專利名稱：一種診斷急性髓細(xì)胞白血病的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，具體涉及ー種實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)人糖基轉(zhuǎn)移酶，Lc3合成酶3 3Gn-T5的試劑盒，是ー種通過逆轉(zhuǎn)錄(RT)mRNA樣品得到cDNA，再結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，精確定量檢測(cè)標(biāo)本中Lc3合成酶P 3Gn-T5的mRNA表達(dá)量的試劑盒。
背景技術(shù)：
腫瘤(Tumor)是機(jī)體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個(gè)細(xì)胞在基因水平上失去對(duì)其生長(zhǎng)的正常調(diào)控，導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的新生物。一般認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞 是單克隆性的，即ー個(gè)腫瘤中的所有瘤細(xì)胞均是ー個(gè)突變的細(xì)胞的后代。一般將腫瘤分為良性和惡性兩大類。所有的惡性腫瘤總稱為癌癥(cancer)。目前腫瘤的發(fā)生率與死亡率居高不下，并且有愈演愈烈的趨勢(shì)，已經(jīng)成為威脅我國及世界人民健康的一大類疾病。對(duì)于腫瘤的治療一直是大家研究的熱點(diǎn)，但是就目前的情況來看，惡性腫瘤的治愈還有很大的難度，然而如果能對(duì)腫瘤患者進(jìn)行早期的診斷，對(duì)進(jìn)一歩制定治療方案有非常重要的意義，是提高腫瘤治愈率的重要途徑之一。而腫瘤的早期診斷有賴于腫瘤特異性標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)，腫瘤特異性標(biāo)記是目前腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，腫瘤相關(guān)的蛋白有80%是糖蛋白，多種糖脂亦與腫瘤密切相關(guān)，所以控制糖脂的糖基轉(zhuǎn)移酶也受到關(guān)注。急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是ー種異質(zhì)性髓細(xì)胞腫瘤，也稱急性非淋巴細(xì)胞性白血病，常進(jìn)展迅速，其特點(diǎn)是由造血干細(xì)胞惡變而形成的原始細(xì)胞克隆取代了正常骨髄造血。由于白血病細(xì)胞代替了正常血細(xì)胞，它們不具備正常血細(xì)胞的功能，由此導(dǎo)致貧血，血小板和粒細(xì)胞減少而引發(fā)一系列并發(fā)癥。若不經(jīng)過治療，存活期一般不超過半年。有的病例從診斷到死亡，甚至不過一周，死亡的主要原因是出血和感染。目前標(biāo)準(zhǔn)化療可以獲得約70 80%的完全緩解(Complete Remission，CR)率，但大部分CR后的患者終將復(fù)發(fā)，甚至一部分患者難以達(dá)到CR而成為難治性白血病，治療無效而死亡。分子生物學(xué)從分子水平研究生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能從而闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)，近年來，隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展及其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)在臨床組織樣本中進(jìn)行腫瘤特異性標(biāo)記的檢測(cè)已成為可能并被嘗試。RT-PCR比傳統(tǒng)的檢測(cè)方法具有較高的靈敏度及特異性，能夠在復(fù)雜的生物樣本中檢測(cè)到極其微量的腫瘤特異性標(biāo)記物，對(duì)于腫瘤的早期診斷以及長(zhǎng)期的預(yù)后具有十分重要的價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種診斷急性髓細(xì)胞白血病的試劑盒，提高檢測(cè)的特異性、靈敏度和準(zhǔn)確率。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種診斷急性髓細(xì)胞白血病的試劑盒，包括逆轉(zhuǎn)錄體系和PCR擴(kuò)增體系；所述逆轉(zhuǎn)錄體系包括T重復(fù)寡核苷酸OlogodT、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs ;所述PCR擴(kuò)增體系包括SYBRGreen聚合酶鏈反應(yīng)體系、引物對(duì)；
其中，所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液含有焦炭酸ニこ酯處理的水、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液；
所述SYBR Green聚合酶鏈反應(yīng)體系含有PCR緩沖液、模板cDNA、dNTPs、SYBR Green熒光染料；所述模板cDNA包括正常人骨髓樣本cDNA和急性髓細(xì)胞白血病患者骨髓樣本cDNA，其中，正常人骨髓樣本cDNA作為陰性對(duì)照，急性髓細(xì)胞白血病患者骨髓樣本cDNA作為陽性對(duì)照；
