專利名稱：一種重組海參溶菌酶n端多肽、其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及重組海參溶菌酶N端多肽高效表達(dá)的工程菌制備方法，優(yōu)化發(fā)酵工藝而獲得高產(chǎn)率的可溶性多肽產(chǎn)物，以及對(duì)制備的產(chǎn)品進(jìn)行廣譜抗菌活性的研究。
背景技術(shù)：
溶菌酶是一種能水解粘多糖的堿性酶，它能催化細(xì)菌細(xì)胞壁中粘多糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β _1，4糖苷鍵的水解，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌死亡。它廣泛存在于自然界動(dòng)植物和微生物的組織、體液及分泌物中，在生物機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。溶菌酶作為天然的抗菌劑、免疫增強(qiáng)劑和防腐劑目前廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及飼料等行業(yè)。近年來隨著海洋生物魚類、蝦類、貝類以及海珍品，如海參、鮑魚等養(yǎng)殖產(chǎn)量的快速增長，隨之而來的是海水養(yǎng)殖生產(chǎn)中的品質(zhì)退化、養(yǎng)殖水平低、疾病泛濫及環(huán)境污染等問題。目前在水產(chǎn)品養(yǎng)殖以及畜禽生產(chǎn)中使用抗生素帶來的問題也越來越受到人們的關(guān)注，一是耐藥性問題，二是藥物殘留問題，其副作用是不可忽視的，人們不希望以犧牲人類健康為代價(jià)換取海產(chǎn)品、畜禽產(chǎn)品生產(chǎn)性能的提高。在這種嚴(yán)峻形勢下，溶菌酶在動(dòng)物養(yǎng)殖方面的優(yōu)勢以及在疾病預(yù)防治療方面的促進(jìn)作用顯示了它的突出地位，它的綠色、安全、無公害的特點(diǎn)代表了未來的飼料添加劑和動(dòng)物保健品的方向。根據(jù)溶菌酶空間結(jié)構(gòu)、免疫學(xué)特性和催化活性的差異通?？煞譃?類C-型 (chicken-type)溶菌酶、g_ 型(goose-type)溶菌酶、i_ 型(invertebrate-type)溶菌酶； 植物源(plant lysozyme)溶菌酶；微生物源(bacterial lysozyme)溶菌酶；噬菌體(phage lysozyme)溶菌酶。近年來隨著人們把開發(fā)新藥和功能性食品的目光投向海洋，對(duì)i_型溶菌酶的研究興趣也日益高漲，相繼在海洋貝類、蝦、海星、海膽、海參中發(fā)現(xiàn)了 i_型溶菌酶。目前已商品化使用的溶菌酶主要從蛋清中提取，屬于C-型溶菌酶。由于來源有限，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，溶菌酶產(chǎn)量受限，價(jià)格居高不下，難以滿足越來越大的市場需求。因此， 利用基因工程重組技術(shù)高效表達(dá)溶菌酶成為很重要的手段，尤其生產(chǎn)海參i_型溶菌酶具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，海參i_型溶菌酶與蛋清C-型溶菌酶不同，后者只對(duì)革蘭氏陽性菌起抗菌作用，而海參i_型溶菌酶不僅對(duì)革蘭氏陽性菌，并且對(duì)革蘭氏陰性菌均具有顯著的抗菌作用，尤其對(duì)通常引起水產(chǎn)動(dòng)物嚴(yán)重病害的病原菌(弧菌和假單胞菌)具有明顯的抗菌效果。同時(shí)，海參i_型溶菌酶具有較強(qiáng)的抗真菌、抗病毒、增加免疫力等能力，并具有生物相容性好、對(duì)組織無刺激、無毒性等特點(diǎn)。海參i-型溶菌酶(以下簡稱海參溶菌酶)基因于2007年在我們實(shí)驗(yàn)室首次被分離和鑒定(參見楊西建，等.海參i_型溶菌酶基因及其編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn).中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)；2007，23 (7) :542-547)。近年來，我們又將海參溶菌酶基因分別在大腸桿菌和畢赤酵母細(xì)胞中進(jìn)行重組表達(dá)，并對(duì)重組蛋白的抗菌活性進(jìn)行了研究(參見王秀霞，等.海刺參i_型溶菌酶基因的重組表達(dá)及抑菌譜分析.生物工程學(xué)報(bào)，2009，25 O) 189-194;谷躍峰，等.海參溶菌酶基因克隆及在畢赤酵母中的表達(dá)與純化.大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，四(5) :317-320)。