專(zhuān)利名稱(chēng)：白皮松父系鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因檢測(cè)方法，具體而言涉及白皮松父系鑒定方法。
背景技術(shù)：
植物的種源鑒定、父本分析是物種保存、種子園設(shè)計(jì)的重要內(nèi)容，旨在通過(guò)解讀種子或個(gè)體的可能父本來(lái)源，判斷產(chǎn)地以及花粉或種子散播方式?，F(xiàn)在常規(guī)方法是利用大量的分子標(biāo)記組合分析植物個(gè)體的基因型，推斷子代可能的父本。在松科植物中主要采用葉綠體微衛(wèi)星標(biāo)記。一般認(rèn)為葉綠體微衛(wèi) 星具有父系遺傳、變異率高的特點(diǎn)，能夠通過(guò)數(shù)個(gè)甚至十余個(gè)基因的組合鑒定個(gè)體的遺傳特征，排除非親本個(gè)體。白皮松(Pinus bungeana)是我國(guó)特產(chǎn)的珍稀瀕危植物，因其樹(shù)形優(yōu)美而成為園林綠化的優(yōu)良品種。為保存白皮松種質(zhì)資源、合理規(guī)劃種子園、滿(mǎn)足親本識(shí)別的要求，高變異葉綠體基因片段的篩選成為當(dāng)務(wù)之急?，F(xiàn)有技術(shù)通常利用葉綠體微衛(wèi)星(cpSSR)高變異的特點(diǎn)，植物個(gè)體的DNA通過(guò)PCR擴(kuò)增多個(gè)cpSSR位點(diǎn)，然后把所有位點(diǎn)的基因組合在一起當(dāng)作一個(gè)基因型，再尋找與該基因型相一致的基因組合，結(jié)合產(chǎn)地植物群體特征，確定種質(zhì)來(lái)源與可能父本?？梢钥闯?，現(xiàn)有技術(shù)方案很大程度依賴(lài)與cpSSR變異的高低。cpSSR變異越高則父本識(shí)別效率越高，所需位點(diǎn)越少，成本越低。反之，則效率降低、成本增加。

發(fā)明內(nèi)容
然而我們通過(guò)對(duì)白皮松葉綠體微衛(wèi)星的研究表明，其變異率遠(yuǎn)較其它近緣種低，諸多微衛(wèi)星位點(diǎn)沒(méi)有變異，不能夠用于種質(zhì)鑒定與父系分析。因此，如何鑒別白皮松的父系需要采用其它方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的目的一方面是提供一種白皮松父系鑒定方法，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用如下技術(shù)方案本發(fā)明一方面涉及白皮松父系鑒定方法，包括如下步驟(I)提取待測(cè)白皮松樣品的DNA ；(2)使用引物Pb-F :5’ -TGGCATTATGGAITCTCC-3’，Pb-R 5，-AATTCTGCACAGCCTCGTC-3，對(duì) DNA 樣品進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與SEQ NO =Hl-HlO的序列進(jìn)行比對(duì)以鑒別其父系。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的鑒定方法包括如下步驟(I)用CTAB法提取白皮松DNA ；(2)合成引物Pb-F :5’ -TGGCATTATGGAITCTCC-3’，Pb-R 5’ -AATTCTGCACAGCCTCGTC-3’(3)采用步驟2中的引物對(duì)DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增PCR 的反應(yīng)體系(25ii L) :PCR-Mix 13. 5 y L ;正反向引物各 0. I y M ;DNA 模板50ng，ddH20不足體積。PCR在MJ Research Inc.生產(chǎn)的PTC-200型熱循環(huán)儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性4min ;94°C變性45sec ；50. 3°C退火45sec ;72°C延伸Imin ；36個(gè)循環(huán)，72°C延伸 5min ;10°C保存；(4)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與Hl-HlO的序列進(jìn)行比對(duì)以鑒別其父系。本發(fā)明另一方面還涉及SEQ NO =Hl-HlO或其互補(bǔ)序列在白皮松父系鑒定中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)對(duì)珍稀瀕危植物白皮松葉綠體基因檢測(cè)，能夠利用單一基因?qū)Σ煌乩矸N源的進(jìn)行有效鑒定，大幅度提聞了白皮松父本的檢測(cè)效率，彌補(bǔ)了現(xiàn)有葉綠體基因標(biāo)記變異率低，需要的標(biāo)記量大的不足。


