專利名稱:一種紅樹林克雷伯氏菌及其在生產(chǎn)1,3-丙二醇中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種紅樹林克雷伯氏菌及其在生產(chǎn)1, 3-丙二醇中的應(yīng)用。
背景技術(shù):
1,3-丙二醇(roo)是一種重要的化工原料,可作為有機(jī)溶劑,應(yīng)用于耐壓高潤滑劑、染料、油墨、防凍劑等行業(yè)。PDO可用來合成雜環(huán)、藥物中間體、聚酯和聚氨酯,尤其是可作為聚酯PTT的單體。PTT是繼50年代聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)、70年代聚對(duì)苯二甲酸丁二醇酯(PBT)之后實(shí)現(xiàn)工業(yè)規(guī)模的新的可成纖聚酯高分子材料,是一種極有發(fā)展前途的新型聚酯材料。1998年P(guān)TT被美國評(píng)為六大石化新產(chǎn)品之一。PTT與PET、PBT相比除具有聚酯的耐化學(xué)性外,還具有其它一些更優(yōu)良的特性。如尼龍的彈性恢復(fù)性;在全范圍無需添加特殊化學(xué)藥品即能呈現(xiàn)良好的連續(xù)印染特性;抗紫外、臭氧和氮氧化合物的著色性;抗內(nèi)應(yīng)力;低水吸附、低靜電以及良好的可生物降解性;可循還利用性等。由于PTT的具有以上優(yōu)良特性,它在地毯工業(yè)、服裝材料、工程熱塑料以及其它眾多領(lǐng)域有著很廣泛的應(yīng)用。生產(chǎn)PTT纖維的關(guān)鍵在于單體原料PDO的來源。PTT占領(lǐng)市場(chǎng)的關(guān)鍵在于價(jià)格, 而PTT的價(jià)格主要取決于PDO的價(jià)格。由于不能廉價(jià)制得roo,制約了 PTT的研制和市場(chǎng)開拓。直到90年代中期PDO實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn),使得PDO價(jià)格大大降低,PTT才開始工業(yè)化
生產(chǎn)和應(yīng)用。Dupont和Shell兩家跨國公司曾采用化學(xué)合成路線,以環(huán)氧乙烷或丙烯為原料生產(chǎn)roo?;瘜W(xué)合成法生產(chǎn)roo的缺點(diǎn)是副產(chǎn)物多,選擇性和產(chǎn)率較低,操作條件需要高溫高壓,設(shè)備投資巨大,原料不可再生;同時(shí)由于產(chǎn)量有限,長期以來PDO售價(jià)偏高。目前1,3-丙二醇的生產(chǎn)方法主要是微生物發(fā)酵法。與化學(xué)合成法相比,微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1,3_丙二醇具有顯著的優(yōu)點(diǎn)1、利用成本較低的可再生資源(如甘油、玉米、淀粉)為原料;2、生產(chǎn)條件溫和,操作簡(jiǎn)便,不需貴重金屬催化劑;3、選擇性好,副產(chǎn)物較少, 易于分離純化;4、環(huán)境污染小。微生物發(fā)酵法是以生物技術(shù)為特征的“綠色工業(yè)”向傳統(tǒng)石油化工提出的強(qiáng)有力的挑戰(zhàn),具有重要的現(xiàn)實(shí)意義,因而越來越受到重視。生物合成法生產(chǎn)1,3-丙二醇是利用微生物歧化甘油產(chǎn)生。至今所有被發(fā)現(xiàn)的1, 3-丙二醇生產(chǎn)菌種均為細(xì)菌,其中克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、弗氏朽1檬酸桿菌 (Citrobacter freudii)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)具有較高的 I, 3-丙二醇轉(zhuǎn)化率和1,3-丙二醇生產(chǎn)強(qiáng)度,具有較高的開發(fā)前景,從而得到了較多關(guān)注。目前被用來生產(chǎn)1,3_丙二醇的克雷伯氏菌主要分離自陸地土壤中??死撞暇l(fā)酵甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇的同時(shí)會(huì)生產(chǎn)多種副產(chǎn)物如乙酸、乳酸、丁二酸、乙醇、2,3-丁二醇等,其中乙酸、乳酸對(duì)發(fā)酵存在較強(qiáng)的抑制作用;由于發(fā)酵過程中自動(dòng)控制pH需要流加堿液,會(huì)形成乙酸鈉、乳酸鈉等有機(jī)酸鹽,對(duì)發(fā)酵過程也存在抑制作用;隨著副產(chǎn)物有機(jī)酸與有機(jī)酸鹽的積累,抑制了 1,3_丙二醇的生產(chǎn),到發(fā)酵后期,1,3_丙二醇增長緩慢。如果菌種對(duì)有機(jī)酸或有機(jī)酸鹽耐受性增強(qiáng),那么菌種發(fā)酵生產(chǎn)1,3_丙二醇的能力可以得到進(jìn)一步提聞。紅樹林是海洋與陸地過渡的特殊生態(tài)環(huán)境,兼具有陸地和海洋的特征。