但目前存在的問題，一是重組海參溶菌酶基因在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)，其溶菌酶蛋白以包涵體形式存在(即酶蛋白不溶解)，后續(xù)對(duì)該蛋白的變性和復(fù)性操作繁瑣，而且獲得的酶產(chǎn)量低、活性不穩(wěn)定；二是重組海參溶菌酶基因在畢赤酵母細(xì)胞中蛋白表達(dá)量很低。這兩個(gè)瓶頸問題嚴(yán)重阻礙了海參溶菌酶研究向產(chǎn)業(yè)化試驗(yàn)的進(jìn)程，并且國內(nèi)外幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室在研究各類溶菌酶基因表達(dá)時(shí)都遇到類似問題。經(jīng)過對(duì)海參溶菌酶基因結(jié)構(gòu)的分析，發(fā)現(xiàn)海參溶菌酶的N端區(qū)域可能編碼了糖苷酶活性，而C端區(qū)域可能編碼了異構(gòu)肽酶活性。因此，我們設(shè)計(jì)將海參溶菌酶基因分成兩段，分別進(jìn)行重組表達(dá)制備成海參溶菌酶N端和C端多肽，再驗(yàn)證其特性和功能，并與海參溶菌酶做比較和分析。本發(fā)明是關(guān)于重組海參溶菌酶N端多肽的制備方法及應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有廣譜抗菌活性、高效表達(dá)海參溶菌酶多肽的基因工程制備方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案為對(duì)來源于自主分離鑒定的海刺參(Stichopus japonicus)的溶菌酶(SjLys)基因(GenBank注冊號(hào)EF03646^進(jìn)行N端多肽的重組表達(dá)。利用設(shè)計(jì)合成的引物，擴(kuò)增海參溶菌酶多肽的基因；將構(gòu)建的原核表達(dá)載體 pET-3^i-SjLys-N，轉(zhuǎn)化Rosetta (DE!3) pLysS細(xì)胞，獲得一株高效表達(dá)重組海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌。用所述的基因工程菌生產(chǎn)的溶菌酶多肽，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化，其表達(dá)產(chǎn)物具有50%以上的可溶性，產(chǎn)品收率高。生產(chǎn)的重組海參溶菌酶N端多肽具有廣譜抗菌活性，尤其是經(jīng)100°C加熱40min，該多肽產(chǎn)品的抗菌活性基本保持不變。研究證明，海參溶菌酶N端多肽的抗菌活性、穩(wěn)定性和生產(chǎn)效率均優(yōu)于海參溶菌酶，可無危害地應(yīng)用于制備飼料添加劑、食品防腐劑、抗生素的替代藥物等。本發(fā)明的一方面在于保護(hù)一種重組海參溶菌酶N端多肽的引物序列，其引物序列分別為，正向引物SEQ ID NO :1 ；反向引物SEQ ID NO :2。本發(fā)明的另一方面在于保護(hù)一種重組海參溶菌酶N端多肽的質(zhì)粒，其制備方法如下以海參溶菌酶SjLys基因?yàn)槟０澹瑢⑸鲜龅恼蛞颯EQ ID NO :1和反向引物SEQ ID N0:2所擴(kuò)增的基因片段連接至大腸桿菌表達(dá)載體pET3h(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明的另一方面在于保護(hù)一種表達(dá)重組海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌，其制備方法包括將上述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta (DE;3)pLysS宿主細(xì)胞獲得重組基因工程菌。本發(fā)明的另一方面在于保護(hù)一種重組海參溶菌酶N端多肽的制備方法，其包括①誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)上述的重組基因工程菌，并用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；②分離和純化收集步驟①所得產(chǎn)品，經(jīng)鎳離子親和層析柱純化，并用超濾膜濃縮；再將濃縮樣品脫鹽后制得終產(chǎn)品。具體的，在上述的方法中，其誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化的條件包括③誘導(dǎo)表達(dá)將上文所述的重組基因工程菌在優(yōu)化的液體培養(yǎng)基中，37°C、160rpm振蕩培養(yǎng)至 OD6tltl達(dá)0. 6-0. 8，再向培養(yǎng)體系中加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L，、150rpm誘導(dǎo)培養(yǎng) 8h，收集發(fā)酵液；其中，優(yōu)化的液體培養(yǎng)基是指在LB培養(yǎng)基中加入兩種抗生素，即100mg/L氨芐青霉素和 34mg/L 氯霉素，并添加 5g/L 葡萄糖，0. 3g/L MgSO4 · 7H20 和 lg/L K2HPO4 · 3H20 ；