所述引物對(duì)為可擴(kuò)增人Lc3合成酶P 3Gn-T5和人P -actin的引物對(duì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)引物設(shè)計(jì)的常規(guī)技術(shù)設(shè)計(jì)；優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述引物對(duì)由上游引物和下游引物組成，其中上游引物具有SEQ ID No. I所示序列5' -ttttggattggtcgtgttcat-3';下游引物具有 SEQ ID No. 2 所示序列5' -cggctgtgtagtcagggtaag-31 ;人 P-actin 上游 引物具有 SEQ ID No. 3 所示序列5' -CACCATTGGCAATGAGCGGTTCC-3';下游引物具有 SEQID No. 4 所示序列5' -GTAGTTTCGTGGATGCCACAGG-3'。上述技術(shù)方案中，所述焦炭酸ニこ酯處理的水的制備方法為將焦炭酸ニこ酯原液與超純水按照體積I : 1000稀釋，攪拌12 24小時(shí)，取該混合均勻的溶液進(jìn)行高壓濕熱滅菌即制得焦炭酸ニこ酯處理的水。上述技術(shù)方案中，所述M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液包括250mM PH8. 3的Tris-HCl，375mM 的 KCl，15mM 的 MgCl2，50mM 的 DTT。上述技術(shù)方案中，所述RNA酶抑制劑可選用本領(lǐng)域常用的RNA酶抑制劑，優(yōu)選為E. coli表達(dá)的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制RNase的重組蛋白酶。上述技術(shù)方案中，所述PCR緩沖液為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)，優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述PCR緩沖液包括25mM的KCl，終濃度2. 5mM的MgCl2, 200mM的(NH4)2S04。上述試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復(fù)凍融。上述試劑盒的使用方法包括以下步驟
(1)逆轉(zhuǎn)錄配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，每20y L的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括10 y L的待測(cè)樣品的RNAUiiL的Ologo dT共浴70°C 10分鐘，取出立即置于冰上2分鐘，再加入2iiL的dNTPs、liiL的RNA酶抑制劑、5 ii L的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液及Iii L的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，共浴420C 60分鐘，然后700C 10分鐘，得到cDNA，4°C保存；
(2)在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)配置PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，每25yL的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括SYBR Green聚合酶鏈反應(yīng)體系12. 5 u L,上下游引物各0. 25 u L，cDNA2 u L，DEPC水10 ii L ;反應(yīng)條件為50°C 2分鐘，95°C 10分鐘，95°C 15秒、60°C 60秒共40個(gè)循環(huán)；得到待測(cè)樣品的熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果；
(3)采用步驟(2)的方法對(duì)試劑盒中的模板cDNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，得到陽性對(duì)照和陰性對(duì)照的熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果；然后分析上述待測(cè)樣品、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照的熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果的Ct值(P 3Gn-T5)和Ct值(P -actin)，通過公式^ 3Gn_T5的mRNA相對(duì)水平=計(jì)算得到待測(cè)樣品、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照的P 3Gn-T5的mRNA相對(duì)水平，以待測(cè)樣品的P 3Gn-T5的mRNA相對(duì)水平值和陽性對(duì)照、陰性對(duì)照的P 3Gn_T5的mRNA相對(duì)水平相比，即可判斷待測(cè)樣品是否取自AML患者。