紅樹林土壤的PH值低,呈酸性;由于海水的周期浸潰以及紅樹林與土壤間元素的循環(huán)作用,紅樹林土壤的含鹽量較高,具有鹽潰化特征;紅樹林土壤的有機(jī)質(zhì)含量較高,其生態(tài)系統(tǒng)中具有豐富多樣的微生物。如果能從紅樹林底泥中分離出克雷伯氏菌,其對(duì)有機(jī)酸和有機(jī)酸鹽的耐受性可能較陸地分離株更強(qiáng),該特征對(duì)工業(yè)生產(chǎn)存在潛在的利用價(jià)值。目前還沒有利用來源于海洋或海洋與陸地過渡生境的克雷伯氏菌發(fā)酵生產(chǎn)1, 3-丙二醇的報(bào)導(dǎo)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種從海洋紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中分離、篩選的具有生產(chǎn) I,3-丙二醇優(yōu)良性能的克雷伯氏菌新菌株肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HSL4,該菌種已于2011年3月21日保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),地址中國武漢市武漢大學(xué),保藏編號(hào)CCTCC NO M 2011075。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4的分離、篩選和鑒定采集廣東省深圳市紅樹林公園潮水退后的紅樹林間表層底泥,進(jìn)行細(xì)菌富集、選擇性培養(yǎng),挑選菌落再進(jìn)行純培養(yǎng),得到一系列不同的菌株。然后采用搖瓶發(fā)酵,初步測(cè)試所挑選的菌株發(fā)酵甘油產(chǎn)1,3_丙二醇的能力;挑選發(fā)酵能力最強(qiáng)的菌株HSL4,進(jìn)行菌種鑒定。采用API 20E試劑條進(jìn)行生理生化反應(yīng)鑒定,API 20E試劑條鑒定結(jié)果表明所分離到的菌株HSL4屬于腸桿菌科克雷伯氏菌屬。常規(guī)提取菌株HSL4的基因組DNA,PCR其16S rDNA, 并序列測(cè)定,其16S rDNA序列如SEQ ID NO. I所示,將16S rDNA序列通過GenBank中的 BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)與數(shù)據(jù)庫中已測(cè)序的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的16S rDNA相似性最高,超過99% ;鑒定結(jié)果表明所分離的菌株HSL4為肺炎克雷伯氏菌的新菌株,命名為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HSL4,該菌種已于2011年3月21日保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),地址中國武漢市武漢大學(xué),保藏編號(hào)CCTCC NO M 2011075。采用流加補(bǔ)料批式發(fā)酵的方法,用分離的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4發(fā)酵甘油生產(chǎn)I, 3-丙二醇,發(fā)酵36小時(shí),發(fā)酵液中1,3_丙二醇濃度達(dá)到 80.08g/l,生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)2. 22g/lh,質(zhì)量轉(zhuǎn)化率達(dá)0.446g/g。表明該菌種具有較強(qiáng)的1,3_丙二醇生產(chǎn)能力,具備工業(yè)開發(fā)的潛力。因此本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HSL4 在生產(chǎn)I,3-丙二醇中的應(yīng)用。本發(fā)明從海洋紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中分離、篩選的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4是肺炎克雷伯氏菌的一個(gè)新株,其具有較強(qiáng)的1,3_丙二醇生產(chǎn)能力;該菌株分離自海洋紅樹林生態(tài)系統(tǒng),其對(duì)有機(jī)酸的耐受性較強(qiáng)。本發(fā)明的肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae)HSL4對(duì)工業(yè)生產(chǎn)存在潛在的利用價(jià)值。本發(fā)明的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4于2011年3月21日保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),地址中國武漢市武漢大學(xué),保藏編號(hào)=CCTCC NO M 2011075。
