專利名稱：一種從里氏木霉中分離多糖水解酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白純化技術(shù)，具體的說是一種從里氏木霉中分離多糖水解酶的方法。
背景技術(shù)：
木質(zhì)纖維素是世界上最豐富、最廉價的可再生資源，包括甘蔗渣、秸桿、玉米芯等。降解為單糖，發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇被看做是對其最有效的利用方式之一。降低燃料乙醇的生產(chǎn)成本成為其發(fā)展的核心部分。到目前為止，許多策略都已經(jīng)開發(fā)出來，其中以纖維素酶等為中心，旨在研發(fā)高效地木質(zhì)纖維素糖化催化劑無疑是最有效的策略之一。隨著技術(shù)的進步，越來越多參與木質(zhì)纖維素降解的基因及相對應的水解酶，被分離和純化出來。其中來自里氏木霉(Trichoderma reesei)的多糖水解酶系復雜而完整,能夠高效地降解木質(zhì)纖維素為單糖。分離、純化其中的各種組分，是研究其酶學性質(zhì)，研發(fā)高效酶制劑的基礎(chǔ)和前提。遺憾的是，關(guān)于這些酶組份的分離純化，大都需要復雜的層析步驟或者只能分離其中的一類組份，如纖維素酶、β -木糖苷酶等，這不能滿足協(xié)同性等，尤其是纖維素酶與木聚糖酶間協(xié)同性研究的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目在于提供一種從里氏木霉中分離多糖水解酶的方法。為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明 采用的技術(shù)方案為:一種從里氏木霉中分離多糖水解酶的方法，將里氏木霉粗酶制劑溶解于20mMTris-HCl,pH7.0 緩沖液中，以 0.5M NaCl 在 0.8-1.2mL/min 的流速下，使用 Mono Q 5/50GL陰離子交換柱進行梯度分離，根據(jù)紫外吸收峰分別收集11.5-65.5min，70.5-75.7min,75.7-81.0min, 81.0-102.5min對應的洗脫組份，即為多糖水解酶，并分別將上述收集組分
進一步的純化，將根據(jù)紫外吸收峰收集11.5-65.5min組分凍干后，溶于0.5_lmL超純水中，以0.9-1.lmL/min的流速,使用凝膠過濾柱Superdex 75pg層析,收集51.5-55.5min對應的洗脫組份，即為外切葡聚糖酶II (CBH II);收集58.5-63.5min對應的洗脫組份，即為內(nèi)切葡聚糖酶II (EG II)；將根據(jù)紫外吸收峰收集70.5-75.7min組分凍干后，溶于0.5_lmL超純水中，以0.9-1.lmL/min的流速,使用凝膠過濾柱Superdex 75pg層析,收集47.5-51.0min對應的洗脫組份，即為木聚糖酶；收集53.0-61.5min對應的洗脫組份，即為內(nèi)切葡聚糖酶I (EG I)；將根據(jù)紫外吸收峰收集75.7-81.0min凍干后，溶于0.5-lmL超純水中，以
0.9-1.lmL/min的流速,使用凝膠過濾柱Superdex 200pg層析,收集68.5-74.5min對應的洗脫組份，即為木糖苷酶；收集77.0-82.5min對應的洗脫組份，即為β -葡萄糖苷酶(BGL)；將根據(jù)紫外吸收峰收集81.0-102.5min凍干后，溶于0.5-lmL超純水中，以0.9-1.lmL/min的流速,使用凝膠過濾柱Superdex 75pg層析,收集52.5-62.5min對應的洗脫組份，即為外切葡聚糖酶I (CBH I)。將所述Mono Q 5/50GL陰離子交換柱以0.8_L 2mL/min的流速，使用20mMTris-HCl, pH7.0緩沖液預平衡，待用。將所述凝膠過濾柱Superdex 75pg和凝膠過濾柱Superdex 200pg，以0.9-1.lmL/min的流速，使用TBS預平衡，待用。所述TBS為50mMTris-HCl pH 7.5,150mM NaCl。所述將里氏木霉粗酶制劑為將里氏木霉培養(yǎng)于以I %水葫蘆為唯一碳源的培養(yǎng)基中，而后采用飽和硫酸銨沉淀收集20% -60%飽和度得到沉淀，待用。所述I %水葫蘆為唯一碳源的培養(yǎng)基成分=Mandel培養(yǎng)基中添加I %的水葫蘆作為唯一碳源。本發(fā)明所具有的優(yōu)點:本發(fā)明從粗酶混合物中分離多種單一酶組份方法簡便，且得到較多水解酶組份，所純化得到的七種單一酶組份均保持有活性


