì)胞或其衍生物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療神經(jīng)細(xì)胞損傷所引起的疾病。由于根據(jù)本發(fā)明實施例的神經(jīng)干細(xì)胞或其衍生物能夠在適當(dāng)?shù)臈l件下有效地分化成神經(jīng)細(xì)胞，因而，可以進一步將該神經(jīng)干細(xì)胞或其衍生物制成藥物，從而可以治療神經(jīng)細(xì)胞損傷所引起的疾病。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提出了一種治療神經(jīng)細(xì)胞損傷所引起的疾病的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括將前面所述的神經(jīng)干細(xì)胞或其衍生物引入患者體內(nèi)。通過將前面所述的神經(jīng)干細(xì)胞或其衍生物引入患者體內(nèi)，神經(jīng)干細(xì)胞或其衍生物能夠在患者體內(nèi)有效地分化為神經(jīng)細(xì)胞，從而可以進一步彌補由于神經(jīng)細(xì)胞損傷所引起的身體損傷。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了一種制備神經(jīng)細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括將前面所述的神經(jīng)干細(xì)胞在適于分化的條件下進行培養(yǎng)。通過本發(fā)明的方法，能夠有效地使得神經(jīng)干細(xì)胞分化成為神經(jīng)細(xì)胞，從而有效地制備了神經(jīng)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提出了一種用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該系統(tǒng)包括分離裝置，所述分離裝置用于從人尿液中分離人尿液脫落細(xì)胞；轉(zhuǎn)化裝置，所述轉(zhuǎn)化裝置與所述分離裝置相連，并且設(shè)置有攜帶編碼選自0ct4、Sox2、 Klf4以及miR302的至少一種多功能干細(xì)胞因子的核酸序列的載體，以便對所述人尿液脫落細(xì)胞進行轉(zhuǎn)化；以及轉(zhuǎn)分化裝置，所述轉(zhuǎn)分化裝置與所述轉(zhuǎn)化裝置相連，并且設(shè)置有前面所述的培養(yǎng)基，用于對所述經(jīng)過轉(zhuǎn)化的人尿液脫落細(xì)胞進行轉(zhuǎn)分化，以便誘導(dǎo)所述經(jīng)過轉(zhuǎn)化的人尿液脫落細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞。利用該系統(tǒng)，能夠有效地實施前述制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法，從而可以有效地制備神經(jīng)干細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了一種篩選誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化的化合物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括以下步驟將前面所述的神經(jīng)干細(xì)胞與候選化合物接觸；以及檢測接觸所述候選化合物前后神經(jīng)干細(xì)胞的多能性；其中，基于接觸所述候選化合物后，所述神經(jīng)干細(xì)胞的多能性是否降低，判斷所述候選化合物是否具有誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化的活性。利用該方法能夠有效地篩選獲得能夠誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化的化合物。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提出了一種治療神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)損傷疾病的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括以下步驟分離患者的體細(xì)胞；根據(jù)前面所述的制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法，基于所述體細(xì)胞，制備神經(jīng)干細(xì)胞；將所述神經(jīng)干細(xì)胞引入所述患者體內(nèi)。利用本發(fā)明的治療神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)損傷疾病的方法，能夠有效地將制備獲得的神經(jīng)干細(xì)胞引入患者體內(nèi)，進而神經(jīng)干細(xì)胞在患者體內(nèi)能夠有效地分化為神經(jīng)細(xì)胞， 進一步，能夠彌補由于神經(jīng)退行和神經(jīng)細(xì)胞損傷所引起的身體損傷，從而能夠治療神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)損傷疾病。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種鑒定制劑對神經(jīng)系統(tǒng)是否具有影響的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括以下步驟將所述制劑與根據(jù)本發(fā)明實施例的神經(jīng)干細(xì)胞接觸；以及對接觸前后的神經(jīng)干細(xì)胞進行檢測，其中，基于所述神經(jīng)干細(xì)胞的行為變化，判斷所述制劑對神經(jīng)系統(tǒng)是否具有影響。利用該方法能夠有效地鑒定制劑對神經(jīng)系統(tǒng)是否具有影響。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。


