專利名稱：一種高密度培養(yǎng)多粘類芽孢桿菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，更具體涉及一種高密度培養(yǎng)多粘類芽孢桿菌 {Paenibacillus polymyxa )的方法。
背景技術(shù)：
多粘類芽孢桿菌QPaenibacUIus polymyxa)是一種產(chǎn)芽孢的G+細(xì)菌，對(duì)人或動(dòng)植物沒有致病性，可產(chǎn)生多肽抗生素、拮抗蛋白、酶、植物激素、絮凝劑等多種生物活性物質(zhì)， 兼有生物農(nóng)藥和生物菌肥的作用，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工礦業(yè)及廢水處理等領(lǐng)域。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(EPA)已將其列為可在商業(yè)上應(yīng)用的微生物種類之一，我國(guó)農(nóng)業(yè)部也將其列為免做安全鑒定的一級(jí)菌種。多粘類芽孢桿菌是一種植物根際促生細(xì)菌，一方面可以用作微生物肥料，促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高作物產(chǎn)量；另一方面，可以有效防治植物細(xì)菌性和真菌性土傳病害，對(duì)植物青枯病、番茄枯萎病、油菜腐爛病、黑松根腐病等多種植物病害具有很好的防治效果。傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)中化學(xué)農(nóng)藥的過量使用不僅會(huì)增加農(nóng)藥殘留量，同時(shí)導(dǎo)致了許多作物病蟲害的抗藥性，并對(duì)土壤、水體及生態(tài)環(huán)境造成污染。隨著社會(huì)的進(jìn)步，人們生活水平的提高，對(duì)食品安全的意識(shí)不斷加強(qiáng)，在這種情況下應(yīng)用高效、廣譜、安全、無毒的有益微生物進(jìn)行植物疫病的防治越來越受到人們的重視。多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的多肽類抗菌物質(zhì)對(duì)植物病原真菌具有很好的拮抗活性，且性質(zhì)比較穩(wěn)定，可用于多種植物病害的生物防治。因此， 多粘類芽孢桿菌是一類極具開發(fā)前景和應(yīng)用價(jià)值的生防細(xì)菌。目前國(guó)內(nèi)對(duì)多粘類芽孢桿菌的研究主要集中在菌種的篩選、分離鑒定、抑菌效果以及對(duì)發(fā)酵液化學(xué)成分的分析，而對(duì)于多粘類芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方面還罕見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種高密度培養(yǎng)多粘類芽孢桿菌的方法，以提高多粘類芽孢桿菌的
菌體產(chǎn)量。本發(fā)明提供的高密度培養(yǎng)多粘類芽孢桿菌的方法，具體如下以多粘類芽孢桿菌 (.Paenibacillus polymyxa)為菌種，經(jīng)活化后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉15-20g/L、蛋白胨20-25 g/L, NaCl 0.5-1.25 g/L、 Na2HPO4 0. 2-0. 5 g/L、CaCl2 0. 5-1. Og/L, ρΗ7· 0-8. 0 ；培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度 30_33°C、轉(zhuǎn)速 170-200r/min、裝液量 60-80mL/250mL ；接種量為 10-15% (v/v)，培養(yǎng)時(shí)間 18_20h。
更優(yōu)選地，可溶性淀粉 17.5 g/L、蛋白胨 25.0 g/L、NaCl 1.25 g/L、Na2HPO4 0.5 g/ LXaCl2 1. 0 g/L，pH7. 5 ；培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度 30°C、轉(zhuǎn)速 170r/min、裝液量 80mL/250mL ；接種量為10% (v/v)，培養(yǎng)時(shí)間18h。所述活化采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂 15g-20g，蒸餾水 IOOOmL, pH7. 0-7. 2，37°C活化 24h。
經(jīng)過以上條件優(yōu)化，多粘類芽孢桿菌的細(xì)胞生物量可達(dá)5. 3X109cfu/mL,比優(yōu)化前
3(3. 17X108cfu/mL)提高了 15. 72 倍。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)多粘類芽孢桿菌是一種非常具有應(yīng)用潛力的生物農(nóng)藥和微生物肥料，但要實(shí)現(xiàn)商業(yè)化，還必須加強(qiáng)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化等方面的研究。本發(fā)明通過對(duì)培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件的研究，為多粘類芽孢桿菌的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)以及進(jìn)一步開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。


圖1為多粘類芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線；