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④分離和純化將步驟③收集的發(fā)酵液離心，收集并洗滌菌體，反復(fù)凍融，用磷酸鹽緩沖液重懸菌體，并加入Triton X_100至終濃度為1 %后，經(jīng)冰浴超聲破菌，離心收集上清液，經(jīng)鎳離子親和層析柱His Trap HP column純化，收集重組海參溶菌酶多肽的融合蛋白組分，用截留分子量為5kDa的Millipore超濾膜將蛋白濃縮至8 10mg/mL ；再將濃縮樣品經(jīng)kphadex G-25凝膠層析脫鹽，收集融合蛋白組分，冷凍干燥，得到重組海參溶菌酶N端多肽的產(chǎn)品。本發(fā)明的另一方面在于保護(hù)一種利用上述的方法獲得的重組海參溶菌酶N端多肽。本發(fā)明的另一方面在于保護(hù)一種利用上述的重組海參溶菌酶N端多肽制備的飼料添加劑、食品防腐劑、抗生素的替代藥物、以及在海水養(yǎng)殖生產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用。上述本發(fā)明涉及的下列各實(shí)驗(yàn)操作，包括基因片段連接至大腸桿菌表達(dá)載體 pET32a(+)中、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta(DE;3)pLysS宿主細(xì)胞、鎳離子親和層析柱純化、超濾膜濃縮、樣品脫鹽等實(shí)驗(yàn)操作方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，故再次不做贅述，具體可見本發(fā)明中具體實(shí)施例所述部分。本發(fā)明的創(chuàng)新特征是1.高效表達(dá)和制備可溶性重組海參溶菌酶N端多肽，解決了當(dāng)前海參溶菌酶產(chǎn)業(yè)化遇到的蛋白溶解度低、酶活性低等關(guān)鍵問題。2.本發(fā)明提供的基因工程菌生產(chǎn)重組海參溶菌酶N端多肽，具有產(chǎn)量高，生產(chǎn)條件和步驟簡單，反應(yīng)條件易于控制，生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)，因此適用于大規(guī)模的生產(chǎn)。3.重組海參溶菌酶N端多肽具有廣譜抗菌活性，并具有很好的熱穩(wěn)定性和酶活穩(wěn)定性，而且安全無害，可應(yīng)用于制備飼料添加劑、食品防腐劑、抗生素的替代藥物等。


圖 1 是 PCR 擴(kuò)增 SjLys-N 的基因片段；其中泳道，M :50bp DNA ladder marker ；1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；圖2是重組海參溶菌酶N端多肽的Western blotting分析結(jié)果圖；其中泳道，M 精準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 =IPTG誘導(dǎo)前菌株發(fā)酵液的菌體；2 :IPTG誘導(dǎo)后菌株發(fā)酵液的菌體；3 =Western blotting檢測泳道1中的樣品；4 =Western blotting檢測泳道2中的樣
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BFI ；圖3是重組海參溶菌酶N端多肽的誘導(dǎo)表達(dá)及純化的SDS-PAGE結(jié)果圖；其中泳道，M 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 IPTG誘導(dǎo)前菌株發(fā)酵液的菌體；2 :IPTG誘導(dǎo)后菌株發(fā)酵液的菌體；3 誘導(dǎo)的菌株發(fā)酵液菌體細(xì)胞被破碎后的沉淀物；4 誘導(dǎo)的菌株發(fā)酵液菌體細(xì)胞被破碎后的上清液；5 泳道4中的樣品經(jīng)Ni2+-NTA親和層析柱純化的重組蛋白。
具體實(shí)施例方式下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下述實(shí)施例中所用的海刺參(Stichopus japonicus)，源于大連長?？h地區(qū)，其海參溶菌酶(SjLys)基因的GenBank注冊號(hào)為EF036468 ；