本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖I :顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法的流程示意圖；圖2 :顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3 :顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的治療神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)損傷疾病的方法的流程示意圖；圖4 :顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的誘導(dǎo)誘導(dǎo)性神經(jīng)干細(xì)胞過程中各階段的細(xì)胞的形態(tài)圖；圖5 :顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的免疫熒光及Real-Time PCR方法鑒定誘導(dǎo)性神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)水平的結(jié)果；以及圖6 :顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的免疫熒光檢測誘導(dǎo)性神經(jīng)干細(xì)胞體外分化物中不同類型神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物表達(dá)的結(jié)果。
具體實施例方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提出了一種用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基可以包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，該基礎(chǔ)培養(yǎng)基適于干細(xì)胞生長；以及細(xì)胞信號通路抑制劑，該細(xì)胞信號通路抑制劑為選自GSK抑制劑、MEK 抑制劑、TGF- β抑制劑、ROCK抑制劑和BMP抑制劑的至少一種。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過使用該培養(yǎng)基對體細(xì)胞進行培養(yǎng)，尤其是對表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的體細(xì)胞進行培養(yǎng)，能夠有效地使得體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞，并且培養(yǎng)時間大大縮短。根據(jù)本發(fā)明的實施例，基礎(chǔ)培養(yǎng)基的類型并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為mTeSRl (可以從Stem Cell公司購得)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，各細(xì)胞信號通路的抑制劑的具體類型也不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，細(xì)胞信號通路抑制劑可以為GSK抑制劑CHIR99021、MEK抑制劑Η)0325901、TGF-β抑制劑Α83-01、ROCK 抑制劑thiazovivin和BMP抑制劑DMHl的組合。這些抑制劑均為市售可得的，并且由此， 可以進一步提高將體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞的效率。對于各抑制劑在用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基中的濃度，并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，按照重量百分比，該培養(yǎng)基可以含有濃度為O. 3 μ Μ-30 μ M的GSK抑制劑CHIR99021 ;濃度為IOnM-IO μ M的MEK 抑制劑PD0325901 ;濃度為50nm_5 μ M的TGF- β抑制劑Α83-01 ;濃度為50nm_5 μ M的ROCK 抑制劑thiazovivin ;以及濃度為20nm_2 μ M的BMP抑制劑DMHl。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，按照重量百分比，所述培養(yǎng)基可以含有濃度為3μΜ的GSK抑制劑CHIR99021 ； 濃度為ΙμΜ的MEK抑制劑Η)0325901 ;濃度為O. 5 μ M的TGF-β抑制劑Α83-01 ;濃度為
O.5 μ M的ROCK抑制劑thiazovivin ；以及濃度為O. 2 μ M的BMP抑制劑DMHl。由此，可以進一步提高將降體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞的效率。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該試劑盒含有細(xì)胞信號通路抑制劑，該細(xì)胞信號通路抑制劑為選自GSK 抑制劑、MEK抑制劑、TGF- β抑制劑、ROCK抑制劑和BMP抑制劑的至少一種。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)， 通過使用該試劑盒對體細(xì)胞進行培養(yǎng)，尤其是對表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的體細(xì)胞進行培養(yǎng)，能夠有效地使得體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞，并且時間大大縮短。根據(jù)本發(fā)明的實施例，各細(xì)胞信號通路的抑制劑的具體類型不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述細(xì)胞信號通路抑制劑可以為GSK抑制劑CHIR99021、MEK抑制劑Η)0325901、TGF-β抑制劑Α83-01、 ROCK抑制劑thiazovivin和BMP抑制劑DMHl的組合。這些抑制劑均為市售可得的，并且由此，可以進一步提高將體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞的效率。對于各抑制劑在用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基中的濃度，并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，GSK抑制劑 CHIR99021、MEK 抑制劑 PD0325901、TGF-P 抑制劑 A83_01、R0CK 抑制劑 thiazovivin 和 BMP 抑制劑DMHl分別設(shè)置在不同的容器中。由此，可以方便地使用該試劑盒對體細(xì)胞進行轉(zhuǎn)分化處理。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，該試劑盒可以進一步包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中該基礎(chǔ)培養(yǎng)基為mTeSRl (可以從Stem Cell公司購得)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，細(xì)胞信號通路抑制劑的存在形式并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，在該試劑盒中，細(xì)胞信號通路抑制劑可以溶解于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。