上述技術(shù)方案中，DEPC水溶液是ー種g在通過焦碳酸ニこ酯(DEPC)處理，以徹底清除RNA酶的無離子水溶液；?；瘎━摔郴固妓狨?diethylprocarbonate,DEPC),是RNA酶的化學(xué)修飾劑，和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性，還可滅活其它各種蛋白質(zhì)。本發(fā)明的主要原理是Lc3合成酶P 3Gn-T5是控制鞘糖脂合成的關(guān)鍵的糖基轉(zhuǎn)移酶，是與AML相關(guān)的特異性較高的腫瘤特異性標(biāo)記。在AML患者骨髓組織中檢測(cè)出Lc3合成酶P 3Gn-T5的高表達(dá)，可以對(duì)AML的診斷及治療提供有力證據(jù)。通過RT-PCR進(jìn)行微量腫瘤特異性標(biāo)記的檢測(cè)，可以較準(zhǔn)確地進(jìn)行定量，相比傳統(tǒng)方法具有較高的靈敏度。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)
I.本發(fā)明建立了利用SYBR Green技術(shù)檢測(cè)Lc3合成酶P 3Gn_T5的表達(dá)的方法，并提供一種可以方便準(zhǔn)確靈敏地診斷急性髓細(xì)胞白血病的試劑盒。2.由于本方法采用了 PCR擴(kuò)增技術(shù)，使得表達(dá)的檢測(cè)敏感度大大提高，而且由于熒光染料的應(yīng)用，使其特異性亦大大提高，降低了常規(guī)PCR擴(kuò)增的假陽性率，使得檢測(cè)人員可以在極少的標(biāo)本中獲得足夠的信息。3.本發(fā)明中設(shè)計(jì)的引物以及檢測(cè)結(jié)果，可以為熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的開發(fā)提供可靠的依據(jù)。


圖I為實(shí)施例中正常人的骨髓樣本中提取RNA同樣經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增曲線； 圖2為實(shí)施例中正常人骨髓樣本與AML病人骨髓樣本中Lc3合成酶P 3Gn-T5表達(dá)對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步描述
實(shí)施例一診斷人AML發(fā)生的熒光RT-PCR方法
(I)材料
Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，Ologo dT、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs、SYBR Green聚合酶鏈反應(yīng)體系、PCR緩沖液均購自美國Fermentas公司，ABI 7500熒光定量系統(tǒng)為美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品。(2)引物設(shè)計(jì)與合成
以全長(zhǎng)cDNA序列為模板，使用Prime5軟件分析引物位點(diǎn)，并根據(jù)同時(shí)考慮基因組DNA序列情況，從中選擇最佳組合。檢測(cè)人Lc3合成酶@ 3Gn-T5用上游引物序列為
5' -ttttggattggtcgtgttcat-3 ';檢測(cè)人 Lc3 合成酶 P 3Gn_T5 用下游引物序列為5 ' -cggctgtgtagtcagggtaag-3 1 ;檢測(cè)人P-actin用上游引物序列為 5 ' -CACCATTGGCAATGAGCGGTTCC-3 ';檢測(cè)人 P-actin 用下游引物序列為5' -GTAGTTTCGTGGATGCCACAGG-3'，均由上海生エ公司合成。(3)標(biāo)本檢測(cè)
從12例AML患者骨髓樣本和6例正常人骨髓樣本提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄總體積20 u L，、其中IOuLRNA與IuL Ologo dT共浴70°C 10分鐘，取出馬上置于冰上2分鐘，再加入2 u LdNTPsUuL RNA酶抑制劑、5uL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液及IuL M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，共浴42 °C 60分鐘，然后70°C 10分鐘，4°C保存。在熒光定量PCR儀上進(jìn)行，總體積25 u L，其中SYBR Green聚合酶鏈反應(yīng)體系12. 5 u L，上下游引物各0. 25 u L，cDNA2 u L，DEPC水10 uし反應(yīng)條件50°C 2分鐘，95。。10分鐘，95°C 15秒、60°C 60秒共40個(gè)循環(huán)。進(jìn)行Real time PCR實(shí)驗(yàn)，得到圖1，從圖I可
知實(shí)驗(yàn)可靠，得到合格的擴(kuò)增曲線。通過ABI 7500 System軟件導(dǎo)出Ct值，得到表1， 從表I可知P 3Gn_T5和^ -actin的Ct值，表中No. 1-6是正常對(duì)照，No. 7 18是AML患者。表I. P 3Gn_T5 和 & -actin 的 Ct 值
No. Jct 值(P 3Gn-T5) ICt 值(g -actin)
122.3114.81
222.9414. 14
322. 6014. 58
420. 9015. 32
521.1913.28
630. 0021. 25
728. 2020. 72
832. 6230. 27
927. 7023. 32
1026. 2022.05
1133.1425. 47
1228. 8727. 14