圖I是肺炎克雷伯氏菌HSL4發(fā)酵甘油生產(chǎn)1,3_丙二醇隨發(fā)酵時(shí)間的變化圖,其中PDO表示I,3-丙二醇,BDO表示2、3-丁二醇,SUC表示丁二酸,LAC表示乳酸,ACE表示乙酸,ETH表示乙醇。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明,而不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例I :一、菌種的分離鑒定 I、采樣樣品采自廣東省深圳市紅樹林公園潮水退后的紅樹林間表層底泥,樣品采集后裝入滅菌的聚乙烯管中,帶回實(shí)驗(yàn)室立即處理。2、菌種分離、篩選(I)細(xì)菌分離將樣本與磷酸鹽緩沖液PBS以質(zhì)量比I : 50的比例混勻,靜置 30min,棄去下層沉淀,收集上層清液,5000g離心IOmin,取沉淀,用Iml PBS重懸沉淀。取 IOOu I液體涂布于一種高效的克雷伯氏菌分離培養(yǎng)基MIAC,37 °C培養(yǎng)18 24h。MIAC培養(yǎng)基的制備方法如下蛋白胨20. 0g、肌醇5. 0g、阿東醇5. 0g、氯化鈉5. 0g、豬膽鹽5. 0g、瓊脂15. 0g、蒸餾水1000. 0ml,將各成分加入蒸餾水中,加熱溶解,調(diào)節(jié)pH至7. 0±0. 2,加入
0.I %結(jié)晶紫水溶液1ml,I %中性紅水溶液5ml,分裝適當(dāng)容器,115°C高壓滅菌15min,溫度降至60°C左右,加入100mg/ml羧節(jié)青霉素(經(jīng)0. 22 y m濾膜過濾除菌)Iml,充分混勻,制成平板。選擇培養(yǎng)18 24h后,挑選單個(gè)光滑、濕潤、邊緣整齊的紅色菌落,直經(jīng)為2 4m m,典型菌落突起、黏稠,相鄰菌落會(huì)發(fā)生融合現(xiàn)象,從平板的背面觀察,菌落具深紅色心。將挑選的菌落再次進(jìn)行平板劃線,培養(yǎng),挑選大克隆保存并進(jìn)行進(jìn)一步篩選。(2)菌種篩選將挑選的克隆進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,篩選生產(chǎn)1,3_丙二醇能力強(qiáng)的菌種進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。篩選所用培養(yǎng)基如下LB 培養(yǎng)基(g.L—1):酵母粉 Sg.L—1,蛋白胨 IOg .L^NaCl IOg L—1,瓊脂 IOg L—1, 調(diào)節(jié)至PH 7.0。用于克雷伯氏菌菌種的短期保藏及活化。種子及發(fā)酵培養(yǎng)基見表I :表I :培養(yǎng)基組成表(L
權(quán)利要求
1.肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)HSL4,其保藏編號(hào)CCTCC NO M 2011075。
2.權(quán)利要求I所述的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)HSL4在生產(chǎn)I, 3_丙二醇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種紅樹林克雷伯氏菌及其在生產(chǎn)1,3-丙二醇中的應(yīng)用。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)HSL4,該菌種已于2011年3月21日保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),地址中國武漢市武漢大學(xué),保藏編號(hào)CCTCC NOM 2011075。本發(fā)明從海洋紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中分離、篩選的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4是肺炎克雷伯氏菌的一個(gè)新株,其具有較強(qiáng)的1,3-丙二醇生產(chǎn)能力;并且該菌株分離自海洋紅樹林生態(tài)系統(tǒng),其對(duì)有機(jī)酸的耐受性較強(qiáng)。因此本發(fā)明的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4對(duì)工業(yè)生產(chǎn)存在潛在的利用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102604863SQ20121005323
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月1日
發(fā)明者付靜, 周勝, 李莉莉, 秦啟偉, 魏京廣 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院南海海洋研究所