由此， 可以方便地使用試劑盒對體細(xì)胞進行轉(zhuǎn)分化處理。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，在該試劑盒中，按照重量百分比，溶解于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的細(xì)胞信號通路抑制劑可以為濃度為3μΜ的GSK抑制劑CHIR99021、濃度為I μ M的MEK抑制劑PD0325901、濃度為O. 5 μ M的TGF-β抑制劑Α83-01、濃度為O. 5 μ M的ROCK抑制劑thiazovivin以及濃度為O. 2 μ M的BMP抑制劑 DMHl的組合。由此，可以進一步提高使用試劑盒對體細(xì)胞進行轉(zhuǎn)分化處理的效率。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的試劑盒，該試劑盒包含前述的用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過使用該試劑盒對體細(xì)胞進行培養(yǎng)，尤其是對表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的體細(xì)胞進行培養(yǎng)，能夠有效地使得體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞，并且時間大大縮短。關(guān)于用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基，前面已經(jīng)進行了詳細(xì)描述，在此不再贅述。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提出了前面所述的試劑盒在制備神經(jīng)干細(xì)胞中的用途。利用根據(jù)本發(fā)明實施例的試劑盒，能夠有效地對體細(xì)胞進行培養(yǎng)，尤其是對表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的體細(xì)胞進行培養(yǎng)，能夠有效地使得體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞，并且時間大大縮短。關(guān)于試劑盒，前面已經(jīng)進行了詳細(xì)描述，在此不再贅述。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了前面所述的培養(yǎng)基在制備神經(jīng)干細(xì)胞中的用途。由此，能夠有效地通過對體細(xì)胞尤其是表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的體細(xì)胞進行體外培養(yǎng)，能夠有效地使得體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞，并且時間大大縮短。關(guān)于用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基，前面已經(jīng)進行了詳細(xì)描述，在此不再贅述。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法可以包括以下步驟利用前面所述的用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基，培養(yǎng)體細(xì)胞，該體細(xì)胞攜帶編碼選自0ct4、Sox2、Klf4以及miR302的至少一種多功能干細(xì)胞因子的核酸序列，以便誘導(dǎo)體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過利用根據(jù)本發(fā)明實施例的培養(yǎng)基，對攜帶編碼特定轉(zhuǎn)錄因子即多功能干細(xì)胞因子的核酸序列的體細(xì)胞進行培養(yǎng)，能夠有效地使得體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞，并且時間可以大大縮短。根據(jù)本發(fā)明的實施例，體細(xì)胞的類型并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，體細(xì)胞可以為人尿液脫落細(xì)胞。由此，可以方便地獲得起始細(xì)胞，從而提高制備神經(jīng)干細(xì)胞的效率，降低制備神經(jīng)干細(xì)胞的成本，避免采用侵入式手術(shù)方法獲取起始細(xì)胞帶來的人力物力成本。進一步,根據(jù)本發(fā)明的實施例,攜帶編碼選自0ct4、Sox2、Klf4以及miR302的至少一種多功能干細(xì)胞因子的核酸序列的體細(xì)胞，也可以通過對不攜帶所述多功能干細(xì)胞因子的體細(xì)胞進行生物學(xué)處理而得到。具體地，根據(jù)本發(fā)明的實施例，攜帶編碼選自0ct4、Sox2、 Klf4以及miR302的至少一種多功能干細(xì)胞因子的核酸序列的體細(xì)胞可以通過下列步驟獲得首先，對人尿液進行離心，以便獲得沉淀物。接著，利用尿液培養(yǎng)基對所述沉淀物進行培養(yǎng)，以便獲得原代人尿液脫落細(xì)胞。然后，利用攜帶編碼選自0ct4、Sox2、Klf4以及miR302的至少一種多功能干細(xì)胞因子的核酸序列的載體，對原代人尿液脫落細(xì)胞進行轉(zhuǎn)化，以便獲得體細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，載體攜帶編碼0ct4、Sox2、Klf4以及miR302的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，載體為分別攜帶編碼0ct4、Sox2、Klf4以及miR302的核酸序列的不同質(zhì)粒。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，利用電轉(zhuǎn)導(dǎo)對原代人尿液脫落細(xì)胞進行轉(zhuǎn)化。在獲得神經(jīng)干細(xì)胞后，還可以進一步對神經(jīng)干細(xì)胞進行擴增培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，對神經(jīng)干細(xì)胞進行擴增培養(yǎng)的方法并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，本發(fā)明的制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法可以進一步包括下列步驟以實現(xiàn)對神經(jīng)干細(xì)胞的擴增首先，利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對神經(jīng)干細(xì)胞進行貼壁培養(yǎng)。