專利名稱：氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒及其構(gòu)建與在菌蛻制備中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種質(zhì)粒載體，特別涉及一種氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒及其構(gòu)建方法，以及其在制備大腸桿菌菌蛻中的用途，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
細菌菌蛻(Bacterial ghost)是革蘭氏陰性菌被噬菌體PhiX174的裂解蛋白E 裂解后形成的完整細菌空殼，這種非變性的基因滅活方式使菌蛻保留了和活菌一樣的細菌胞膜結(jié)構(gòu)和相關(guān)抗原蛋白，從而誘導(dǎo)機體的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答。菌蛻外膜的天然的高度保守結(jié)構(gòu) PAMP (pathogen-associated molecular patterns)，例如脂多糖、妝聚糖、 CPG、菌毛等，能被免疫細胞通過模式識別受體識別，有效地被樹突狀細胞和巨噬細胞吞噬， 并有效地促進樹突狀細胞的成熟和活化。菌蛻的這些生物學(xué)特點使其可直接作為疫苗使用，還可作為遞呈異源抗原的重組疫苗及作為DNA疫苗甚至藥物的遞送載體。另外，菌蛻可以通過發(fā)酵方式生產(chǎn)，且冷凍干燥的菌蛻在室溫下可長期保持，而不會造成效率的損失。細菌菌蛻的形成是通過對噬菌體PhiX174的裂解基因E的嚴格表達調(diào)控實現(xiàn)的。 裂解基因E可以受控于多個表達系統(tǒng)，如ApL/pR-cI857, LacPO-LaclH啟動與阻隔物)、 PTol-xylS以及PBAD_araC等，其中應(yīng)用最廣泛的是在λ pL/pR_cl857轉(zhuǎn)錄控制下實現(xiàn)基因的可控表達。基因E的可控表達介導(dǎo)的細菌裂解已經(jīng)成功地應(yīng)用于各種大腸桿菌菌株、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、霍亂弧菌、肺炎克雷伯氏菌、幽門螺旋桿菌、胸膜肺炎放射桿菌、流感嗜血桿菌、溶血巴氏桿菌、多殺巴氏桿菌、遲鈍愛德華菌、鰻弧菌、嗜水氣單胞菌等。 應(yīng)用范圍之廣說明只要將基因E裂解框引入到適當(dāng)?shù)妮d體中，E蛋白介導(dǎo)的裂解可能會在每種革蘭氏陰性菌中發(fā)生。目前已經(jīng)構(gòu)建的基因E介導(dǎo)的裂解質(zhì)粒多數(shù)利用氨芐青霉素作為抗性篩選標記， 還有一些具有卡那霉素、四環(huán)素或慶大霉素抗性篩選標記。由于細菌耐藥性現(xiàn)象越來越常見，許多細菌對氨芐青霉素、卡那霉素等常用抗生素產(chǎn)生耐藥，無法利用這些抗生素作為篩選標記。但許多病原菌如副溶血性弧菌、霍亂弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、大腸桿菌0157、變形桿菌、沙門菌、志賀菌等均對氯霉素敏感，還有大多數(shù)水生生物病原菌如柱狀嗜纖維菌、 柱狀粘纖維菌、熒光假單胞菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、點狀氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌及魯克氏耶爾森氏菌等均對氯霉素敏感或者高度敏感。因此，利用氯霉素作為抗性篩選標記能使E蛋白介導(dǎo)的裂解應(yīng)用到更廣泛的細菌菌株中。構(gòu)建氯霉素抗性的溫控裂解質(zhì)粒是許多病原菌能夠成功形成菌蛻的前提。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種新的氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒，并提供了其構(gòu)建方法，以及其在菌蛻制備中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat，由噬菌體PhiX174裂解基因E (如SEQ No. 3所示)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat，如SEQ No. 4所示)和原核溫控表達載體 PBV220 組成。所述氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat的構(gòu)建方法為以卩遼菌體PhiX174 RFI DNA為模板、SEQ No. I和SEQ No. 2所示DNA為引物進行PCR擴增，獲得噬菌體PhiX174 裂解基因E，然后將其與經(jīng)EcoR I和Pst I雙酶切的pBV220載體連接，獲得溫控裂解質(zhì)粒 pBV-geneE ;將質(zhì)粒pLysS經(jīng)Acc II酶切，獲得1787bp的包含側(cè)翼調(diào)控序列的cat基因，然后用T4 DNA Iigase將cat基因與經(jīng)Sca I單酶切的pBV-geneE進行連接，獲得氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat。所述氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat能夠用于制備菌脫,具體應(yīng)用方式舉例如下將氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat電擊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中；電轉(zhuǎn)化后涂布含氯霉素的LB瓊脂平板，培養(yǎng)，通過菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子；然后，將轉(zhuǎn)化成功的含pBV-geneE-cat的大腸桿菌單克隆接種于含氯霉素的LB液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)， 然后再轉(zhuǎn)接于含氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD6tltol達O. 