圖I :不同產(chǎn)地白皮松葉綠體基因類(lèi)型及頻率。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :采集源于5個(gè)不同產(chǎn)地的15個(gè)皮松樣本，通過(guò)如下步驟對(duì)其父系進(jìn)行鑒定(I)用CTAB法提取白皮松DNA ；(2)合成引物Pb-F :5’ -TGGCATTATGGAITCTCC-3’，Pb-R 5’ -AATTCTGCACAGCCTCGTC-3’(3)采用步驟2中的引物對(duì)DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增PCR 的反應(yīng)體系(25ii L) :PCR_Mix 13. 5 ii L ;正反向引物各 0. I ii M ;DNA 模板50ng，ddH20不足體積。PCR在MJ Research Inc.生產(chǎn)的PTC-200型熱循環(huán)儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性4min ;94°C變性45sec ；50. 3°C退火45sec ;72°C延伸Imin ；36個(gè)循環(huán)，72°C延伸 5min ;10°C保存；(4)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與Hl-HlO的序列進(jìn)行比對(duì)以鑒別其父系。鑒定結(jié)果鑒定結(jié)果如圖I所示，例如四川白皮松固定特殊的H2基因，秦嶺南坡種源以H5為主，黃土高原群體以Hl和H3的組合為主，該標(biāo)記的高變異性表明其可用于個(gè)體識(shí)別與父系鑒定。當(dāng)理解的是，以上具體實(shí)施方式
僅僅是舉例性說(shuō)明，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.白皮松父系鑒定方法，包括如下步驟 (1)提取待測(cè)白皮松樣品的DNA； (2)使用引物Pb-F:5，-TGGCATTATGGATTCTCC-3，，Pb-R 5’ -AATTCTGCACAGCCTCGTC-3’ 對(duì) DNA 樣品進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增； (3)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與SEQNO =Hl-HlO的序列進(jìn)行比對(duì)以鑒別其父系。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的白皮松父系鑒定方法，所述的鑒定方法包 括如下步驟 (1)用CTAB法提取白皮松DNA； (2)合成引物Pb-F:5’ -TGGCATTATGGATTCTCC-3’，Pb-R 5’ -AATTCTGCACAGCCTCGTC-3’ (3)采用步驟2中的引物對(duì)DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增 PCR的反應(yīng)體系(25 μ L) =PCR-Mix 13. 5 μ L ;正反向引物各O. I μ M ;DNA模板50ng，ddH20不足體積。PCR在MJ Research Inc.生產(chǎn)的PTC-200型熱循環(huán)儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 45sec ；50. 3°C退火 45sec ;72°C延伸 Imin ；36 個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min ;10°C保存； (4)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與Hl-HlO的序列進(jìn)行比對(duì)以鑒別其父系。
3.基因序列SEQNO =Hl-HlO或其互補(bǔ)序列在白皮松父系鑒定中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了白皮松父系鑒定方法，包括如下步驟(1)提取待測(cè)白皮松樣品的DNA；(2)使用引物Pb-F5’-TGGCATTATGGATTCTCC-3’，Pb-R5’-AATTCTGCACAGCCTCGTC-3’對(duì)DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與SEQ NOH1-H10的序列進(jìn)行比對(duì)以鑒別其父系。本發(fā)明通過(guò)對(duì)珍稀瀕危植物白皮松葉綠體基因檢測(cè)，能夠利用單一基因?qū)Σ煌乩矸N源的進(jìn)行有效鑒定，大幅度提高了白皮松父本的檢測(cè)效率，彌補(bǔ)了現(xiàn)有葉綠體基因標(biāo)記變異率低，需要的標(biāo)記量大的不足。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102676649SQ201210057230
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年2月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月29日
發(fā)明者劉占林, 劉宇佳, 楊佳 申請(qǐng)人:西北大學(xué)