其中，該基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以為 mTeSRl。然后，將經(jīng)過貼壁培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，該神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基為含有1% N2 supplement、I %非必需氨基酸、O. I %肝素、20ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子和20ng/ml表皮生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提出了一種神經(jīng)干細(xì)胞或其衍生物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該神經(jīng)干細(xì)胞是根據(jù)前面所述的方法獲得的。此外，根據(jù)本發(fā)明實施例的神經(jīng)干細(xì)胞或其衍生物能夠在適當(dāng)?shù)臈l件下有效地分化成神經(jīng)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了前面所述的神經(jīng)干細(xì)胞或其衍生物在制備藥物中的用途，該藥物用于治療神經(jīng)細(xì)胞損傷所引起的疾病。由于根據(jù)本發(fā)明實施例的神經(jīng)干細(xì)胞或其衍生物能夠在適當(dāng)?shù)臈l件下有效地分化成神經(jīng)細(xì)胞，因而，可以進一步將該神經(jīng)干細(xì)胞或其衍生物制成藥物，從而可以治療神經(jīng)細(xì)胞損傷所引起的疾病。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提出了一種治療神經(jīng)細(xì)胞損傷所引起的疾病的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法可以包括將前面所述的神經(jīng)干細(xì)胞或其衍生物引入患者體內(nèi)。通過將前面所述的神經(jīng)干細(xì)胞或其衍生物引入患者體內(nèi)，神經(jīng)干細(xì)胞或其衍生物能夠在患者體內(nèi)有效地分化為神經(jīng)細(xì)胞，從而可以進一步彌補由于神經(jīng)細(xì)胞損傷所引起的身體損傷。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了一種制備神經(jīng)細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括將前面所述的神經(jīng)干細(xì)胞在適于分化的條件下進行培養(yǎng)。通過本發(fā)明的方法，能夠有效地使得神經(jīng)干細(xì)胞分化成為神經(jīng)細(xì)胞，從而有效地制備了神經(jīng)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，對神經(jīng)干細(xì)胞進行分化培養(yǎng)的方法并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，可以利用含有1% N2 supplement、I %非必需氨基酸、O. I %肝素，并添加有濃度均為10ng/mL的神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、⑶NF、CNTF和IGF的DMEM/F12培養(yǎng)基，對神經(jīng)干細(xì)胞進行培養(yǎng)，以便獲得不同類型的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提出了一種用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，參照圖2，該系統(tǒng)1000可以包括分離裝置100、轉(zhuǎn)化裝置200以及轉(zhuǎn)分化裝置300。其中，分離裝置100用于從人尿液中分離人尿液脫落細(xì)胞。轉(zhuǎn)化裝置200與分離裝置100相連，并且設(shè)置有攜帶編碼選自0ct4、Sox2、Klf4以及miR302的至少一種多功能干細(xì)胞因子的核酸序列的載體，用于從分離裝置100接收人尿液脫落細(xì)胞并對其進行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)分化裝置300與轉(zhuǎn)化裝置200相連，并且設(shè)置有前面所述的用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基，用于從轉(zhuǎn)化裝置200接收經(jīng)過轉(zhuǎn)化的人尿液脫落細(xì)胞并對其進行轉(zhuǎn)分化，以便誘導(dǎo)經(jīng)過轉(zhuǎn)化的人尿液脫落細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞。利用該系統(tǒng)，能夠有效地實施前述制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法，從而可以有效地制備神經(jīng)干細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了一種篩選誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化的化合物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法可以包括以下步驟將前面所述的神經(jīng)干細(xì)胞與候選化合物接觸；以及檢測接觸候選化合物前后神經(jīng)干細(xì)胞的多能性；其中，基于接觸候選化合物后，神經(jīng)干細(xì)胞的多能性是否降低，判斷候選化合物是否具有誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化的活性。利用該方法能夠有效地篩選獲得能夠誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提出了一種治療神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)損傷疾病的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，參照圖3，該方法可以包括以下步驟首先，分離患者的體細(xì)胞。其次，根據(jù)前面所述的制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法，基于獲得的體細(xì)胞，制備神經(jīng)干細(xì)胞。