4-0. 6，將培養(yǎng)物迅速調(diào)至42°C培養(yǎng)以誘導(dǎo)E基因的表達，繼續(xù)培養(yǎng)，即得大腸桿菌菌蛻。上述制備菌蛻的方法具體如下將氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat電擊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，所述的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞購自TaKaRa，或是參照Sambrook等的方法(分子克隆實驗指南)制備，電轉(zhuǎn)化儀(Bio-Rad, California, USA) 的電擊參數(shù)為1. 5kV/cm、25 μ F、200 Ω、4· Oms,電轉(zhuǎn)化后涂布含37 μ g/mL氯霉素的LB瓊脂平板，30°C培養(yǎng)16小時，通過菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子。將含pBV-geneE-cat的BL21(DE3) 單克隆接種于5mL含37 μ g/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基，30°C振蕩(200r/min)培養(yǎng)過夜， 然后按1-2% (v/v)轉(zhuǎn)接于50mL含37 μ g/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)至 OD600nm達O. 4-0. 6。將培養(yǎng)物迅速調(diào)至42°C培養(yǎng)以誘導(dǎo)E基因的表達，繼續(xù)培養(yǎng)4h，即得大腸桿菌菌蛻。本發(fā)明構(gòu)建的氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat能夠在對氯霉素敏感的大腸桿菌中穩(wěn)定存在，且能夠誘導(dǎo)其發(fā)生較高效率的裂解，成功制備大腸桿菌菌蛻，裂解效率可高達99. 998%。本發(fā)明構(gòu)建的氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat,可以在大腸桿菌中穩(wěn)定的復(fù)制，并能夠高效表達氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，從而產(chǎn)生氯霉素抗性，以此來作為抗性篩選標記，適用于多數(shù)病原菌，如副溶血性弧菌、霍亂弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、大腸桿菌0157、 變形桿菌、沙門菌、志賀菌、柱狀嗜纖維菌、柱狀粘纖維菌、熒光假單胞菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、點狀氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌及魯克氏耶爾森氏菌等，應(yīng)用廣泛，且可高效表達裂解基因E，制備的菌蛻裂解效率高，可達99. 998%。


圖I :本發(fā)明構(gòu)建氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat的流程示意圖；圖2 :含氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat的大腸桿菌BL21 (DE3)的裂解動力學(xué)曲線；圖3 :大腸桿菌BL21 (DE3)菌蛻的透射電鏡照片。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步闡釋本發(fā)明，本發(fā)明構(gòu)建的氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat的結(jié)構(gòu)特征和優(yōu)勢將隨著描述而更為清晰。下述實施例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。試驗材料質(zhì)粒PBV220、質(zhì)粒pLysS、菌株BL21 (DE3)為本實驗室保存； Enterobacteria phage phiX174 RFI DNA,限制性內(nèi)切酶，T4DNA ligase, PCR 相關(guān)試劑， Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit,TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit 均購于購于TaKaRa寶生物(工程)大連有限公司；引物合成與測序由華大基因(BGI)完成。實施例I、氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat的構(gòu)建I. lPhiX174裂解基因E的克隆根據(jù)GenBank中PhiX174基因E的編碼序列設(shè)計引物geneE-F :5’ -ATCAGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTG-3’ (SEQ No. I)，引入 EcoR I 限制性酶切位點；geneE-R 5，~GGCCTGCAGCAGAACGTTTTTTACCTTTAG~3，(SEQ No. 2)，引入 Pst I 限制性酶切位點。引物由華大基因合成。以PhiX174RFIDNA為模板通過PCR擴增基因E。PCR反應(yīng)體系為 TaKaRa Ex Taq I. 2U, IOXEx Taq Buffer (Mg2+Plus) 5 μ L, dNTP Mixture (各 2. 