1328. 1824. 17
1427. 1024. 63
1534.1626. 75
1630. 1928. 15
1732.1927. 00
18[26. 04123. 15
將正常人和AML患者的Ct值結(jié)果進(jìn)行分析，通過公式P 3Gn-T5的mRNA相對(duì)水平=，得到表2，表中No. 1-6是正常對(duì)照(平均值為0. 0065)，No. 7 18是AML患者(平均值為0. 1055)
表2. Lc3合成酶P 3Gn-T5的mRNA相對(duì)水平
No.丨g3Gn-T5 INo. I》3Gn-T5 [No. [g3Gn-T5
10.0055 7 0.0056 13 0.0622
20.0022 8 0. 1953 14 0. 1801
30.0039 9 0.0481 15 0.0059
40.0209 10 0.0561 16 0.2426
50.0042 11 0.0049 17 0.0275
6jo. 0023 112 10. 3022 [18 Jp. 1353
從表2可知急性髓細(xì)胞白血病患者和正常對(duì)照中Lc3合成酶P 3Gn-T5的mRNA相對(duì)水平。對(duì)比正常人骨髓樣本與AML病人骨髓樣本中Lc3合成酶P 3Gn_T5表達(dá)結(jié)果，得到圖2，從圖2可知急性髓細(xì)胞白血病患者骨髓中Lc3合成酶P 3Gn-T5的mRNA水平高于正常對(duì)照。
權(quán)利要求
1.一種診斷急性髓細(xì)胞白血病的試劑盒，包括逆轉(zhuǎn)錄體系和PCR擴(kuò)增體系；其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄體系包括重復(fù)T寡核苷酸Ologo dT、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs ;所述PCR擴(kuò)增體系包括SYBR Green聚合酶鏈反應(yīng)體系、引物對(duì)； 其中，所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液含有焦炭酸ニこ酯處理的水、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液；所述SYBR Green聚合酶鏈反應(yīng)體系含有PCR緩沖液、模板cDNA、dNTPs、SYBR Green熒光染料；所述引物對(duì)為可擴(kuò)增人Lc3合成酶P 3Gn-T5和人P -actin的引物對(duì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述診斷急性髓細(xì)胞白血病的試劑盒，其特征在于，所述引物對(duì)由上游引物和下游引物組成，其中人Lc3合成酶P3Gn-T5上游引物具有SEQ IDNo. I 所示序列5' -ttttggattggtcgtgttcat-3 1 ;下游引物具有 SEQ ID No. 2 所示序列5 1 -cggctgtgtagtcagggtaag-3 1 ;人 P -actin 上游引物具有 SEQ ID No. 3 所示序列5 ' -CACCATTGGCAATGAGCGGTTCC-3 ';下游引物具有 SEQ ID No. 4 所示序列5' -GTAGTTTCGTGGATGCCACAGG-3'。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述診斷急性髓細(xì)胞白血病的試劑盒，其特征在于，所述模板cDNA包括正常人骨髓樣本cDNA和急性髓細(xì)胞白血病患者骨髓樣本cDNA，其中，正常人骨髓樣本cDNA作為陰性對(duì)照，急性髓細(xì)胞白血病患者骨髓樣本cDNA作為陽性對(duì)照。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種診斷急性髓細(xì)胞白血病的試劑盒，包括逆轉(zhuǎn)錄體系和PCR擴(kuò)增體系；其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄體系包括重復(fù)T寡核苷酸OlogodT、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs；所述PCR擴(kuò)增體系包括SYBRGreen聚合酶鏈反應(yīng)體系、引物對(duì)；其中，所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液含有焦炭酸二乙酯處理的水、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液；所述SYBRGreen聚合酶鏈反應(yīng)體系含有PCR緩沖液、模板cDNA、dNTPs、SYBRGreen熒光染料；所述引物對(duì)為可擴(kuò)增人Lc3合成酶β3Gn-T5和人β-actin的引物對(duì)。本發(fā)明建立了利用SYBRGreen技術(shù)檢測(cè)Lc3合成酶β3Gn-T5的表達(dá)的方法，并提供一種可以方便準(zhǔn)確靈敏地診斷急性髓細(xì)胞白血病的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102643899SQ20121005845
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月7日
發(fā)明者李云森, 王征, 王艷萍 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)