然后，將獲得的神經(jīng)干細(xì)胞引入患者體內(nèi)。利用本發(fā)明的治療神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)損傷疾病的方法，能夠有效地將制備獲得的神經(jīng)干細(xì)胞引入患者體內(nèi)，進而神經(jīng)干細(xì)胞在患者體內(nèi)能夠有效地分化為神經(jīng)細(xì)胞， 進一步，能夠彌補由于神經(jīng)退行和神經(jīng)細(xì)胞損傷所引起的身體損傷，從而能夠治療神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)損傷疾病。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種鑒定制劑對神經(jīng)系統(tǒng)是否具有影響的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法可以包括以下步驟將制劑與根據(jù)本發(fā)明實施例的神經(jīng)干細(xì)胞接觸；以及對接觸前后的神經(jīng)干細(xì)胞進行檢測，其中，基于神經(jīng)干細(xì)胞的行為變化， 判斷制劑對神經(jīng)系統(tǒng)是否具有影響。利用該方法能夠有效地鑒定制劑對神經(jīng)系統(tǒng)是否具有影響。需要說明的是，本發(fā)明的用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基及其用途，是本申請的發(fā)明人通過艱苦的創(chuàng)造性勞動和優(yōu)化的工作而完成的。并且，在本發(fā)明的各方面中所描述的特征是可以相互引用的，為方便起見，不再贅述。下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的方案進行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例I :制備神經(jīng)干細(xì)胞I、分離人尿液脫落細(xì)胞(Urine cells, UC)按照以下步驟，分離尿液脫落細(xì)胞(I)收集中段尿液150-200ml，置于無菌容器，并加入雙抗(青霉素/鏈霉素)；(2)然后將上述尿液轉(zhuǎn)入50ml離心管，400g離心IOmin ；(3)吸掉上清，以便剩余約5ml尿液；(4)向上述剩余尿液中加入含有雙抗的PBS約10_30ml，輕輕混勻，然后400g離心 IOmin ；(5)吸掉上清至剩余液體少于O. 5ml ；(6)然后向上述剩余尿液中加入Iml尿液細(xì)胞培養(yǎng)基重懸沉淀，并收集細(xì)胞；(7)將上述收集到的細(xì)胞平鋪接種于已用O. I %的明膠(Gelatin)預(yù)包被處理的60mm培養(yǎng)皿(或六孔板)中，補加Iml尿液細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，尿液細(xì)胞培養(yǎng)基是通過將含10%胎牛血清(FBS, PAA公司)、雙抗的高葡萄糖DMEM(Dulbcco' s Modifed Eagle Medium)培養(yǎng)基(HyClone 公司)和 SingleQuot Kit CC-4127REGM 培養(yǎng)基(Lonza 公司)1 : I混合而獲得的；(8)將接種有細(xì)胞的培養(yǎng)皿置于37°C，5% C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3天；(9)觀察培養(yǎng)皿內(nèi)是否有細(xì)胞貼壁，然后輕輕補加Iml培養(yǎng)基，繼續(xù)置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)；(10)在接種細(xì)胞的第5-7天，吸去培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基，并用PBS洗滌一遍，然后向培養(yǎng)皿中添加新鮮尿液培養(yǎng)基(不加抗生素)，可見細(xì)胞貼壁生長；(11)視細(xì)胞生長情況添加或更換培養(yǎng)基，可用O. 25%胰酶消化傳代擴增；(12)當(dāng)尿液細(xì)胞擴增至第2代開始，收獲原代人尿液脫落細(xì)胞，并用凍存液(90% FBS+10% DMS0)將其用液氮凍存，備用。2、誘導(dǎo)誘導(dǎo)性神經(jīng)干細(xì)胞(induced neural stem cell, iNSC)iNSC的誘導(dǎo)試驗包括細(xì)胞準(zhǔn)備、質(zhì)粒電轉(zhuǎn)、細(xì)胞接種誘導(dǎo)、細(xì)胞克隆挑取、iNSC擴增等環(huán)節(jié)，具體步驟如下(I)將凍存的原代人尿液脫落細(xì)胞進行復(fù)蘇，并接種于IOcm盤(或者六孔板)中；(2)待原代人尿液脫落細(xì)胞在IOcm盤中的匯合度至90%左右時，用O. 25%胰酶對其進行消化，然后收集細(xì)胞并計數(shù)；(3)將適量細(xì)胞(每個電轉(zhuǎn)體系的細(xì)胞數(shù)量在50-150萬范圍)轉(zhuǎn)移至I. 5ml的 EP管中，200g離心5min ；(4)吸掉EP管中的上清，并收集細(xì)胞沉淀于電轉(zhuǎn)杯中；(5)配制質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體系向上述電轉(zhuǎn)杯中依次加入82 μ I Basic Nucleofector Solution for Mammalian Epithelial Cells 和 18 μ I supplement I (Lonza 公司)輕輕混勻，然后加入5yg質(zhì)粒，充分混勻，以便獲得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體系，其中質(zhì)粒包括 pCEP4-02SET2K(3μ g)和 pCEP4_miR-302(2 μ g)；(6)將電轉(zhuǎn)杯置于Amaxa電轉(zhuǎn)儀(Lonza公司)上，選擇T-013 (或T-020)程序進行電轉(zhuǎn)；(7)將電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至包被有基質(zhì)膠(Matrigel)的六孔板(或者IOcm盤) 上，每孔接種約10-30萬細(xì)胞，可根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)進行調(diào)整，然后添加尿液細(xì)胞培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)過夜；(8)次日(或轉(zhuǎn)染后第二日)，將上述六孔板中的尿液細(xì)胞培養(yǎng)基更換為含有 3 μ MCHIR99021、1μ M PD0325901、0·5 μ M Α83-01 (Tocris Bioscience),0. 5 μ M