5mM)4y L, PhiX174RFI DNA2ng, geneE-F (20 μ M) I μ L, geneE-R (20 μ Μ) I μ L，補水到 50 μ L0 PCR 反應(yīng)程序為 94°C預(yù)變性 5min，94°C 45s, 56°C 45s, 72°C 40s，28 個循環(huán)，72°C延伸lmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收約300bp的片段，用EcoR I和Pst I進行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，獲得geneE。12溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE的構(gòu)建質(zhì)粒pBV220經(jīng)EcoR I和Pst I雙酶切，酶切反應(yīng)體系為EcoR I 10U、Pst I 10U、 IOXH Buffer 2 μ L、pBV2200. 8 μ g、補水至20μ L，37°C酶切l(wèi)h，回收酶切產(chǎn)物，獲得線性化pBV220。將線性化pBV220與geneE連接，連接反應(yīng)體系為T4DNA ligase 350U、geneE 0.4pmol、pBV O. 03pmol、10XT4DNALigase Buffer 2· 5 μ L，補水至 25 μ L，16°C連接 12h， 并熱擊轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α。轉(zhuǎn)化的DH5 α先在無氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中30°C、 180r/min條件下振蕩培養(yǎng)lh，然后將其涂布在含有氨芐青霉素50 μ g/ml的LB平板上， 30°C培養(yǎng)16h。通過菌液PCR篩選陽性克隆，并測序鑒定。基因E序列正確的轉(zhuǎn)化子進行增菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，命名為pBV-geneE。I. 3氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cat平末端片段的獲得質(zhì)粒pLysS經(jīng)AccII 單酶切，酶切體系為 Acc II 10U、10XM Buffer 2 μ L>pLysS 0. 6μ g、補水至20μ L，37°C酶切l(wèi)h。瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物，切膠回收約1800bp條帶， 獲得包含啟動子區(qū)的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cat片段。14pBV-geneE線性化平末端片段的獲得質(zhì)粒pBV220_geneE 經(jīng) Sca I 酶切，酶切體系為 Sca I 10UU0XH Buffer 2 μ L、 PBV2200. 8 μ g、補水至20 μ L，37°C酶切Ih。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收約3. 6kb條帶，獲得pBV-geneE線性化平末端片段。
I. 5pBV_geneE_cat 質(zhì)粒的構(gòu)建將cat基因片段憐酸化處理，反應(yīng)體系為T4polynucleotide Kinase 12U、cat 10pmol、5 μ L10XT4 Polynucleotide Kinase Buffer、補水至 50 μ L, 37 °C 處理 lh。將線性化質(zhì)粒pBV-geneE去磷酸化，反應(yīng)體系為Alkaline Phosphatase 4U、線性化質(zhì)粒 pBV-geneE 15pmoIUO X SAPBuffer 5 μ L，補水至 50 μ L，37°C處理 lh。用T4 DNA ligase連接去磷酸化的pBV-geneE片段與磷酸化的cat片段,連接反應(yīng)體系為T4DNAligase 350U、憐酸化cat片段04pmol、去憐酸化pBV-geneE片段O. 03pmol、 10XT4DNA Ligase Buffer 2· 5 μ L、補水至25 μ L，16°C反應(yīng)12h。將連接產(chǎn)物通過熱擊轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a。通過氯霉素和菌液PCR篩選陽性克隆，并測序鑒定?；駿和基因 cat的序列均正確的轉(zhuǎn)化子進行增菌培養(yǎng),提取質(zhì)粒,命名為pBV-geneE-cat。上述構(gòu)建氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat的流程示意圖如圖I所示。實施例2、質(zhì)粒pBV-geneE-cat轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)制備菌脫2. I氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat的電轉(zhuǎn)化將氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，所述的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞購自TaKaRa,參照Sambrook等的方法(分子克隆實驗指南)制備，電轉(zhuǎn)化儀(Bio-Rad, California, USA)的電擊參數(shù)為I. 25kV/cm、25 μ F、200 Ω、 6. 0ms,電轉(zhuǎn)化后涂布含37 μ g/mL氯霉素的LB瓊脂平板，30°C培養(yǎng)16小時，通過菌落PCR