圖1為本發(fā)明實施例提供的純化七種來自里氏木霉的多糖水解酶的具體流程圖。圖2為本發(fā)明實施例提供的經(jīng)陰離子交換層析后得到的洗脫圖譜。圖3為本發(fā)明實施例提供的經(jīng)凝膠過濾層析后得到的洗脫圖譜。本發(fā)明的目的、優(yōu)點將結(jié)合實施例，參照附圖、表進一步說明。
具體實施例方式本發(fā)明給出詳細具體的分離純化方法參見流程見圖1。實施例1 從里氏木霉中分離多糖水解酶的方法:1.粗酶制劑:將里氏木霉培養(yǎng)于以1%水葫蘆為唯一碳源的培養(yǎng)基中，在30°C下培養(yǎng)7天后，使用硫酸銨沉淀上清中的纖維素酶，并收集20-60%飽和度沉淀的組份，經(jīng)除鹽、凍干后為粗酶制劑，待用。以I %水葫蘆為唯一碳源的培養(yǎng)基為尿素，0.3g/L ； (NH4)2SO4,
1.4g/L ；KH2P04, 2g/L ；CaCl2,0.3g/L ；MgS04.7H20，0.3g/L ;蛋白胨，0.75g/L ;酵母提取物，0.25g/L ；FeS04.7H20, 5mg/L ；MnSO4.4H20,1.6mg/L ；ZnSO4.7H20,1.4mg/L ；CoCl2.7H20,20mg/L ;吐溫 80,0.1% (v/v);水葫蘆，10g/L。2.陰離子交換層析。將上述粗酶制劑溶于A液(A液為20mM Tris-HCl, pH7.0)中，使溶解于A液的粗酶制劑濃度大約為2mg/mL，使用0.45 μ M的濾器過濾,待用；室溫下，以lmL/min的流速，將粗酶制上樣于A液預平衡的Mono Q 5/50GL柱中，使用A液，以lmL/min的流速洗脫直至沒有紫外吸收后為止，然后使用0.5M NaCl進行梯度洗脫。根據(jù)紫外吸收峰和出現(xiàn)的時間，分別收集11.5-65.5min,70.5-75.7min,75.7-81.0min,81.0-102.5min對應的洗脫組份，即為多糖水解酶，并分別指定為樣品1、2、3和4，。置于-80°C冰箱30min后，轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機中，干燥24h(參見圖2)。室溫下，樣品I溶于ImL超純水中，然后以lmL/min流速上樣于TBS (50mM Tris-HClpH 7.5,150mM NaCl)預平衡的凝膠過濾柱Superdex 75pg。收集51.5-55.5min對應的洗脫組份，即為外切葡聚糖酶II (CBH II);收集58.5-63.5min對應的洗脫組份，即為內(nèi)切葡聚糖酶II (EG II)(參見圖3A)；
室溫下，樣品2溶于ImL超純水中，然后以lmL/min流速上樣于TBS (50mM Tris-HClpH 7.5,150mM NaCl)預平衡的凝膠過濾柱Superdex 75pg。收集47.5-51.0min對應的洗脫組份，即為木聚糖酶；收集53.0-61.5min對應的洗脫組份，即為內(nèi)切葡聚糖酶I (EG I)(參見圖3B)；室溫下，樣品3溶于ImL超純水中，然后以lmL/min流速上樣于TBS (50mM Tris-HClpH 7.5,150mM NaCl)預平衡的凝膠過濾柱Superdex 200pg。收集68.5-74.5min對應的洗脫組份，即為木糖苷酶；收集77.0-82.5min對應的洗脫組份，即為β -葡萄糖苷酶(BGL)(參見圖 3C)；室溫下，樣品4溶于ImL超純水中，然后以lmL/min流速上樣于TBS(50mM Tris-HClpH 7.5,150mM NaCl)預平衡的凝膠過濾柱Superdex 75pg。收集52.5-62.5min對應的洗脫組份，即為外切葡聚糖酶I (CBH I)(參見圖3D)。將上述純化后的七種纖維素水解酶降解不同的底物，通過DNS檢測生成的還原糖濃度或405nm處吸收檢測生成產(chǎn)物對硝基苯酚的濃度表征各組份活性(參見表I)，表明每一組份，均保持其多糖水解活性。表I
權(quán)利要求