圖2為不同碳源對(duì)多粘類芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響； 圖3為可溶性淀粉添加量對(duì)多粘類芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響； 圖4為不同氮源對(duì)多粘類芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響； 圖5為蛋白胨添加量對(duì)多粘類芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響； 圖6為不同無機(jī)鹽種類對(duì)多粘類芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響； 圖7為培養(yǎng)基初始PH值對(duì)多粘類芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響； 圖8為培養(yǎng)溫度對(duì)多粘類芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響； 圖9為轉(zhuǎn)速對(duì)多粘類芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響； 圖10為培養(yǎng)基裝液量對(duì)多粘類芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響； 圖11為接種量對(duì)多粘類芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例采用的多粘類芽孢桿菌為多粘類芽孢桿菌S-7 (參考文獻(xiàn)史應(yīng)武等， 內(nèi)生多粘類芽孢桿菌S-7對(duì)甜菜光合作用及產(chǎn)量和品質(zhì)的影響.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，20 (3) =597-602.)，進(jìn)一步描述本發(fā)明，但是本發(fā)明不僅限于此。實(shí)施例1
1.多粘類芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
將多粘類芽孢桿菌活化后，以5% (ν/ν)的接種量接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水lOOOmL，pH7. 0-7. 2)中，裝液量100mL/250mL， 在30°C、200r/min下培養(yǎng)，分別采用分光光度法和平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間時(shí)的 OD600值和菌落數(shù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、分別以O(shè)D6tltl值和菌落數(shù)為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線圖 (圖1)。由生長(zhǎng)曲線確定多粘類芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)時(shí)間為18h。2.多粘類芽孢桿菌的培養(yǎng)基配方優(yōu)化
以牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，研究不同碳源、氮源、無機(jī)鹽對(duì)多粘類芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響。培養(yǎng)條件接種量5% (v/v)，裝液量100mL/250mL，在30°C、200r/ min下培養(yǎng)18h。2.1碳源種類對(duì)多粘類芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響
分別以1%(表示g/100mL，以下類同)的蔗糖、環(huán)糊精、麥芽糖、可溶性淀粉、乙酸鈉、葡萄糖為碳源，取代牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中的牛肉膏，考察它們對(duì)多粘類芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響，以碳源種類為橫坐標(biāo)，0D_增長(zhǎng)量為縱坐標(biāo)作圖。圖2顯示，以可溶性淀粉為碳源時(shí)，多粘類芽孢桿菌的0D_增長(zhǎng)量最大，為1. 184 ；而用乙酸鈉和葡萄糖作為碳源時(shí)，0D600增長(zhǎng)量較小。綜合細(xì)胞生物量和培養(yǎng)基成本進(jìn)行考慮，確定采用可溶性淀粉作為碳源。2.2碳源添加量對(duì)多粘類芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響
比較可溶性淀粉不同添加量對(duì)多粘類芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響，以碳源添加量為橫坐標(biāo)， 0D_增長(zhǎng)量為縱坐標(biāo)作圖(圖3)。結(jié)果表明，隨著可溶性淀粉添加量的增加，0D_增長(zhǎng)量也不斷提高，當(dāng)碳源添加量為1. 75%時(shí)，多粘類芽孢桿菌的0D_增長(zhǎng)量達(dá)到最高，為0.982。 隨之繼續(xù)增加可溶性淀粉的添加量，OD6tltl增長(zhǎng)量緩慢下降。因此，確定多粘類芽孢桿菌可溶性淀粉的最適添加量為1.75%。2.3氮源種類對(duì)多粘類芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響
在碳源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別以1%的蛋白胨、磷酸二氫銨、氯化銨、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鈉為氮源，考察它們對(duì)多粘類芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響，以氮源種類為橫坐標(biāo)，OD600增長(zhǎng)量為縱坐標(biāo)作圖(圖4)。結(jié)果表明，多粘類芽孢桿菌利用蛋白胨作為氮源時(shí)，OD6tltl增長(zhǎng)量最高，為0.942 ；而采用無機(jī)氮源時(shí)，細(xì)胞生物量相對(duì)較低，因此選取蛋白胨作為培養(yǎng)基的氮源。2.4氮源添加量對(duì)多粘類芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響