鑒定轉(zhuǎn)化子。將含氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat的BL21 (DE3)單克隆接種于5mL含 371^/1^氯霉素的1^液體培養(yǎng)基，301振蕩(200r/min)培養(yǎng)過夜，然后按I % (v/v)轉(zhuǎn)接于50mL含37 μ g/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltlnm達0. 4-0. 6。將培養(yǎng)物迅速調(diào)至42°C培養(yǎng)以誘導(dǎo)E基因的表達，繼續(xù)培養(yǎng)4h。誘導(dǎo)前后不同時間點取樣，監(jiān)測培養(yǎng)物的OD6tltlnm和活菌CFU變化，活菌CFU通過將誘導(dǎo)前后的培養(yǎng)物各100 μ L適當(dāng)稀釋后涂布LB平板進行計數(shù)。誘導(dǎo)結(jié)束后形成的ghost菌蛻用PBS洗滌3次，凍干保存，并對凍干后的菌蛻進行活菌CFU檢測。質(zhì)粒pBV-geneE-cat誘導(dǎo)BL21 (DE3)裂解的動力學(xué)曲線見圖2。升溫誘導(dǎo)30min 后，BL21(DE3)培養(yǎng)物的0D_和活菌CFU均快速降低，隨后緩慢降低至最低水平。誘導(dǎo)前培養(yǎng)物的活菌數(shù)為3. 45X 107CFU/mL，誘導(dǎo)結(jié)束時培養(yǎng)物的活菌數(shù)為5. 26 X 102CFU/mL,該質(zhì)粒的裂解效率達99. 998%。凍干后的菌蛻未檢測到活菌。試驗例I、大腸桿菌BL21(DE3)菌蛻的透射電鏡觀察將實施例2中42°C誘導(dǎo)4h的菌液4000g離心lOmin，用2. 5%戊二醛4°C下固定細菌3h，0.01mol/LPBS洗滌3次，離心后直接電鏡觀察。結(jié)果見圖3。
權(quán)利要求
1.一種氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat，其特征在于由噬菌體PhiX174裂解基因E、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因和原核溫控表達載體pBV220組成。
2.權(quán)利要求I所述的氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat的構(gòu)建方法,其特征在于以噬菌體PhiX174RFI DNA為模板、SEQ No. I和SEQ No. 2所示DNA為引物進行PCR擴增，獲得噬菌體PhiX174裂解基因E，然后將其與經(jīng)EcoR I和Pst I雙酶切的pBV220載體連接，獲得溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE ;將質(zhì)粒pLysS經(jīng)Acc II酶切，獲得1787bp的包含側(cè)翼調(diào)控序列的cat基因，然后用T4DNA Iigase將cat基因與經(jīng)Sca I單酶切的pBV-geneE 進行連接，獲得氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat。
3.權(quán)利要求I所述的氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat在制備菌脫中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于制備菌蛻的方法如下將氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat電擊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中；電轉(zhuǎn)化后涂布含氯霉素的LB 瓊脂平板，培養(yǎng)，通過菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子；然后,將轉(zhuǎn)化成功的含pBV-geneE-cat的大腸桿菌單克隆接種于含氯霉素的LB液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)，然后再轉(zhuǎn)接于含氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD6tltlnm達0. 4-0. 6，將培養(yǎng)物迅速調(diào)至42°C培養(yǎng)以誘導(dǎo)E基因的表達， 繼續(xù)培養(yǎng)，即得大腸桿菌菌蛻。
全文摘要
氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒及其構(gòu)建與在菌蛻制備中的應(yīng)用。本發(fā)明公開了一種氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat及其構(gòu)建方法，還公開了該質(zhì)粒pBV-geneE-cat在大腸桿菌Ecoli.BL21(DE3)菌蛻制備中的應(yīng)用。本發(fā)明氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat由噬菌體PhiX174裂解基因E、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)和原核溫控表達載體pBV220組成。本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒pBV-geneE-cat可以在大腸桿菌中穩(wěn)定的復(fù)制，并能夠高效表達氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，從而產(chǎn)生氯霉素抗性，以此來作為抗性篩選標記，還可高效表達裂解基因E，在制備氯霉素敏感的大腸桿菌菌蛻時裂解效率可達99.998％。
文檔編號C12N15/66GK102586307SQ20121005357
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月2日
發(fā)明者安利國, 楊桂文, 祝文興, 袁金鐸 申請人:山東師范大學(xué)