thiazovivin和 O. 2 μ MDMHl (Tocris Bioscience)的mTeSRl 培養(yǎng)基(Stem Cell 公司)-
本發(fā)明的用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，觀察細(xì)胞，并每隔一天更換一次培養(yǎng)(9)在電轉(zhuǎn)后約12-15天，經(jīng)過誘導(dǎo)的細(xì)胞將長出大小合適、邊緣清晰、細(xì)胞排列緊密的克隆，利用機械法挑取細(xì)胞克隆，并將其分成小塊，接種于包被有Matrigel的基質(zhì)膠(Matrigel)的六孔板(或十二孔板)上，用普通mTeSRl培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；(10)當(dāng)經(jīng)過培養(yǎng)的細(xì)胞克隆貼壁后，更換新鮮培養(yǎng)基，并繼續(xù)培養(yǎng)3-5天，隔天換液，可見大量排列成神經(jīng)花環(huán)(Rosette)樣結(jié)構(gòu)的或者具有極性排列的神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞團；(11)機械法挑取神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞團，并用Iml槍頭輕輕吹打，將細(xì)胞團吹成小塊或單細(xì)胞，并將獲得的單細(xì)胞轉(zhuǎn)移至裝有神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基的T25培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，其中，神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基為含有1% N2 supplement(Gibco)、1%非必需氨基酸 (NEAA, Gibco) >0. 1%肝素(Heparin, Sigma)、20ng/ml 堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF,Invitrogen)和 20ng/ml 表皮生長因子(EGF，R&D Systems)的 DMEM/F12 培養(yǎng)基；(12)懸浮生長于培養(yǎng)瓶中一周后，細(xì)胞可形成邊界清晰的神經(jīng)球(這時的神經(jīng)球被定義為Pl代神經(jīng)球)，此后，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，更換的量為原培養(yǎng)基的一半；(13)當(dāng)細(xì)胞生長到7-14天(視神經(jīng)球大小)時，即從細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)開始的第7-14天，將其進行傳代，將直徑超過300 μ m的神經(jīng)球轉(zhuǎn)移至15ml 的離心管中，待神經(jīng)球自然沉降或離心(50g，l-2min)后，吸除上清，并向離心管中添加Iml Accutase,使其于37°C下進行消化3_5min ；(14)向上述離心管中添加神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基(其中，神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基為含有 I % N2supplement (Gibco)、I %非必需氨基酸(NEAA, Gibco)、0· 1%肝素(Heparin, Sigma)、 20ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF, Invitrogen)和20ng/ml表皮生長因子(EGF,R&D Systems)的DMEM/F12培養(yǎng)基)至反應(yīng)體系的體積為IOml,然后200g離心5min ；(15)吸掉上清，然后向離心管中添加少量神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基(約500 μ I)，混勻， 并用Iml槍頭輕輕吹打?qū)⒓?xì)胞團打散成小塊，再向離心管中添加Iml神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，混勻后接種于新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)以形成第二代神經(jīng)球。其中，利用倒置顯微鏡(Olympus，BX51)對從原代人尿液脫落細(xì)胞誘導(dǎo)制備神經(jīng)干細(xì)胞過程中各階段的細(xì)胞進行形態(tài)觀察并照相，結(jié)果見圖4。圖4顯示了本實施例的誘導(dǎo)誘導(dǎo)性神經(jīng)干細(xì)胞過程中各階段的細(xì)胞的形態(tài)圖。如圖4所示，A為原代人尿液脫落細(xì)胞；B為細(xì)胞經(jīng)過電轉(zhuǎn)后誘導(dǎo)形成的細(xì)胞克??；C為挑取的克隆貼壁后的形態(tài)；D為iNSC神經(jīng)球，放大倍數(shù)為100。實施例2 :誘導(dǎo)性神經(jīng)干細(xì)胞(iNSC)表型的鑒定I、免疫熒光染色檢測iNSC中NSC標(biāo)志物的表達(dá)(I)將已包被基質(zhì)膠(Matrigel)的玻片置于24孔板中，取5_10個實施例I制備的體積較小的iNSC神經(jīng)球(即iNSC神經(jīng)干細(xì)胞)貼在玻片上，然后向玻片上添加100 μ I 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜，次日再向每個孔中添加500 μ I神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)1-2 天；(2)利用4%的多聚甲醛，將上述經(jīng)過培養(yǎng)的細(xì)胞于室溫下固定20min ；(3)用PBS將經(jīng)過固定的細(xì)胞充分漂洗3次，每次5min ；(4)向經(jīng)過漂洗的細(xì)胞中添加一抗(Pax6、Nestin、Soxl、Sox2)、I % BSA、10 % normal goat serum、0. 