以蛋白胨添加量為橫坐標(biāo)，以O(shè)D6tltl增長(zhǎng)量為縱坐標(biāo)，將菌懸液稀釋10倍后測(cè)定0D_ (圖5)。結(jié)果表明，隨著蛋白胨添加量的增加，OD6tltl增長(zhǎng)量也隨之提高；當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?2. 5%時(shí)，多粘類芽孢桿菌的OD6tltl增長(zhǎng)量達(dá)到最高，為0. 679 ；隨后繼續(xù)增加蛋白胨的添加量，OD600增長(zhǎng)量有所下降。因此，確定枯多粘類芽孢桿菌的蛋白胨添加量為2. 5%。2.5無機(jī)鹽種類對(duì)多粘類芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響
在碳源、氮源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別以0. 5%的磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鉀、鉬酸鈉、 硫酸錳、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸亞鐵為無機(jī)鹽添加到培養(yǎng)基中，以無機(jī)鹽種類為橫坐標(biāo)，0D_ 增長(zhǎng)量為縱坐標(biāo)，將菌懸液稀釋10倍后測(cè)定OD6tltl(圖6)，確定最佳無機(jī)鹽。結(jié)果表明，當(dāng)以 NaCl、Na2HPO4和CaCl2作為無機(jī)鹽時(shí)，多粘類芽孢桿菌的OD6tltl增長(zhǎng)量較大，分別為1. 101、 0. 825,0. 748，因此選擇NaCl、Na2HP04和CaCl2作為多粘類芽孢桿菌培養(yǎng)的最佳無機(jī)鹽。在確定最佳無機(jī)鹽種類的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入研究無機(jī)鹽的最適添加量及其相互作用。2. 6無機(jī)鹽添加量對(duì)多粘類芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響
不同的微生物生長(zhǎng)所需的無機(jī)鹽種類和濃度不同。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NaCl, Na2HPO4 和CaCl2對(duì)多粘類芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響較為明顯，因此以這三種鹽為考察因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)“(34)，對(duì)無機(jī)鹽配方進(jìn)行優(yōu)化。通過單因素試驗(yàn)，初步確定上述無機(jī)鹽的較優(yōu)水平分別為 NaCl 0%-0. 25%, Na2HPO4 0%-0. 1%、CaCl2 0%-0. 1%。
表1多粘類芽孢桿菌無機(jī)鹽優(yōu)化正交試驗(yàn)因素和水平表
權(quán)利要求
1.一種高密度培養(yǎng)多粘類芽孢桿菌的方法，其特征在于以多粘類芽孢桿菌(.Paenibacillus polymyxa)為菌種，經(jīng)活化后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉15-20g/L、蛋白胨20-25 g/L, NaCl 0.5-1.25 g/L、Na2HPO4 0. 2-0. 5 g/L、CaCl2 0. 5-1. Og/L, ρΗ7· 0-8. 0 ；培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度 30_33°C、轉(zhuǎn)速170-200r/min、裝液量 60-80mL/250mL ；接種量為 10-15% (v/v)，培養(yǎng)時(shí)間 18_20h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度培養(yǎng)多粘類芽孢桿菌的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉17.5 g/L、蛋白胨25.0 g/L、NaCl 1.25 g/L,Na2HPO40. 5 g/L、CaCl2 1. 0 g/L, ρΗ7· 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度培養(yǎng)多粘類芽孢桿菌的方法，其特征在于所述培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度30°C、轉(zhuǎn)速170r/min、裝液量80mL/250mL ；接種量為10%( v/v)，培養(yǎng)時(shí)間18h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度培養(yǎng)多粘類芽孢桿菌的方法，其特征在于所述活化采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂15g-20g，蒸餾水IOOOmL, pH7. 0-7. 2，37°C 活化 24h。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，更具體涉及一種高密度培養(yǎng)多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)的方法，以提高多粘類芽孢桿菌的菌體產(chǎn)量。該方法以多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)為菌種，經(jīng)活化后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。經(jīng)過優(yōu)化，多粘類芽孢桿菌的細(xì)胞生物量可達(dá)5.3×109cfu/mL，比優(yōu)化前(3.17×108cfu/mL)提高了15.72倍。本發(fā)明通過對(duì)培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件的研究，為多粘類芽孢桿菌的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)以及進(jìn)一步開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12R1/12GK102559564SQ201210056279
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月6日
發(fā)明者嚴(yán)芬, 葉秀云, 李仁寬, 楊捷, 林娟, 陳曉紅 申請(qǐng)人:福州大學(xué)