引物序列合成、DNA測序是由北京華大基因研究中心完成；Western blotting 7MirMi^ TaKaRa Biotechnology ( ) ^ ] ；大腸桿菌Rosetta (DE;3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞和表達(dá)載體pET_32a(+)購自 Novagen(美國)公司；大腸桿菌DH5a，克隆載體 pMD 18-T，RNAiso Plus 試劑，TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)試劑盒，限制性核酸內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，Taq DNA聚合酶，DNA ladder marker禾口蛋白低分子量marker均購自TaKaRa Biotechnology (大連)公司；質(zhì)粒提取和瓊脂糖凝膠電泳DNA回收試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；HisTrap HP column 購自 GE Healthcare (美國)公司；其他試劑均為國產(chǎn)的分析純。實(shí)施例1高效表達(dá)重組海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌的制備1.海參溶菌酶N端多肽基因序列的擴(kuò)增(1)根據(jù)海參溶菌酶的基因序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，分別在正向和反向序列里引入Nco I和EcoR I酶切位點(diǎn)。其序列為正向引物SEQID NO :1TGACCATGGCTATGCAAGTTCCTTCTGAT反向引物SEQID NO :2CCAGGAATTCTCACTTCAGCCTAGCATCCPCR擴(kuò)增片段范圍是從海參溶菌酶氨基酸Gln 21至Lys 69，全長為147bp (含有 49aa)，即為SjLys-Ν的基因片段。(2)取新鮮的海刺參腸樣品，根據(jù)RNAiso Plus試劑說明抽提總RNA。(3)以該海參腸總 RNA 為模板，使用 TaKafci One Step RNA PCR Kit(AMV)進(jìn)行 RT-PCR基因擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為 RT-PCR 循環(huán)參數(shù)為50°C 30min，94°C 2min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 45s, 35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin。
RNase Free dH20
IOxOne Step RNAPCR Buffer
MgCl2 (25 mmol/L)
dNTP Mixture (各 10 mmol/L)
RNase Inhibitor (40 U/^)
AMVRTaseXL (5υ/μ )
Total RNA
24 μL 5 μ 10 μ 5 μ 1 μL 1 μL 1 μL 1 μL 1 μL 1 μL
HS-N-I (20μιηο1/0 HS-N-2 (20μιηο1/0 AMV-Optimized Taq (5 U/μ )
待反應(yīng)結(jié)束后，取5yL PCR產(chǎn)物，用1.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因，并將目的條帶通過瓊脂糖凝膠電泳DNA回收試劑盒進(jìn)行回收純化。電泳分析結(jié)果顯示(圖1)，擴(kuò)增基因片段SjLys-N在150bp附近呈現(xiàn)特異性亮帶，與預(yù)期片段(147bp)大小基本一致。2.構(gòu)建高效表達(dá)重組海參溶菌酶N端多肽基因工程菌(1)將擴(kuò)增得到的SjLys-N基因片段，通過Nco I和EcoR I限制性內(nèi)切酶雙酶切后，純化回收其目的基因片段；再與經(jīng)Nco I和EcoR I雙酶切后線性化的PMD18-T載體由 T4 DNA連接酶連接，16°C過夜反應(yīng)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-SjLys-N。取連接產(chǎn)物5 μ L加至解凍的50 μ L大腸桿菌DH5 α的感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min ；再放入42°C加熱45s，立即置冰中aiiin ；然后加入SOC液體培養(yǎng)基945 μ L，37°C下振蕩培養(yǎng)60min，即得到轉(zhuǎn)化海參溶菌酶N端多肽基因的大腸桿菌DH5 α細(xì)胞轉(zhuǎn)化液。