3% Triton X-100 和 PBS,然后于 4°C 下培養(yǎng)過夜；(5)用PBS將培養(yǎng)過夜的細(xì)胞洗滌3次，每次5min ；(6)向經(jīng)過洗滌的細(xì)胞中添加相應(yīng)的標(biāo)記有Alexa 568或488的二抗 (Invitrigen)，然后于室溫下進行避光孵育Ih ；(7)用PBS將經(jīng)過避光孵育的細(xì)胞洗滌3次，每次5min ；(8)向上步獲得的經(jīng)過洗滌的細(xì)胞中添加DAPI (Sigma)，然后于室溫下進行避光孵育3min ；(9)用PBS將上步獲得的經(jīng)過避光孵育的細(xì)胞洗滌3次，每次5min ；(10)然后進行封片，并對樣品進行觀察照相，結(jié)果見圖5.2、Real-Time PCR鑒定誘導(dǎo)性神經(jīng)干細(xì)胞(iNSC)中神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)首先,使用Trizol (Takara公司)試劑,按照制造商說明，提取實施例I制備的誘導(dǎo)性神經(jīng)干細(xì)胞的總RNA。然后，用M-MLV (Takara公司)試劑盒對提取的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，并使用SYBR Premix Ex Taq 試劑盒(Takara公司)和ABI 7300熒光定量PCR儀(ABI公司)對cDNA進行Real-Time PCR,以便鑒定神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)， 結(jié)果見圖5。其中，Real-Time PCR引物的序列見下表。
權(quán)利要求
1.一種用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基適于干細(xì)胞生成；以及細(xì)胞信號通路抑制劑，所述細(xì)胞信號通路抑制劑為選自GSK抑制劑、MEK抑制劑、 TGF- β抑制劑、ROCK抑制劑和BMP抑制劑的至少一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為mTeSRl。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述細(xì)胞信號通路抑制劑為GSK抑制劑 CHIR9902UMEK 抑制劑 PD032590U TGF-β 抑制劑 A83-0UR0CK 抑制劑 thiazovivin 和 BMP抑制劑DMHl的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基，其特征在于，按照重量百分比，所述培養(yǎng)基含有 濃度為 O. 3 μ Μ-30 μ M 的 GSK 抑制劑 CHIR99021 ；濃度為 IOnM-IO μ M 的 MEK 抑制劑 PD0325901 ；濃度為50nm-5 μ M的TGF- β抑制劑Α83-01 ；濃度為50nm_5 μ M的ROCK抑制劑thiazovivin ；以及濃度為20nm-2 μ M的BMP抑制劑DMHl。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基，其特征在于，按照重量百分比，所述培養(yǎng)基含有 濃度為3 μ M的GSK抑制劑CHIR99021 ；濃度為I μ M的MEK抑制劑PD0325901 ；濃度為O. 5 μ M的TGF- β抑制劑Α83-01 ；濃度為O. 5 μ M的ROCK抑制劑thiazovivin ；以及濃度為O. 2 μ M的BMP抑制劑DMHl。
6.一種用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中含有細(xì)胞信號通路抑制劑，所述細(xì)胞信號通路抑制劑為選自GSK抑制劑、MEK抑制劑、TGF- β抑制劑、ROCK抑制劑和BMP抑制劑的至少一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備神經(jīng)干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述細(xì)胞信號通路抑制劑為GSK抑制劑CHIR99021、MEK抑制劑PD0325901、TGF-β抑制劑A83_01、R0CK抑制劑thiazovivin和BMP抑制劑DMHl的組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備神經(jīng)干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述GSK抑制劑 CHIR99021、MEK 抑制劑 PD0325901、TGF-P 抑制劑 A83_01、R0CK 抑制劑 thiazovivin 和 BMP 抑制劑DMHl分別設(shè)置在不同的容器中。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備神經(jīng)干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，進一步包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為mTeSRl。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備神經(jīng)干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述細(xì)胞信號通路抑制劑溶解于所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備神經(jīng)干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，按照重量百分比， 所述細(xì)胞信號通路抑制劑為濃度為3 μ M的GSK抑制劑CHIR99021、濃度為I μ M的MEK抑制劑PD0325901、濃度為0. 5 μ M的TGF-β抑制劑Α83-01、濃度為0. 5 μ M的ROCK抑制劑 thiazovivin以及濃度為0. 2 μ M的BMP抑制劑DMHl的組合。
12.一種用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求1-5任一項所述的培養(yǎng)基。
13.權(quán)利要求6-12任一項所述的試劑盒在制備神經(jīng)干細(xì)胞中的用途。
14.權(quán)利要求1-5任一項所述的培養(yǎng)基在制備神經(jīng)干細(xì)胞中的用途。
15.一種制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟利用權(quán)利要求1-5任一項所述的培養(yǎng)基，培養(yǎng)體細(xì)胞，所述體細(xì)胞攜帶編碼選自0ct4、 Sox2、Klf4以及miR302的至少一種多功能干細(xì)胞因子的核酸序列，以便誘導(dǎo)所述體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述體細(xì)胞為人尿液脫落細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述體細(xì)胞是通過下列步驟獲得的對人尿液進行離心，以便獲得沉淀物；利用尿液培養(yǎng)基對所述沉淀物進行培養(yǎng)，以便獲得原代人尿液脫落細(xì)胞；以及利用攜帶編碼選自0ct4、Sox2、Klf4以及miR302的至少一種多功能干細(xì)胞因子的核酸序列的載體，對所述原代人尿液脫落細(xì)胞進行轉(zhuǎn)化，以便獲得所述體細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述載體攜帶編碼0ct4、SoX2、Klf4以及miR302的核酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述載體為分別攜帶編碼0ct4、Sox2、 Klf4以及miR302的核酸序列的不同質(zhì)粒。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，利用電轉(zhuǎn)導(dǎo)對所述原代人尿液脫落細(xì)胞進行轉(zhuǎn)化。