1.一種從里氏木霉中分離多糖水解酶的方法，其特征在于:將里氏木霉粗酶制劑溶解于20mM Tris-HCl, ρΗ7.0緩沖液中，以0.5Μ NaCl在0.8-1.2mL/min的流速下，使用Mono Q 5/50GL陰離子交換柱進行梯度分離，根據(jù)紫外吸收峰分別收集11.5-65.5min,70.5-75.7min, 75.7-81.0min，81.0-102.5min對應的洗脫組份，即為多糖水解酶，并分別將上述收集組分進一步的純化， 將根據(jù)紫外吸收峰收集11.5-65.5min組分凍干后，溶于0.5_lmL超純水中，以0.9-1.lmL/min的流速,使用凝膠過濾柱Superdex 75pg層析,收集51.5-55.5min對應的洗脫組份，即為外切葡聚糖酶II (CBH II);收集58.5-63.5min對應的洗脫組份，即為內(nèi)切葡聚糖酶II (EG II)； 將根據(jù)紫外吸收峰收集70.5-75.7min組分凍干后，溶于0.5_lmL超純水中，以0.9-1.lmL/min的流速,使用凝膠過濾柱Superdex 75pg層析,收集47.5-51.0min對應的洗脫組份，即為木聚糖酶；收集53.0-61.5min對應的洗脫組份，即為內(nèi)切葡聚糖酶I (EG I)； 將根據(jù)紫外吸收峰收集75.7-81.0min凍干后，溶于0.5-lmL超純水中，以0.9-1.1mL/min的流速,使用凝膠過濾柱Superdex 200pg層析,收集68.5-74.5min對應的洗脫組份，即為β -木糖苷酶；收集TL 0-82.5min對應的洗脫組份，即為β _葡萄糖苷酶(BGL)； 將根據(jù)紫外吸收峰收集81.0-102.5min凍干后，溶于0.5_lmL超純水中，以0.9-1.1mL/min的流速,使用凝膠過濾柱Superdex 75pg層析,收集52.5-62.5min對應的洗脫組份，即為外切葡聚糖酶I (CBH I)。
2.按權(quán)利要求1所述的從里氏木霉中分離多糖水解酶的方法，其特征在于:將所述Mono Q 5/50GL 陰 離子交換柱以 0.8-1.2mL/min 的流速，使用 20mM Tris-HCl, pH7.0 緩沖液預平衡，待用。
3.按權(quán)利要求1所述的從里氏木霉中分離多糖水解酶的方法，其特征在于:將所述凝膠過濾柱Superdex 75pg和凝膠過濾柱Superdex 200pg,以0.9-1.lmL/min的流速,使用TBS預平衡，待用。
4.按權(quán)利要求3所述的從里氏木霉中分離多糖水解酶的方法，其特征在于:所述TBS為 50mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl。
5.按權(quán)利要求1所述的從里氏木霉中分離多糖水解酶的方法，其特征在于:所述將里氏木霉粗酶制劑為將 里氏木霉培養(yǎng)于以1%水葫蘆為唯一碳源的培養(yǎng)基中，而后采用飽和硫酸銨沉淀收集20% -60%飽和度得到沉淀，待用。
6.按權(quán)利要求5所述的從里氏木霉中分離多糖水解酶的方法，其特征在于:所述1%水葫蘆為唯一碳源的培養(yǎng)基成分=Mandel培養(yǎng)基中添加I %的水葫蘆作為唯一碳源。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白純化技術(shù)，具體的說是一種從里氏木霉中分離多糖水解酶的方法。將里氏木霉粗酶制劑溶解于20mM Tris-HCl，pH7.0緩沖液中，以0.5M NaCl在0.8-1.2mL/min的流速下進行Mono QTM5/50GL陰離子交換柱梯度洗脫，在線紫外監(jiān)測蛋白，根據(jù)紫外吸收峰分別收集11.5-65.5min，70.5-75.7min，75.7-81.0min，81.0-102.5min對應的洗脫組份，即為多糖水解酶；所述多糖水解酶進一步的純化得到外切葡聚糖酶II(CBH II)、內(nèi)切葡聚糖酶II(EG II)、木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶I(EG I)、β-木糖苷酶、β-葡萄糖苷酶(BGL)和外切葡聚糖酶I(CBH I)。本發(fā)明從粗酶混合物中分離多種單一酶組份方法簡便，且得到較多水解酶組份，所純化得到的七種單一酶組份均保持有活性。
文檔編號C12N9/42GK103255117SQ20121005275
公開日2013年8月21日 申請日期2012年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月15日
發(fā)明者劉愛驊, 祁環(huán), 梁波, 白罰利 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所