(2)將適量該轉(zhuǎn)化液涂布于含100mg/L氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基中37°C 過夜培養(yǎng)，分別挑取單菌落，經(jīng)含100mg/L Amp的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒。用 Nco I和EcoR I限制性酶進(jìn)行酶切后電泳，得到SjLys-N的基因片段。LB液體培養(yǎng)基配制胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl IOg ；將各組分溶解在 900mL去離子水中，用lmol/L NaOH調(diào)pH至7. 0，再補(bǔ)水至lOOOmL，高壓蒸汽滅菌。另外， LB固體培養(yǎng)基需添加瓊脂粉15g/L。培養(yǎng)基滅菌冷卻至60°C左右，按濃度要求加入相應(yīng)的抗生素。(3)將SjLys-N基因片段與大腸桿菌表達(dá)載體pET3h(+)連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pET32a-SjLys-N,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α，制得含海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌。將該基因工程菌委托專業(yè)的生物技術(shù)公司測序，證實(shí)它們含完整的SjLys-N基因片段。(4)從步驟2 (3)已構(gòu)建好的基因工程菌抽提重組質(zhì)粒pET3h-SjLys-N，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta (DE3) pLysS感受態(tài)細(xì)胞中，并取50 μ L涂布于含有100mg/L氨芐青霉素 (Amp)和；Mmg/L氯霉素(Cam)的LB固體培養(yǎng)基上，37°C過夜培養(yǎng)。分別挑取單菌落接種于含100mg/LAmp，3^ig/L Cam的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)14 16h，提取重組質(zhì)粒做PCR及酶切檢測鑒定插入的基因片段大小是否正確。再挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行序列測定，驗(yàn)證重組表達(dá)質(zhì)粒讀碼框的正確性，即得到高效表達(dá)的海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌，命名為 pET32a_SjLys-N/Rosetta(DE3)pLysS。實(shí)施例2 重組海參溶菌酶N端多肽在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及Western blotting 檢測將構(gòu)建正確的海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌接種于含100mg/L Amp, 34mg/L Cam和lOg/L葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中，37°C下160rpm振蕩培養(yǎng)14 16h。然后按照體積比的接種量接種于含100mg/L Amp,34mg/L Cam,以及5g/L葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中，37°C下160rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltl達(dá)0. 6 0. 7，取出ImL菌液作為誘導(dǎo)前對(duì)照樣品。再加入誘導(dǎo)劑IPTG至發(fā)酵液終濃度為0. 5mmol/L, 下120rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)10h，取出ImL菌液作為誘導(dǎo)后樣品。最后離心發(fā)酵液收集沉淀的菌體，用15% SDS-PAGE初步檢測該重組蛋白的表達(dá)狀況。電泳結(jié)果顯示(圖2中泳道1和2)，重組SjLys-N在約23kDa左右明顯多出1條特異性亮帶。為了驗(yàn)證重組質(zhì)粒pET3h_S jLys-N在大腸桿菌中是否真正得到表達(dá)，利用 Western blotting分析中的Penta-His抗體能與重組海參多肽發(fā)生特異性結(jié)合的特點(diǎn)進(jìn)行檢測。將上述重組SjLys-N基因工程菌誘導(dǎo)前的樣品和誘導(dǎo)后發(fā)酵液的菌體樣品進(jìn)行 15% SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上，放置在含1. 