21.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，進一步包括利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對所述神經(jīng)干細(xì)胞進行貼壁培養(yǎng)；以及將經(jīng)過貼壁培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基為含有1% N2 supplement、I %非必需氨基酸、O. I %肝素、20ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子和20ng/ml表皮生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)基。
22.—種神經(jīng)干細(xì)胞或其衍生物，其特征在于，所述神經(jīng)干細(xì)胞是根據(jù)權(quán)利要求15-21 任一項所述的方法獲得的。
23.權(quán)利要求22所述的神經(jīng)干細(xì)胞或其衍生物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療神經(jīng)細(xì)胞損傷所引起的疾病。
24.一種治療神經(jīng)細(xì)胞損傷所引起的疾病的方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求22所述的神經(jīng)干細(xì)胞或其衍生物引入患者體內(nèi)。
25.一種制備神經(jīng)細(xì)胞的方法，其特征在于，將權(quán)利要求22所述的神經(jīng)干細(xì)胞在適于分化的條件下進行培養(yǎng)。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，利用含有I% N2 supplement、I %非必需氨基酸、O. I %肝素，并添加有濃度均為10ng/mL的神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、⑶NF、CNTF和IGF 的DMEM/F12培養(yǎng)基，對所述神經(jīng)干細(xì)胞進行培養(yǎng)，以便獲得不同類型的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
27.一種用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的系統(tǒng)，其特征在于，包括分離裝置，所述分離裝置用于從人尿液中分離人尿液脫落細(xì)胞；轉(zhuǎn)化裝置，所述轉(zhuǎn)化裝置與所述分離裝置相連，并且設(shè)置有攜帶編碼選自0ct4、Sox2、 Klf4以及miR302的至少一種多功能干細(xì)胞因子的核酸序列的載體，以便對所述人尿液脫落細(xì)胞進行轉(zhuǎn)化；以及轉(zhuǎn)分化裝置，所述轉(zhuǎn)分化裝置與所述轉(zhuǎn)化裝置相連，并且設(shè)置有權(quán)利要求1-5任一項所述的培養(yǎng)基，用于對所述經(jīng)過轉(zhuǎn)化的人尿液脫落細(xì)胞進行轉(zhuǎn)分化，以便誘導(dǎo)所述經(jīng)過轉(zhuǎn)化的人尿液脫落細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞。
28.—種篩選誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化的化合物的方法，其特征在于，包括以下步驟將權(quán)利要求22所述的神經(jīng)干細(xì)胞與候選化合物接觸；以及檢測接觸所述候選化合物前后神經(jīng)干細(xì)胞的多能性，其中，基于接觸所述候選化合物后，所述神經(jīng)干細(xì)胞的多能性是否降低，判斷所述候選化合物是否具有誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化的活性。
29.一種治療神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)損傷疾病的方法，其特征在于，包括以下步驟 分離患者的體細(xì)胞；根據(jù)權(quán)利要求15-21任一項所述的方法，基于所述體細(xì)胞，制備神經(jīng)干細(xì)胞；以及將所述神經(jīng)干細(xì)胞引入所述患者體內(nèi)。
30.一種鑒定制劑對神經(jīng)系統(tǒng)是否具有影響的方法，其特征在于，包括以下步驟將所述制劑與權(quán)利要求22所述的神經(jīng)干細(xì)胞接觸；以及對接觸前后的神經(jīng)干細(xì)胞進行檢測，其中，基于所述神經(jīng)干細(xì)胞的行為變化，判斷所述制劑對神經(jīng)系統(tǒng)是否具有影響。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基及其用途。其中，用于制備神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其適于干細(xì)胞生長；以及細(xì)胞信號通路抑制劑，其為選自GSK抑制劑、MEK抑制劑、TGF-β抑制劑、ROCK抑制劑和BMP抑制劑的至少一種。通過使用本發(fā)明的培養(yǎng)基對體細(xì)胞進行培養(yǎng)，尤其是對表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的體細(xì)胞進行培養(yǎng)，能夠有效地使得體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞，并且時間大大縮短。
文檔編號C12N5/10GK102604894SQ20121005109
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月29日
發(fā)明者潘光錦, 王麗輝, 王淋立, 薛燕婷, 裴端卿 申請人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院