5% BSA封閉緩沖液中，4°C平放過夜。加入1 1000稀釋的Penta-His抗體，進(jìn)行一次抗體反應(yīng)lh。用含 0. 1 % (v/v)Tween 20 的 1Tris-HCl 緩沖液(pH7. 4)洗滌 2 次，再用洗滌 1Tris-HCl 緩沖液 (pH 7. 4)沖洗3次后，加入1 1000的稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG單抗，進(jìn)行二次抗體反應(yīng)lh。再重復(fù)洗膜一次后，最后加入TrueBlue過氧化物酶底物，顯色I(xiàn)min后分析。分析結(jié)果說明(圖2中泳道3和4)，重組SjLys-N蛋白在23kDa左右可以與Penta-His抗體發(fā)生特異性的結(jié)合，從而證明該重組蛋白在大腸桿菌中確實(shí)得到了正確表達(dá)。實(shí)施例3重組海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌的發(fā)酵優(yōu)化和分離純化1.發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)重組海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含有抗生素100mg/LAmp和3%ig/L Cam的LB液體培養(yǎng)基。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，包括添加葡萄糖(2g/L, 5g/L，10g/L ；)，MgSO4 · 7H20 (0. lg/L，0. 3g/L，0. 5g/L ；)，和 K2HPO4 ·3Η20(0. 5g/L，lg/L, 1. 5g/L ；)。加入IPTG誘導(dǎo)劑進(jìn)行重組多肽蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，得到的發(fā)酵液經(jīng)細(xì)胞破碎后，收集上清液分析其中可溶性蛋白的含量。經(jīng)SDS-PAGE分析，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為在含100mg/L Amp,34mg/L Cam的LB培養(yǎng)基中，添加5g/L葡萄糖，0. 3g/L MgSO4 · 7H20, lg/L K2HPO4 · 3H20。2.發(fā)酵誘導(dǎo)條件的優(yōu)化最佳發(fā)酵條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)包括誘導(dǎo)發(fā)酵溫度(25°C，28°C，30°C，35°C )，IPTG 誘導(dǎo)劑濃度(0. 2mmol/L,0. 5mmol/L,0. 8mmol/L, 1. Ommo 1/L)，誘導(dǎo)發(fā)酵時(shí)間(4h，6h，8h， 10h)，誘導(dǎo)后搖床轉(zhuǎn)數(shù)Q20rpm，180rpm，150rpm，120rpm)。海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌在上述最佳培養(yǎng)基配方的條件下，370C、160rpm振蕩培養(yǎng)至0D_達(dá)0. 6-0. 8，加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)發(fā)酵，試驗(yàn)各個(gè)誘導(dǎo)條件。最后得到的發(fā)酵液經(jīng)細(xì)胞破碎后，收集上清液分析其中可溶性蛋白的含量。經(jīng)SDS-PAGE分析，確定最佳誘導(dǎo)發(fā)酵條件為IPTG濃度為0.5mmol/L， 28°C，150rpm,誘導(dǎo)培養(yǎng) 8h。3.最佳條件下誘導(dǎo)發(fā)酵結(jié)果在上述最佳培養(yǎng)基配方和最佳誘導(dǎo)發(fā)酵條件下，檢測重組海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌是否能夠高效誘導(dǎo)表達(dá)，以及表達(dá)后的重組蛋白是否具有可溶性。采用生物學(xué)軟件BandSCan5. 0分析SDS-PAGE的電泳結(jié)果，重組SjLys-N誘導(dǎo)后的菌體表達(dá)量占總蛋白含量的75%左右(圖3中泳道幻；而該菌體經(jīng)細(xì)胞破碎后分析其上清液和沉淀物中含有重組SjLys-N蛋白的量，結(jié)果是在它的上清液中含目的蛋白50%以上(圖3中泳道4)。這表明重組SjLys-N多肽在大腸桿菌中能夠高效表達(dá)，而且表達(dá)的大部分蛋白能夠以可溶性形式存在。4.產(chǎn)物的分離和純化低溫離心收集誘導(dǎo)發(fā)酵后的菌體G V，IOOOrpm, IOmin)，用磷酸鹽緩沖液 (lXPBS，pH 7. 4)洗滌菌體兩次，將菌體反復(fù)凍融數(shù)次。按照菌體濕重體積的兩倍加入預(yù)冷的IXPBS緩沖液(pH 7. 4)，并加入Triton-100至終濃度為體積比1%，以重懸菌體。該菌懸液置冰浴中超聲裂解細(xì)胞，功率400W，超聲ls，靜置3s，共處理IOmin至不再粘稠。再經(jīng) 40C、12000rpm離心15min，分別取上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測。收集上清液，_20°C保存?zhèn)溆?。?zhǔn)備ImL HisTrap HP column (即Ni2+-NTA親和層析柱)，用10倍柱體積蒸餾水沖洗柱子，用10倍柱體積的結(jié)合緩沖液GOmmol/L咪唑，20mmol/L磷酸鈉溶液，500mmol/ L NaCl, pH 7.4)平衡。上述經(jīng)超聲裂解的上清液樣品經(jīng)0. 22 μ m過濾膜處理后，以約 1. OmL/min的流速上柱，再用25倍柱體積的結(jié)合緩沖液洗柱，最后用10倍柱體積的洗脫液(150mmol/L咪唑，20mmol/L磷酸鈉溶液，500mmol/L NaCl，pH 7. 4)，洗脫目的重組蛋白 SjLys-N，收集海參溶菌酶多肽的融合蛋白組分。再用截留分子量為5kDa的Millipore超濾膜將蛋白濃縮至8 10mg/mL。將濃縮樣品經(jīng)kphadex G-25凝膠層析脫鹽，收集融合蛋白組分，冷凍干燥，分別得到重組海參溶菌酶N端多肽的精制產(chǎn)品(圖3中泳道5)。實(shí)施例4重組海參溶菌酶N端多肽抑菌活性的測定采用瓊脂平板擴(kuò)散法測定重組海參溶菌酶N端多肽對(duì)部分革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑菌圈大小，以其半徑(mm)來表示。先稱取SjLys-N的凍干粉若干克，溶于 1XPBS(PH7. 4)中，利用Bradford方法確定其蛋白的含量在100 μ g/mL。此實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照為空載體pET_32a(+)在Ε. coli Rosetta(DE3)pLysS中誘導(dǎo)發(fā)酵并純化蛋白，制備成凍干粉后，再定量至蛋白含量為100yg/mL。取革蘭氏陽性菌，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和溶壁微球菌 (Micrococcus lysodeikticus)，以及革蘭氏陰性菌，大腸桿菌 K88 (Escherichia coli), 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，鰻弧菌(Vibrio anguillarium)，銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)禾口嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)作為指示菌。將這些細(xì)菌在LB液體培養(yǎng)基中37°C、200rpm過夜培養(yǎng)，稀釋至0D_為0. 001左右，菌濃度約為 3. OX 109CFU/ml。取100 μ L上述所選菌液與20mL、50°C的LB固體培養(yǎng)基迅速混勻，并鋪平板冷卻，再進(jìn)行如下試驗(yàn)試驗(yàn)一在含有上述某一特定指示菌的平板上，放置2個(gè)無菌牛津杯，分別加入 100 μ L重組SjLys-N原液和經(jīng)100°C、加熱40min處理的重組SjLys-N溶液。試驗(yàn)二在含有上述某一特定指示菌的平板上，放置2個(gè)無菌牛津杯，分別加入 100 μ L重組SjLys-N原液和陰性對(duì)照樣品溶液。將所有試驗(yàn)的平板置于30°C過夜培養(yǎng)，測量抑菌圈。試驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。表1所示為重組海參溶菌酶N端多肽及加熱處理后的該產(chǎn)品的抑菌圈大小，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該重組海參溶菌酶N端多肽對(duì)革蘭氏陰性菌和陽性菌均有抑制作用，尤其對(duì)海產(chǎn)品中常見的革蘭氏陰性致病菌弧菌有明顯的抑制作用，而且加熱失活后的SjLys-C對(duì)革蘭氏陰性菌和陽性菌的抑菌能力基本保持不變，說明該產(chǎn)品具有較好的熱穩(wěn)定性，這對(duì)海參溶菌酶多肽作為飼料添加劑的應(yīng)用非常有益。表1重組SjLys-N多肽抑菌活性測定
權(quán)利要求
1.重組海參溶菌酶N端多肽的引物序列，其特征在于引物序列分別為，正向引物SEQ ID NO 1 ；反向引物:SEQ ID NO :2。
2.一種重組海參溶菌酶N端多肽的質(zhì)粒，其特征在于，制備方法包括以溶菌酶SjLys 基因?yàn)槟０?，將?quán)利要求1所述的引物序列所擴(kuò)增的基因片段連接至大腸桿菌表達(dá)載體 pET32a(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。
3.—種表達(dá)重組海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌，其特征在于，制備方法包括將權(quán)利要求2所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta(DE;3)pLysS宿主細(xì)胞獲得重組基因工程菌。
4.一種重組海參溶菌酶N端多肽的制備方法，其特征在于，制備方法包括①誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)權(quán)利要求3所述的重組基因工程菌，并用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；②分離和純化收集步驟①所得產(chǎn)品，經(jīng)鎳離子親和層析柱純化，并用超濾膜濃縮；再將濃縮樣品脫鹽后制得終產(chǎn)品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化的條件包括③誘導(dǎo)表達(dá)將權(quán)利要求3所述的重組基因工程菌在優(yōu)化的液體培養(yǎng)基中，37°C、160rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltl達(dá)0. 6-0. 8，再向培養(yǎng)體系中加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L, 28°C、150rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)》1，收集發(fā)酵液；其中，優(yōu)化的液體培養(yǎng)基是指在LB培養(yǎng)基中加入兩種抗生素，即100mg/L氨芐青霉素和 34mg/L 氯霉素，并添加 5g/L 葡萄糖，0. 3g/L MgSO4 · 7H20 和 lg/L K2HPO4 · 3H20 ；④分離和純化將步驟③收集的發(fā)酵液離心，收集并洗滌菌體，反復(fù)凍融，用磷酸鹽緩沖液重懸菌體， 并加入Triton X-100至終濃度為1 %后，經(jīng)冰浴超聲破菌，離心收集上清液，經(jīng)鎳離子親和層析柱His Trap HP column純化，收集重組海參溶菌酶多肽的融合蛋白組分，用截留分子量為51^^的肌11丨？0儀超濾膜將蛋白濃縮至8 1011^/1^ ；再將濃縮樣品經(jīng)kphadex G-25 凝膠層析脫鹽，收集融合蛋白組分，冷凍干燥，得到重組海參溶菌酶N端多肽的產(chǎn)品。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法獲得的重組海參溶菌酶N端多肽。
7.如權(quán)利要求6所述的重組海參溶菌酶N端多肽在制備飼料添加劑、食品防腐劑、抗生素的替代藥物、海水養(yǎng)殖生產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)來源于海刺參(Stichopus japonicus)溶菌酶(SjLys)基因(GenBank注冊號(hào)為EF036468)進(jìn)行N端多肽的重組表達(dá)。首先構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-SjLys-N，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)pLysS細(xì)胞，獲得一株高效表達(dá)重組海參溶菌酶N端多肽的基因工程菌。利用該基因工程菌生產(chǎn)的溶菌酶N端多肽，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化，其表達(dá)產(chǎn)物具有50％以上的可溶性，產(chǎn)品收率高。生產(chǎn)的重組海參溶菌酶N端多肽具有廣譜抗菌活性，尤其是該產(chǎn)品經(jīng)100℃加熱40min處理后，它的抗菌活性基本保持不變，這對(duì)開發(fā)海參溶菌酶多肽作為飼料添加劑非常有利。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102559672SQ201210055509
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月5日
發(fā)明者叢麗娜, 常藝海 申請(qǐng)人:大連工業(yè)大學(xué)